Progenitore di derivazione Sistema Cultura Oligodendrocyte dal cervello umano fetale

Sommario

Primaria, umani fetali di derivazione cerebrale, le cellule progenitrici multipotenti proliferano In vitro Pur mantenendo la capacità di differenziarsi in neuroni e astrociti. Questo lavoro dimostra che progenitori neurali possono essere indotte a differenziarsi attraverso le fasi della linea oligodendrocitario dal condizionamento con fattori di crescita selezionati.

Abstract

La differenziazione dei progenitori neurali umane in tipi di cellule neuronali e gliali offre un modello da studiare e confrontare regolazione molecolare dello sviluppo neurale linea cellulare. Espansione in vitro di progenitori neurali da tessuto fetale CNS è stato ben caratterizzato. Nonostante l'identificazione e l'isolamento di progenitori gliali da umano adulto sub-corticale della sostanza bianca e lo sviluppo delle diverse condizioni di coltura per la differenziazione diretta di progenitori neurali fetali in oligodendrociti che producono mielina, l'acquisizione di sufficienti oligodendrociti umani per la sperimentazione in vitro rimane difficile. Differenziazione dei galactocerebroside ⁺ (GALC) e O4 ⁺ precursori degli oligodendrociti o cellule progenitrici (OPC) da cellule precursori neurali è stato segnalato con secondo cervello fetale trimestre. Tuttavia, queste cellule non proliferano in assenza di cellule di supporto tra astrociti e neuroni, e si perdono rapidamente nel tempo in cultura. Rimane la necessità di un sistema di coltura per produrre cellule della linea oligodendrocyte adatto per la sperimentazione in vitro.

Cultura di oligodendrociti primari umani potrebbe, per esempio, essere un modello utile per studiare la patogenesi di neurotropici agenti infettivi come il poliomavirus umano, JCV, che in vivo infetta le cellule. Queste cellule coltivate potrebbe anche fornire modelli di altre malattie demielinizzanti del sistema nervoso centrale (CNS). Primaria, fetale umano derivato dal cervello, le cellule progenitrici multipotenti neurali proliferano in vitro, pur mantenendo la capacità di differenziarsi in neuroni (cellule progenitrici derivate da neuroni, PDN) e astrociti (cellule progenitrici derivate da astrociti, PDA) Questo studio mostra che progenitori neurali può essere indotta a differenziare attraverso molte delle fasi di sviluppo lignaggio oligodendrocitario (progenitrici derivate oligodendrociti, DOP). Noi cellule progenitrici neurali in coltura DMEM-F12 senza siero dei media suptegrato con fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), il fattore di crescita derivato piastrine (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), fattore neurotrofico 3 (NT-3), N-2 e triiodotironina (T3). Le cellule coltivate sono diversi passaggi in cellule 2.5e6 per fiaschi 75 centimetri circa ogni sette giorni. Utilizzando tali condizioni, la maggior parte delle cellule in coltura mantenere una morfologia caratterizzata da alcuni processi e marcatori espresse del pre-cellule oligodendrociti, come A2B5 e O-4. Quando rimuoviamo i quattro fattori di crescita (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) e aggiungere mezzo condizionato da PDN, le cellule iniziano ad acquisire più processi e indicatori esprimono specifici di differenziazione degli oligodendrociti, come GALC e la mielina proteina basica (MBP). Abbiamo eseguito la caratterizzazione fenotipica in citometria a flusso multicolore di identificare indicatori unici di oligodendrociti.

Protocollo

Nota: per la coltura di routine di progenitrici neurali e cellule della linea oligodendrocitario, incubazione avviene a 37 ° C in un umidificata al 5% di CO ₂ nell'atmosfera. Ogni 2 giorni, il mezzo viene sostituito con 50 a 100% di mezzo fresco se la cultura è 40-70% confluenti. Al momento della confluenza vicino, le colture sono diversi passaggi a 2-2.5e6/T75 pallone di solito su una pianificazione settimanale.

1. Preparazione del Flask Coated

1. Per preparare fiasche rivestite diluire 5 mg di poli-D-lisina (PDL) in 100 ml di acqua deionizzata (DI-acqua), poi cappotto fiasche T75 con 50 ug / ml di PDL a temperatura ambiente (RT) al buio. Dopo 1 ½ ora, aspirare il Pdl e risciacquare i palloni una volta con acqua demineralizzata. Lasciate le fiasche secco prima della semina delle cellule (Tabella 1).

2. Avvio di differenziazione delle cellule progenitrici neurali in oligodendrociti progenitrici derivate (DOP)

Il protocollo èOlate cellule progenitrici del SNC è descritto in una precedente pubblicazione e non è parte di questo protocollo ^1. Le cellule progenitrici del sistema nervoso centrale sono stati isolati dal telencefalo di un 8 settimane di gestazione il cervello del feto, ottenuto in accordo con le linee guida NIH.

