Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

Summary

Un metodo è descritto per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in predeterminate funzionali micro-domini della neocorteccia. Primo, imaging segnale intrinseco ottico viene utilizzato per ottenere una mappa funzionale. Poi microscopia a due fotoni è usato per l'etichetta e neuroni di immagine all'interno di un micro-dominio della mappa.

Abstract

Nella corteccia visiva primaria di non-mammiferi roditori, i neuroni sono raggruppati in base alla loro preferenza per le funzioni di stimolo come l'orientamento ^1-4, direzione ^5-7, dominanza oculare ^8,9 e disparità binoculare ^9. Selettività Orientamento è la caratteristica più studiati ed una mappa continua con un quasi-periodico disposizione per l'orientamento preferito è presente su tutta la corteccia visiva primaria ^10,11. L'integrazione dei contributi sinaptiche, cellulare e di rete che portano a risposte di stimolo selettivo in queste mappe funzionali richiede l'ibridazione di tecniche di imaging che si estendono su sub-micron di millimetro scale spaziali. Con l'imaging convenzionale segnale ottico intrinseco, il layout generale di mappe funzionali tutta la superficie della corteccia visiva può essere determinato ^12. Lo sviluppo in vivo di due fotoni microscopia utilizzando coloranti sensibili calcio permette di determinare la SYNAPTingresso ic arrivare a spine dendritiche singoli ¹³ o record di attività contemporaneamente da centinaia di singoli corpi cellulari neuronali ^6,14. Di conseguenza, combinando l'imaging intrinseca segnale con la sub-micron risoluzione spaziale di due fotoni microscopia offre la possibilità di determinare esattamente quali segmenti dendritiche e cellule contribuiscono al micro-dominio di ogni mappa funzionale nella neocorteccia. Qui mostriamo un alto rendimento metodo per ottenere rapidamente una mappa corticale orientamento e di una versione specifica micro-dominio in questa mappa funzionale per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in un non-roditore mammifero. Con il microscopio stesso utilizzato per l'imaging a due fotoni, dobbiamo prima di generare una mappa di orientamento utilizzando l'imaging intrinseca segnale ottico. Poi ci mostrano come assegnare un micro-dominio di interesse con una micropipetta caricato con colorante per l'etichetta sia una popolazione di corpi cellulari neuronali o l'etichetta di un singolo neurone in modo tale che dendriti e degli assoni, le spine sono visibili invivo. Nostri perfezionamenti rispetto ai metodi precedenti facilitare un esame della neuronali relazioni struttura-funzione con sub-cellulare risoluzione nel quadro neocorticali architetture funzionali.

Protocol

1. Preparazione chirurgica

1. Indurre l'anestesia e monitorare la frequenza cardiaca, terminare CO marea _2, EEG, e la temperatura. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della Medical University of South Carolina e si basano su quelle che abbiamo precedentemente pubblicato con il ^9,15.
2. Esporre la superficie dorsale del cranio tagliando la pelle con una lama da bisturi. Staccare il tessuto connettivo sovrastanti l'osso con una curette Brudon. Pulire l'osso con applicatori di cotone con punta e garza di cotone. Applicare la cera ossea (se necessario) al cranio, per arrestare l'emorragia occasionale attraverso piccole vene emissario.
3. Collegare un titanio o acciaio piastra di testa in acciaio al cranio (sopra la regione di interesse in cui la craniotomia verrà eseguita) utilizzando cemento dentale mescolato con vernice nera (vedi Materiali). Una apertura rettangolare al centro della piastra di testa fornisce l'accesso per la craniotomia e imaging ottico. Allegare una camera metallica sulla parte superiore della piastra di testa. Questa camera servirà come un serbatoio di fluido per l'imaging con la lente obiettivo immersione in acqua.
4. Fissare la piastra di testa per una fase xy con perni in metallo.
5. Assottigliare una vasta area dell'osso entro l'apertura rettangolare della piastra di testa utilizzando un trapano dentistico. L'area deve essere diluito deve estendersi ben oltre i confini della craniotomia previsto. Il cranio di spessore non roditori mammiferi deve essere diluito se immagini ad alta risoluzione sono da acquisire dalla neocorteccia perché al sito craniotomia, lo spessore dell'osso detterà lo spessore del agarosio tra la superficie e coverglass neocorticale (vedi sotto) .
6. Praticare un 2 x 2 mm quadrati contorno nell'osso per la craniotomia. Sciacquare la camera periodicamente con fresco liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) per rimuovere frammenti ossei e ridurre al minimo la dissipazione del calore verso la corteccia sottostante. Applicare la cera ossea, se necessario, per fermare le emorragie occasionali.
7. Lift il lembo osseo con una pinza # 3.
8. Rimuovere tutti, ma il livello più basso di durata con una multa pinza (# 5CO) e forbici a molla Vännäs. La dura madre non roditori mammiferi è spessa e opaca, ma può essere rimossa in strati distinti. Il sanguinamento è raro, ma può essere fermato con Gelfoam e gli eventuali residui di sangue dovrebbe essere delicatamente rimosso dallo strato residuo di durata uso di pinze e risciacquo con ACSF. Lo strato finale di dura è trasparente e vasi piali deve essere chiaramente visibile attraverso di essa. Lasciare questo strato finale di dura intatto durante l'esposizione del segnale intrinseco aumenterà il tasso di successo di caricamento di massa di indicatori di calcio fluorescenti per la successiva a due fotoni di imaging fase dell'esperimento (vedi Discussione).
9. Applicare una goccia di caldo agarosio al 2% (sciolto in ACSF) e collocare immediatamente il coprioggetti sopra la craniotomia. Controllare la craniotomia per garantire che le pulsazioni respiratorie e cardiovascolari sono minime utilizzando un microscopio da dissezione chirurgica o gli oculari di duefotone microscopio in campo chiaro modalità.

