Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Sommario

Descriviamo un metodo di analisi sensore elettrochimico per la rilevazione rapida di batteri e di identificazione. Il saggio comporta una serie di sensori funzionalizzato con DNA oligonucleotide sonde di cattura per RNA ribosomiale (rRNA) sequenze specie-specifici. Sandwich ibridazione del target rRNA con la sonda di cattura e di una perossidasi-coniugati DNA sonda rivelatore oligonucleotide rafano produce una corrente amperometrico misurabile.

Abstract

Sensori elettrochimici sono ampiamente utilizzati per la misurazione rapida e accurata del glucosio nel sangue e possono essere adattati per il rilevamento di una grande varietà di analiti. Sensori elettrochimici operano trasducendo un evento di riconoscimento biologico in un segnale elettrico utile. Trasduzione del segnale avviene accoppiando l'attività di un enzima redox a un elettrodo amperometrico. Sensore specificità è o una caratteristica inerente l'enzima, glucosio ossidasi nel caso di un sensore di glucosio, o un prodotto di legame tra l'enzima ed un anticorpo o sonda.

Qui, descriviamo un metodo di saggio sensore elettrochimico per rilevare direttamente e identificare i batteri. In ogni caso, le sonde descritte qui sono oligonucleotidi di DNA. Questo metodo si basa sul panino ibridazione di catturare ed identificare sonde con bersaglio RNA ribosomiale (rRNA). La sonda di cattura è ancorata alla superficie del sensore, mentre la sonda rivelatore è legata horseradish perossidasi (HRP). Quando un substrato quale 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) è aggiunto ad un elettrodo con complessi di cattura-target-rivelatore legati alla sua superficie, il substrato viene ossidato da HRP e ridotto l'elettrodo di lavoro. Questo redox ciclo sono presenti spola di elettroni da parte del substrato dall'elettrodo a HRP, producendo flusso di corrente nel dell'elettrodo.

Introduzione

Usando rRNA come molecola bersaglio per il rilevamento e l'identificazione batterica ha una serie di vantaggi. L'abbondanza di rRNA in cellule batteriche prevede un limite di sensibilità a partire da 250 batteri per ml senza la necessità di amplificazione del target ^1. RRNA batterico contiene uniche sequenze specie-specifici che sono accessibili a ibridazione con sonde di DNA. Di conseguenza, un array di sensori elettrochimici può essere utilizzato per identificare batteri sconosciuti, dove ogni sensore è funzionalizzato con un diverso sonda di cattura specie-specifica. Sensori di controlli positivi devono essere inclusi per un target oligonucleotide sintetico che "ponti" la cattura e sonde rivelatore per creare un segnale di calibrazione interno.

Sensori elettrochimici hanno una vasta gamma di applicazioni di ricerca di base e traslazionale. Per esempio, il saggio qui descritto è stato usato per misurare con precisione l'effetto di E. coli fase di crescita su RRNA e numero di copie pre-rRNA, che è di grande interesse per i ricercatori interessati alla fisiologia dei batteri ^2. La sensibilità del saggio sensore elettrochimico è determinato dal rapporto segnale-rumore. Una varietà di amplificazione del segnale e di metodi di riduzione del rumore sono stati esplorati. Troviamo che migliorando la chimica della superficie del sensore è fondamentale per ridurre il legame non specifico della sonda rivelatore e / o enzima HRP. In particolare, un monostrato misto di alkanedithiols e mercaptohexanol è stato trovato per ridurre sfondo coprendo la superficie dell'elettrodo più completamente mantenendo accessibilità della sonda di cattura per bersaglio ibridazione ^3. Questi trattamenti chimici superficiali sono particolarmente importanti per saggi con campioni biologici complessi.

Protocollo

1. Funzionalizzazione di Sensori elettrochimici

1. Preparare la sonda di cattura tiolato ad una concentrazione di 0,05 pM a 300 pM 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA e incubare al buio a temperatura ambiente per 10 min . Incubazione della sonda di cattura tiolato con HDT assicura che il gruppo tiolo sulla sonda di cattura è ridotto, con conseguente risultati più coerenti.
2. Applicare una corrente di azoto a nudo oro 16 chip di array di sensori (s) per 5 secondi per rimuovere l'umidità e / o particolati.
3. Applicare 6 microlitri della HDT-tiolato mix sonda di cattura per l'elettrodo di lavoro di tutti i 16 sensori della matrice di sensori e memorizzare il chip sensore (s) in una capsula di Petri coperta a 4 ° C durante la notte. Sonde di cattura tiolati legano direttamente l'elettrodo d'oro nudo e la HDT atti a prevenire addensamento delle sonde di cattura e di tenerli in una conformazione estesa che promuove l'ibridazione con il target.
4. Glidopo giorno, lavare il chip sensore con H ₂ O deionizzata per 2-3 secondi e secco sotto flusso di azoto per 5 sec.
5. Applicare 6 pl di 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-mercapto-1-esanolo (MCH) per l'elettrodo di lavoro di tutti i sensori 16 e incubare per 50 min. Questa e tutte le successive fasi di incubazione chip del sensore vengono eseguiti in una capsula di Petri coperto a temperatura ambiente. MCH agisce come un agente bloccante, riempiendo tutti gli spazi in cui la sonda di cattura o tiolato HDT non è presente sulla superficie dell'elettrodo.