1. Crescere multipotenziale popolazione di cellule progenitrici neurali sul PDL fiasche rivestite in media Neurobasal supplementato con 25 ng / ml di bFGF e 20 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF) (Figura 1A). Non usarli se maggiore di passaggio 11 (p11).
2. Iniziare a differenziare le cellule progenitrici neurali, quando la cultura è di circa il 70% confluenti.
3. Rendere terreno completo differenziazione oligodendrociti utilizzando DMEM privo di siero / PROSCIUTTI F12 medie 01:01 supplementato con albumina di siero bovino, L-glutammina, gentamicina, componenti N2, T3, Shh, NT-3, bFGF e PDGF-AA (Tabella 1) . Questo terreno sarà definita come supporto oligo con fattori di crescita (oligo media + GF).
4. Rimuovere Progensupporto Itor dai fiaschi, lavare le cellule una volta con tampone fosfato salino (PBS), quindi aggiungere mezzo di oligo + GF (dettagli descritti al punto 2.3) per avviare la differenziazione degli oligodendrociti. Solo le cellule impegnate nella stirpe oligodendrocitario crescerà (Figura 1B). Cultura le cellule in questo mezzo per 3 settimane.
5. Ogni settimana, quando le cellule sono a 90-95% di confluenza, passaggio usando tripsina (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml per una beuta T75). Trasferire il mezzo intero dalle cellule da diversi passaggi in una provetta da 50 ml; questo mezzo condizionato viene utilizzata per estinguere la tripsina. Assicurarsi di non asciugare le cellule. Quindi aggiungere tripsina.
6. Incubare le cellule in tripsina per 5 min a RT, delicatamente la beuta volte per aiutare distacco cellulare.
7. Quench la tripsina con l'aggiunta di 4-5 mL di terreno condizionato al pallone con le cellule distaccate.
8. Trasferire il mezzo e le cellule allo stesso tubo da 50 ml. Centrifugare il mezzo e le cellule a 1.200 giri al minuto (~300 xg) per 5 min a RT.
9. Aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare, con delicatezza ribaltare il tubo, e quindi aggiungere fresche medie oligo + GF. Delicatamente medie pipetta e cellule su e giù per fare una sospensione uniforme cella.
10. Contare le cellule, e 2.5e6 trasferimento in ogni nuovo PDL rivestita T75 pallone.

3. Fase finale nella differenziazione degli oligodendrociti

1. Dopo 3 settimane di coltura in oligo media + GF, quando le cellule sono a 70-80% di confluenza, avviare il processo finale di differenziazione (Figura 1C).
2. Preparare media nello stesso modo come il mezzo oligo + GF ma senza aggiungere il quattro GF: Shh, NT-3, bFGF e PDGF-AA. Questo mezzo senza il GF quattro saranno definita come supporto di oligo - GF.
3. Aspirare il mezzo oligo + GF dal pallone, sciacquare una volta con PBS e quindi aggiungere un volume totale di 16 ml di terreno, di cui ¾ (12 ml) è oligo medio - GF e ¼ (4 ml) è medio PDN condizionato, per 6-10 Giorni). L'uso di mezzo condizionato da PDN non è critico per il processo di differenziazione o la sopravvivenza delle cellule. Abbiamo infatti osservato che solo il contatto diretto con le cellule di PDO PDN in esperimenti di co-coltura ha avuto un effetto sulla durata della sopravvivenza DOP. Il tempo di sopravvivenza medio di oligo - GF poteva essere prolungata per due o tre settimane se le cellule DOP sono co-coltura con cellule PDN. Il protocollo di differenziare cellule progenitrici neurali in PDN è descritto in una precedente pubblicazione e non è parte di questo protocollo ^1. La crescita fattore di ritiro dai risultati medi di coltura della cultura progressivamente differenziate di cellule con processi multipli (Figura 1D).

4. Citometria a Flusso del test

Il saggio citofluorimetria confronta l'acquisizione di marcatori oligodendrociti durante il processo di differenziazione in rapporto con quelli della popolazione parentale.