2. Intrinseca del segnale ottico Imaging

1. Aggiungere gel-schiuma imbevuta con ACSF intorno all'esterno del coprioggetto per evitare l'agarosio si secchi durante l'imaging segnale intrinseco.
2. Fissare la fotocamera intrinseca un elaboratore di immagini CCD allo standard C-mount porta sulla parte superiore del microscopio a due fotoni (Figura 1). Posizionare la sorgente di luce illuminante sul tavolo aria vicino alla fase xy (Figura 1A). Posizionare e fissare le guide di luce oltre la craniotomia e piastra di testa / camera (Figura 1B). Ritrarre il dicroico primario e lo specchio di sotto del C-mount porta in modo che la luce riflessa rossa necessaria per segnali intrinseci passerà direttamente dalla craniotomia alla telecamera CCD (Figura 1C-D). Utilizzando l'obiettivo 4x aria (0,13 NA, 17 mm WD), un 2 x 2 mm Campo di vista è disponibile per l'imaging del segnale intrinseco.
3. Inserire un filtro di calore nel light percorso per impedire la corteccia di riscaldamento. Utilizzare un filtro che lascia passare la luce verde (546 nm centro λ) e registrare l'immagine digitale di riferimento dei vasi sanguigni superficiali corticali.
4. Spostare lo stato attivo z a 500 micron sotto la superficie corticale. Utilizzare un filtro rosso (630 nm centro λ) per illuminare la corteccia per la misurazione dei segnali intrinseci. Posizionare le guide di luce in modo tale che la superficie corticale è uniformemente illuminata. Proteggere la craniotomia della luce prodotta dal display stimolo visivo. Presentare una sequenza di stimoli visivi e registrare immagini dati di riflettanza. Per generare una mappa di orientamento entro 10 min, raccogliere dati corrispondenti a quattro ripetizioni di una sequenza di 8 stimoli (4 orientamenti e due direzioni per ciascun orientamento).
5. Analizzare i dati del segnale intrinseco di generare una falsa mappa di orientamento a colori. Selezionare le regioni potenziale bersaglio per due fotoni etichettatura dei neuroni, ad esempio, l'orientamento singolarità pinwheel - punti della mappa in cuitutte le orientazioni preferenziali convergono (Figura 2A). Sovrapporre la mappa orientamento e l'immagine della vascolarizzazione superficie corticale (Figura 2B-C). Utilizzare il layout di domini funzionali e la posizione di navi di superficie di grandi dimensioni per selezionare una destinazione, evitando luoghi in cui i grandi vasi sanguigni e arteriole ^15.