2. Preparazione del campione

1. Trasferire 1 ml di coltura batterica in fase logaritmica di crescita (OD ₆₀₀ ≈ 0,1) in una provetta e centrifugare a 16.000 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante cultura. Il pellet batterico può essere elaborata immediatamente o conservato a -80 ° C per un uso successivo.
2. Accuratamente risospendere il pellet batterico in 10 ml di 1 M di NaOH applicando la punta della pipetta al bottom della provetta e pipettando su e giù diverse volte. Incubare la sospensione a temperatura ambiente per 5 min.
3. Neutralizzare il lisato batterico aggiungendo 50 ml di 1 M di tampone fosfato, pH 7,2, contenente 2,5% di sieroalbumina bovina (BSA) e 0,25 mM di una sonda rivelatore fluoresceina modificata. Incubare il lisato neutralizzato per 10 min a temperatura ambiente. Sonde rivelatore fluoresceina modificati ibridano con rRNA batterici molecole bersaglio.

3. Sensore elettrochimico Assay

1. Lavare il MCH dal chip sensore con H ₂ O deionizzata per 2-3 secondi e secco sotto flusso di azoto per 5 sec.
2. Applicare 4 microlitri di lisato batterico neutralizzato per l'elettrodo di lavoro di ciascuno dei 14 sensori e incubare per 15 min. Obiettivo-detector complessi sonda ibridano per sonde di cattura tiolati immobilizzati.
3. Applicare 4 microlitri di 1 nm ponte oligonucleotide in 1 M tampone fosfato, pH 7.2, contenente 2.5% BSA e 0.25 &mu, M sonda rivelatore fluoresceina-modificato a 2 sensori di controllo positivo (utilizzati per la normalizzazione del segnale) e incubare per 15 min.
4. Lavare il chip sensore con H ₂ O deionizzata per 2-3 secondi e secco sotto flusso di azoto per 5 sec.
5. Applicare 4 pl di 0,5 U / ml di anti-fluoresceina-HRP 1 M in tampone fosfato, pH 7,2, contenente 0,5% di caseina per l'elettrodo di lavoro di tutti i sensori 16 e incubare per 15 min. L'anti-fluoresceina-HRP si lega alle sonde rivelatore fluoresceina modificati immobilizzati.
6. Lavare il chip sensore con H ₂ O deionizzata per 2-3 secondi e secco sotto flusso di azoto per 5 sec.
7. Applicare un film ben adesivo alla superficie del chip del sensore e del carico nel supporto chip del sensore. Pipettare 50 ml di substrato TMB su tutti i 16 sensori e chiudere il monte chip del sensore.
8. Ottenere amperometria e misure di voltammetria ciclica per tutti i 16 sensori che utilizzano la Helios Reader Chip. Corrente amperometrica è proporzionale al tasso di TMB reduction sulla superficie del sensore (vedi Figura 1).

Risultati

Descriviamo un saggio elettrochimico che è strutturato in modo simile a un sandwich ELISA. Come mostrato in Figura 1, l'RNA bersaglio ribosomiale (rRNA) ibridazione con sonde di cattura e rivelatore è sviluppato da una reazione redox catalizzata dalla HRP coniugato frammenti anticorpali anti-fluoresceina che legano il collegamento 3 'fluoresceina sulla sonda rivelatore. Una componente importante di sensibilità del test è la chimica di superficie dell'elettrodo oro. Abbiamo trovato che un monostrato tern...

Discussione

Il test del sensore elettrochimico qui descritto consente una rapida individuazione di obiettivi di acidi nucleici. Sensibilità e specificità dipendono in parte l'energia libera di ibridazione sonda-bersaglio, che a sua volta dipende dalla lunghezza e il contenuto di GC della cattura e sonde rivelatore. Noi di solito eseguire i passaggi di ibridazione a temperatura ambiente (~ 20 ° C) ^{5, 6.} Tuttavia, la procedura di ibridazione (3.2 e 3.3) possono essere eseguite anche a temperature più elevate in un forn...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
6-mercapto-1-esanolo (MCH)	Sigma	451088	Conservare a temperatura ambiente
1,6-esanditiolo (HDT)	Sigma	H-12005	Conservare a temperatura ambiente
Sonde di cattura tiolate	Operon	N/A	Conservare a 100 μ M in 0,1x TE a -20 ° C
Sonde rivelatore modificate con fluoresceina	Operon	N/A	Conservare a 100 μ M in 0,1x TE a -20 ° C
Operone oligonucleotidico a ponte		N/A	Conservare a 100 μ M in 0,1x TE a -20 ° C
Anti-Fluoresceina-HRP, Fab frammenti	Roche	11 426 346 910	Conservare a 4 ° C
Helios Chip Reader	GeneFluidics	GFR-2009
Sensore Chip Mount	GeneFluidics	GFR-003
Adesivo per pozzetti in pellicola	GeneFluidics		Spedito con chip sensore
Chip array a 16 sensori in oro nudo	GeneFluidics	SC1000-16X-B	Conservare in 100% N2 a temperatura ambiente
Albumina	sierica bovinaSigma	A7906	Negozio a 4 gradi
C 1M Phosphate Buffer, pH 7.2			0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, regolato a pH 7.2
Caseina bloccante in PBS	Pierce	37528	Diluire con un volume uguale di 1M di tampone fosfato, pH 7,2, conservare a 4 gradi C
Tabella 1. Reagenti e attrezzature.