1. Usa pro neuralegenitors il controllo. Seme cellule DOP a 2.5x10 ⁶ celle in due palloni T75 rivestite con poli-D-lisina in oligo medie + GF.
2. Una settimana dopo, sostituire media con fresca media oligo + GF in fusti come una cultura di controllo per la vitalità delle cellule, mentre altri contenitori avuto oligo medio - GF.
3. Dissociare cellule DOP in entrambi i mezzi utilizzare 20 U / ml di papaina e non tripsina. Questo perché papaina ha un effetto più delicato sulle cellule durante la dissociazione preservare la morfologia cellulare.
4. Aggiungere 5 ml di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) in una fiala papaina. Posizionare il flacone a 37 ° C per 10 minuti o fino a quando la papaina è completamente sciolto e la soluzione appare chiara. Questa è la soluzione di papaina utilizzata per dissociare le cellule.
5. Aggiungere 0,5 ml di EBSS ad un Deoxyribonuclease I (DNasi) flaconcino (Tabella 1). Mescolare delicatamente. Aggiungere 0,25 ml di questa soluzione nel flacone di papaina disciolto. Questo preparato contiene una concentrazione finale di circa 20 U / ml di papaina e 00,005% DNasi.
6. Soluzione luogo papaina (come descritto sopra) sulle cellule e incubare a 37 ° C per 15-30 min, monitorare il distacco delle cellule usando un microscopio. Interrompere la reazione con 5 ml di terreno con o senza GF e centrifugare a 1200 rpm per 7 min.
7. Trasferire pellet cellulari da entrambi flaconi in due differenti 5 ml provette di polipropilene e lavarli con normale media fisiologica (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, Hepes 10 mM e 10 mM di glucosio) supplementato con 1 mg / ml albumina di siero bovino (BSA NPM +).
8. Eseguire superficie immunocolorazione a 4 ° C per 20 minuti usando anticorpi primari specifici e adeguatamente titolata per A2B5, O4, GALC (Tabella 2).
9. Lavare le cellule con NPM + BSA a 4 ° C per 5 minuti e incubare con specifici anticorpi secondari a 4 ° C per 20 min (Tabella 2).
10. Per macchia antigeni intracellulari tra cui nestina, proteina acida fibrillare gliale (GFAP), classe III e essereta,-tubulina, e la proteina basica della mielina (MBP) (Tabella 2), fissare le cellule in 2% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a RT e permeabilize freddo con etanolo al 70% per 15 min a -20 ° C.
11. Lavare le cellule con PBS 1x e incubare con specifici anticorpi secondari (Tabella 2).
12. Per discriminare tra cellule intatte e detriti subcellulare durante l'analisi di citometria a flusso, colora le cellule con 4,6-Diamidino-2-phenyllindole, cloridrato (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY).
13. In ottimizzare il protocollo di cui sopra, abbiamo eseguito tutti gli esperimenti di controllo necessarie per confermare la specificità di ogni immunoreagenti. Brevemente, per gli anticorpi marcati direttamente, il controllo appropriato negativo era un anticorpo direttamente coniugato della stessa classe isotipo di immunoglobuline (o sottoclasse) e coniugato con fluorocromo come anticorpo primario (cioè il controllo di isotipo). Per immunostaining indiretto di anticorpi primari, l'appropriato controllo negativo wcome anticorpo secondario coniugato con il fluorocromo di interesse che specificamente mirato alla classe di immunoglobuline (o sottoclasse) del ospite in cui è stato generato l'anticorpo primario. Quando gli anticorpi primari da più host (topo, coniglio, pollo) sono stati utilizzati insieme, abbiamo utilizzato l'anticorpo secondario di mira l'anticorpo primario di ogni host e ogni anticorpo secondario utilizzato è stato in genere cross-adsorbito contro le immunoglobuline dagli altri host per ridurre al minimo cross- ospitare immunoreattività. I controlli positivi inclusi immunostaining diretta o indiretta di preparazioni cellulari note per esprimere gli antigeni di interesse utilizzando sia immunoreazioni diretto o indiretto con gli anticorpi primari specifici per questi antigeni. I metodi di ottimizzazione sopra sono state eseguite una volta per ogni tipo di immunocolorazione esperimenti. Immunoreazioni di controllo ha evidenziato alcuna significativa cross-epitopo immunoreattività tra gli anticorpi primari e secondari. Citometria di flusso è stata eseguita su uniformementesospesi cellule contrassegnati in modo fluorescente utilizzando una cella FACVantage SE sorter (BD Biosciences, San Jose, CA) dotato di tre laser, che forniscono lunghezze d'onda di eccitazione 488 nm sintonizzate, 647 nm, e un ampio UV (351-364 nm) (Figura 2) .

5. Test di immunofluorescenza

Nota: Per gli esperimenti di immunofluorescenza, DOP sono placcati in oligo media + GF o oligo medio - GF a 2.5e5 in piastre da 6 pozzetti rivestiti con PDL. Le cellule vengono fissate in 2% PFA in vari momenti dopo il prelievo di fattori di crescita. L'anticorpo macchia viene eseguita su piastre da 6 pozzetti di plastica anziché coprioggetto.