3. Caricamento di massa degli indicatori di calcio fluorescenti

1. Preparare una soluzione di 20% Pluronic / DMSO aggiungendo 1 g di Pluronic in DMSO 5 microlitri. Riscaldare la miscela a 60 ° C per 10 minuti per sciogliere completamente il Pluronic. Permettere alla miscela di raffreddare a temperatura ambiente. Aggiungere 4 microlitri della Pluronic / DMSO miscela una fiala 50 mg dell'indicatore calcio fluorescente verde Oregon 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Poi aggiungere 1 ml di un colorante rosso (Alexa 594, 2 mM soluzione stock) e 35 pl di soluzione di pipetta (vedi Materiali) per una concentrazione finale di 1 mM OGB-1 AM. Sonicare la soluzione per ½ ora inun bagno di acqua fredda, quindi si centrifuga con 0,45 micron filtro per rimuovere le impurità.
2. Tirare una pipetta lunga cono con un diametro esterno di punta 2,0-2,5 micron. Caricare 5 microlitri della miscela colorante nella pipetta.
3. Rimuovere lo strato finale di dura per facilitare l'inserimento pipetta e ottenere la più alta qualità a due fotoni immagini.
4. Determinare l'esatta posizione sulla superficie corticale che la pipetta deve essere posizionato in modo da raggiungere l'obiettivo in strato corticale 2/3. Il nostro obiettivo predeterminato corticale è una singolarità girandola nella mappa di orientamento (Figura 2). La pipetta deve essere guidato nella corteccia di un angolo di 30 ° per passare tra le pareti della camera e l'obiettivo. Così, per etichettare la regione bersaglio 200 micron sotto la superficie corticale, la posizione di ingresso pipetta sulla superficie corticale sarà di circa 350 micron laterali alla posizione di destinazione (Figura 3 AB).
5. Spostare la fase di xy (su cui l'animale e il pmicromanipolatore ipette sono posti) al centro della superficie corticale posizione di ingresso nell'ambito dell'obiettivo (Figura 3C). Utilizzare un obiettivo 20x o 40x con una distanza di lavoro (WD) di almeno 3 mm (vedi Materiali) per assicurare che la pipetta facilmente inserire la corteccia senza toccare l'obiettivo o l'osso lungo la parete della craniotomia. Una volta che la posizione di ingresso è centrata sotto l'obiettivo, sollevare la posizione Z dell'obiettivo da 2 mm (Figura 3D). Con l'epi-fluorescenza verde chiaro acceso per visualizzare il rosso Alexa colorante nella pipetta, utilizzare l'asse diagonale del micromanipolatore per spostare la pipetta fino a quando la punta è centrato (e concentrata) a titolo dell'obiettivo direttamente sopra l'ingresso della superficie corticale ( Figura 3E).
6. Abbassare la pipetta verticalmente (lungo l'asse Z) fino alla pipetta raggiunge la superficie corticale (Figura 3F), mentre continua la visualizzazione della punta della pipetta attraverso l'OCUlars del microscopio. Utilizzo in campo chiaro di illuminazione, le corticali vasi sanguigni superficiali e rimanenti membrane meningee (pia e aracnoide) sono facilmente visibili come la pipetta si avvicina alla superficie corticale. Se la pipetta non raggiunge la posizione desiderata, sollevare la pipetta e ricalibrare il targeting in base ai punti di riferimento vascolari sulla superficie corticale.
7. Rimuovere l'obiettivo, stoppino eccesso di liquido cerebrospinale dalla craniotomia e asciugare l'osso adiacente, con panno-free lance di assorbimento. Applicare una goccia di calda 3% agarosio (disciolto in ACSF) per stabilizzare la corteccia che è visibile attraverso la craniotomia (figura 3G). Nei non roditori, 3% agarosio è necessario smorzare pulsazioni per l'assorbimento efficace di coloranti fluorescenti da neuroni. Per l'imaging ottico di segnale intrinseco solo il 2% di agarosio è necessaria in quanto la combinazione di agarosio al 2% e il coprioggetto offre la stabilità necessaria. Qui, non coverglass viene utilizzato per il colorante di caricamento passo così agarosio al 3% ènecessario. Dopo l'agarosio si è solidificato, inserire un obiettivo 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) e ri-riempire la camera con ACSF.
8. Passare dal campo chiaro a due fotoni visualizzazione e individuare la punta della pipetta. Utilizzando l'asse diagonale del micromanipolatore, spostare la pipetta finché la punta raggiunge la profondità desiderata nella corteccia (figura 3H). Occasionali sbuffi di pressione di espulsione della miscela colorante (una psi pochi, ogni impulso 0,1 sec), aiuta a prevenire la punta della pipetta da intasamento. Poiché OGB-1:00 diventa visibile solo entrando cellule, il colorante rosso Alexa è critico per la visualizzazione della punta della pipetta all'interno della corteccia.
9. Prima di caricare i neuroni in strato corticale 2/3 con l'intera dose di colorante, rifocalizzare l'obiettivo sulla superficie corticale per confermare la profondità della punta della pipetta e garantire che la punta si trova nella posizione di destinazione sulla base del layout di vasi sanguigni superficiali. Se la pipetta è nel livello 2/3, piccoli sbuffi di miscela colorante dovrebbe illuminare l'spazio extracellulare e rivelano un gruppo denso di corpi cellulari circolari come ombre scure.
10. Per caricare corpi cellulari neuronali in una sfera di corteccia 300-600 micron di diametro, iniettare la miscela colorante nello spazio extracellulare usando 30-90 impulsi, ogni impulso 1,0 sec, 2-10 psi. Gli impulsi di pressione non dovrebbe essere così forte che il tessuto si muove. Dopo l'iniezione è stata completata, attendere pochi min, quindi rimuovere la pipetta e obiettivo. Attendere 1 ora per consentire il OGB-1 AM per essere prese pienamente-up dai neuroni.
11. Rimuovere l'agarosio utilizzata per il carico colorante e lavare la camera di registrazione. Mettere una piccola goccia di 2-3% agarosio in superficie e rapidamente mettere un coprioggetti sopra la craniotomia. Poiché i coloranti fluorescenti sono sensibili alla luce, evitare di sovraesporre la corteccia di campo chiaro o epi-fluorescente. Inserire un elevato NA (1.0) 20x obiettivo nel supporto obiettivo e ricentrare la regione corticale etichettata nell'ambito dell'obiettivo utilizzando la fase di xy. Proteggere la craniotomia da exfonti di luce traneous, ad esempio, la visualizzazione stimolo visivo, utilizzando strati multipli di materiale blackout.

