Due tecniche possono essere usate per stabilire questo modello: l'iniezione di una sospensione di cellule tumorali nella parete del cieco o il trapianto di un pezzo di tumore sottocutaneo sul cieco. Questo modello è utile per studiare la naturale progressione del tumore del colon-retto e test nuovi agenti terapeutici contro il cancro del colon-retto.
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Articolo metodologico
Topo Modello ortotopico di cancro colorettale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tradizionale modello di tumore sottocutaneo è proprio l'ideale per lo studio del cancro del colon-retto. Ortotopico modelli murini di cancro del colon-retto, che presentano le cellule tumorali in crescita nella loro posizione naturale, replicare malattia umana con l'alta fedeltà. Due tecniche possono essere usate per stabilire questo modello. Entrambe le tecniche sono simili e richiedono l'anestesia del mouse e laparotomia per l'esposizione del cieco. Una tecnica prevede l'iniezione di una sospensione di cellule di cancro del colon-retto nella parete del cieco. Le cellule cancerose vengono prima crescere in coltura, raccolto quando subconfluent e pronta come una sospensione di cellule singole. Una piccola quantità di cellule viene iniettato lentamente per evitare perdite. L'altra tecnica prevede il trapianto di un pezzo di tumore sottocutaneo sul cieco. Un mouse con un precostituito tumore del colon-retto per via sottocutanea è eutanasia e il tumore è stato rimosso con tecnica sterile. Il pezzo tumore è diviso in piccoli pezzi per il trapianto di un altro mouse. Prima del trapianto, la parete del cieco è leggermente danneggiato per facilitare l'infiltrazione delle cellule tumorali. Il tempo per lo sviluppo di tumori primari e delle metastasi epatiche varia a seconda della tecnica, linea cellulare, e le specie utilizzate il mouse. Questo modello murino ortotopico è utile per studiare la naturale progressione del tumore del colon-retto e test nuovi agenti terapeutici contro il cancro del colon-retto.
Protocollo
I. Preparazione cellulare
- Le cellule tumorali del colon-retto sono cresciuti in coltura e raccolta quando subconfluent.
- Una sospensione singola cella viene preparato in tampone fosfato e tenuta in ghiaccio.
II. Preparazione del tumore
- Un mouse con un precostituito tumore del colon-retto per via sottocutanea è eutanasia.
- Il tumore sottocutaneo viene rimosso utilizzando una tecnica sterile e diviso in 2-3 pezzi millimetri
- I pezzi del tumore sono tenuti in tampone fosfato salino sul ghiaccio.
III. Preparazione del mouse
Nota: Nel nostro laboratorio usiamo per via inalatoria isoflurano per anestetizzare il mouse, in alternativa, si può usare anestetici iniettabili per ottenere lo stesso effetto
- La profondità di anestesia viene valutata usando un pizzico piedi. Non ci dovrebbero essere ritirarsi reflex con un pizzico punta.
- Gli antibiotici può essere somministrato a questo punto.
- Il mouse anestetizzato, che in precedenza era rasata, sia posizionata correttamente.
- L'addome viene preparato con una soluzione di Betadine.
- Dell'addome e del sito chirurgico sono drappeggiati in modo sterile.
IV. Laparotomia
- Un piccolo nick è realizzata in pelle
- La muscolatura della parete addominale è colto ed elevato
- La cavità addominale è entrato e una singola lama delle forbici è usato per spingere l'intra-addominale contenuti via
- L'incisione è estesa a 2-3 cm
L'esposizione V. del cieco
- Il cieco con il suo sacchetto finale cieco è identificato e esteriorizzato
- Il cieco è isolato dal resto del mouse utilizzando un pre-taglio, garza sterile
- Salina calda viene utilizzata per mantenere umido il cieco
VI. L'iniezione di cellule nella parete del cieco
- A 27 G o un ago sottile viene usato per iniettare un volume di 50 ml di cellule nella parete del cieco
- L'ago viene rimosso
- Il sito di iniezione è controllato per garantire l'assenza di perdite
- Il cieco è tornato alla cavità addominale
VII. Il trapianto di Tumore sulla Cieco
Nota: oltre a iniettare le cellule nel muro del cieco, un approccio alternativo consiste nel trapianto di tumore sul cieco
- Una figura di 8 punti è posizionato sul cieco utilizzando 6-0 o 7-0 sutura dimensioni
- La parete del cieco è leggermente danneggiato
- Poi, il pezzo tumorale è posizionata
- Il punto è legato
- Il cieco è tornato alla cavità addominale
VIII. Chiusura del mouse parete addominale e di recupero
- La parete addominale del mouse è chiuso con tre punti di sutura interrotta utilizzando 3-0 o 4-0 sutura dimensioni
- In alternativa, si può usare un punto semplice esecuzione
- Post-operatorio analgesici e un bolo fluido può essere data a questo punto
- Il mouse è permesso di recuperare l'anestesia.