1. Rimuovere il supporto e aggiungere il 2% PFA. Incubare per 10 minuti a RT. Eliminare PFA. Lavare le cellule per 3 volte con PBS, 5 min ciascuna volta. Fare attenzione a non asciugare le cellule.
2. Permeabilize cellule per marcatori intracellulari mediante soluzione di Triton 0,25% in PBS per 10 minuti a RT.
3. Per prevenire il legame non specifico, cellule blocco fo 10 min con HHG (1 mM tampone HEPES, 2% siero di cavallo, e siero di capra 10% in soluzione salina bilanciata di Hanks '). Diluire specifici anticorpi primari (Tabella 2) per una predeterminata concentrazione HHG. Posizionare anticorpi diluiti su cellule. Incubare per 1 ora a RT l'agitatore o a 4 ° C per una notte.
4. Lavare le cellule per 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta. Diluire appropriati anticorpi secondari (Tabella 2) accoppiato con un fluorocromo ad una predeterminata concentrazione HHG. Mettere la miscela di anticorpi secondari diluiti su cellule. Incubare per 1 ora a RT su un agitatore nel buio.
5. Lavare le cellule per 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta.
6. Per evitare la fotodecolorazione aggiungere 10 ml di prolungare oro con DAPI per le cellule e mettere un coprioggetto di vetro su di essi. Visualizzare le cellule marcate usando un microscopio a fluorescenza Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (Figura 3).

Risultati

E 'molto importante per avviare il processo di differenziazione da un 70% -80% coltura confluente di cellule progenitrici neurali (Figura 1A). Molte cellule si estinguerà dopo aver cambiato il mezzo di coltura da capostipite a medio oligo poiché include fattori di crescita specifici. Questo indica che la crescita di cellule progenitrici neurali non impegnati ad un fenotipo oligodendrocitario non sarà supportato dal nuovo mezzo (Figura 1B). Incubazione in mezzo oligo + GF per una set...

Discussione

Questo protocollo descrive come oligodendrociti fetali derivare da cellule primarie umane progenitrici neurali e caratterizzare il loro fenotipo utilizzando sia citometria di flusso e colorazione di immunofluorescenza. L'espansione e la crescita dei progenitori neurali fetali da CNS è stata molto ben descritta ^1-4. Tuttavia, ottenere sufficienti oligodendrociti umani per la sperimentazione in vitro resta difficile, anche se è possibile identificare e isolare precursori gliali da materiale umano a...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Concentrazione finale
DME / PROSCIUTTI F12 01:01	Omega Scientist	DM-251	1X
Albumina bovina	Sigma	A9418	1%
Gentamicina	Qualità Biologicals	120-098-031	50 ug / ml
L-Glutammina	Qualità Biologicals	118-084-061	2 mM
T3	Sigma	T2877	3 Nm
N2 Componenti	Gibco BRL	17502	1:100
NT-3	Peprotech Inc	450-03	2 ng / ml
Shh	R & D System	1314-SH/CF	2 ng / ml
bFGF	Peprotech Inc	100-18B	20 ng / ml
PDGF-AA	Peprotech Inc	100-13A	10 ng / ml
PDL	Sigma	P6407	50 ug / m
PFA	Scienze della microscopia elettronica	15712	2%
Tripsina	Qualità Biologicals	118-087-721
Papaina	Worthington	LK003178	20 U / ml
DNasi fiale	Worthington	LK003172	0,005%
EBSS	Worthington	LK003188
Prolong Oro conDAPI	Invitrogen	P36931
			Tabella 1. Reagenti.
			Primaria Abs (tutti a 1 pg / ml) Specie Isotype Fonte Secondaria Abs Citometria a Flusso A2B5-Biotina Mouse IgM Regalo J. Nielson Streptavidina PETR, Invitrogen, CA O4FITC Mouse IgM Regalo da J. Nielson A2B5 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA O4 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA GALC Mouse IgG 3 Millipore, MA gαm IgG 3-PE, Southern Biotech, AL MBP Pollo IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA Nestin Mouse IgG 1 Messam et al. 2000 28 gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA GFAP Coniglio IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA βIII tubulina Mouse IgG 2 Covance, CA gαm IgG 2 a-PETR, Invitrogen, CA Immunocitochimica βIII tubulina (1:1,500) Mouse IgG 2a Covance, CA gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) GFAP (1:1,000) Coniglio IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) MBP (1:50) Pollo IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) O4 (1:100) Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) GALC (1:10) Coniglio IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) Anticorpi Tabella 2 (Abs) utilizzati per la citometria a flusso e saggi di immunocitochimica coniugati per l'anticorpo: PE, ficoeritrina, PETR, ficoeritrina Texas Red, AMCA, ammino-metil-cumarina-acetato, Cy, cianinico, FITC, isotiocianato di fluorescina Ig:.. Immunoglobuline. . AF: Alexa Fluor; gαm: capra anti-topo; gαrb: capra anti-coniglio; dαck: asino anti-pollo.