Nota: con anestetici inalatori questo richiede in genere 30 secondi
IX. Risultati - tumore primitivo e metastasi epatiche
Tumore primario - mostrato in situ (A) e con evidenza di neovascolarizzazione (B); alla colorazione H & E, i tumori localmente invasivi (C)
Metastasi al fegato - mostrato ex vivo (D)
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Discussione
Anche se il mouse modelli di tumore sottocutaneo sono facili da stabilire e controllare, è chiaro che questo modello non può replicare il sito originale anatomica del tumore colorettale. A causa della differenza di microambiente, le cellule del cancro colorettale in crescita sotto la pelle hanno dimostrato di cambiare il loro fenotipo e quasi sempre non riescono a progredire e metastasi 1,2. In realtà, la risposta del tumore alla terapia può variare notevolmente a seconda che le cellule tumorali sono impiantate in un ectopica (so...
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Ringraziamenti
Dipartimento di Chirurgia, Università di California, San Francisco
Raymond Shaheen, MD
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mezzi e componenti per colture cellulari | variano a seconda della linea cellulare utilizzata | ||
| Soluzione salina tamponata al fosfato | BioWhittaker | 17-512F | disponibile anche presso numerosi altri fornitori |
| Provette da centrifuga da 15 mL, in polipropilene | Corning | 430790 | |
| Piastre a 6 pozzetti con coperchio | BD Biosciences | 353046 | |
| Pinze da iridectomia, dritte, con punte seghettate | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | è consigliabile avere un paio di questi strumenti |
| Forbici da dissezione da iridectomia, dritte, affilate | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Pinza per ago chirurgico (standard) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Pinza per ago chirurgico (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | gli strumenti devono essere sterilizzati periodicamente in autoclave, ma possono anche essere disinfettati immergendoli in Cidex |
| Filetto di sutura 6-0 o 7-0 | per il cieco; cortesia del Dipartimento di Chirurgia, UCSF | ||
| Filetto di sutura 3-0 o 4-0 | per la parete addominale; cortesia del Dipartimento di Chirurgia, UCSF | ||
| Macchina per anestesia / Isoflurano | J.A. Baulch and Associates | 3206 | disponibile anche presso numerosi altri fornitori |
| Piastra riscaldante monouso, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Nastro adesivo arancione, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | per immobilizzare il topo anestetizzato |
| Tagliacapelli Pro-Cord/Cordless | Oster Professional Products | 78997-010 | per rasare il pelo del topo |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | può essere acquistato anche in qualsiasi negozio di materiale medico |
| Garze 2 x 2, 3 strati | Johnson & Johnson | 7635 | possono essere acquistate anche in qualsiasi negozio di materiale medico |
| Campo sterile, barriera, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | può essere acquistato anche in qualsiasi negozio di materiale medico |
| Applicatori con estremità in cotone, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | possono essere acquistati anche in qualsiasi negozio di materiale medico |
| Siringa da 10 cc, con ago Luer lock | BD Biosciences | 309604 | |
| Siringa da 1 cc, tubercolinica, con ago slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| Ago da 27 1/2 G | BD Biosciences | 305109 | |
| Ago da 30 G | BD Biosciences | 305106 |
Riferimenti
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
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Ristampe e permessi