4. Single-cell Elettroporazione di coloranti fluorescenti

1. Per studiare la morfologia dendritica, preparare una soluzione di 100 mM Alexa Fluor 594 (diluizione 1:20 in ACSF di 2 mM Alexa Fluor 594 stock). Per l'imaging funzionale di dendriti un sale OGB può essere utilizzato ^16,17.
2. Tirare una pipetta lunga cono con dimensioni ugello di 1 um e caricare 5 microlitri di colorante nella pipetta. Tutte le altre fasi di mira un dominio funzionale è identico al metodo di caricamento bulk (Figure 1-3). Per posizionare la punta della pipetta adiacente ad una membrana neuronale corpo cellulare, monitorare l'aumento dell'impedenza dell'elettrodo ed applicare pressione sbuffi di colorante ad illuminare lo spazio extracellulare e vedere corpi cellulari come ombre durante due fotoni imaging.
3. Quando la punta della pipetta è adiacente ad una membrana neuronale corpo cellulare, utilizzare l'800A Axoporator applicareImpulsi 1-3 (-8 a -10 V, 10 ms di impulso). Il riempimento immediato del neurone con colorante è facilmente visualizzato con microscopia a due fotoni. Rimuovere la pipetta e raccogliere immagini ad alta risoluzione dei dendriti e degli assoni in vivo.

Results

Per illustrare la precisione dei nostri metodi di etichettatura tinture, abbiamo mirato più piccolo micro-dominio di qualsiasi mappa noto funzionale nella neocorteccia non roditore. Scarsamente punteggiato tutta la mappa di orientamento nella corteccia visiva primaria sono singolarità. Questi si verificano nei punti in cui convergono tutte le orientazioni preferenziali in modo tale che nelle mappe in falsi colori di orientamento preferenziale, le regioni intorno l'aspetto singolarità come "girandole" (Figura 2A-...

Discussion

Vi presentiamo un metodo per indirizzare l'etichettatura dei corpi cellulari neuronali (o dendriti e degli assoni) in pre-determinati funzionali micro-domini della neocorteccia. Fusione di imaging intrinseca segnale ottico con due fotoni microscopia offre la possibilità di determinare quali sinapsi e cellule contribuiscono al micro-dominio di ogni mappa funzionale, sia correlato selettività neuronali con la posizione del neurone in una mappa funzionale, e il circuito neuronale componenti che cambiano con l'esper...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
			1. Supporto Life / esperimento prep
Isoflurano	Webster Vet	NDC 57319-474-05
Vaporizzatore isoflurano	Midmark	VIP 3000
Commenti termocoperta regolamentato	Harvard Apparatus	50-7079F
Monitor ECG	Digicare biomedica	LifeWindow Lite
Amplificatore EEG	AM Sistemi	1800
Monitor EEG	Hewlett Packard	78304A
End tidal CO 2 monitor	Respironics	Novametrix Capnoguard 1265	Ottimizzare la ventilazione
Bave trapano in metallo duro per ossa foratura	Henry Schein	bene (0,5 punta mm) e grosso (1,25 punta mm)
Cemento per piastra di testa / camera	Dentsply	675571, 675572
Nero Polvere Tempera Vernice	Sargent Art Inc.	22-7185	Aggiungi al cemento per migliorare la luce schermatura e ridurre i riflessi
Agarosio - Tipo III-A	Sigma	A9793	Per ridurre al minimo le pulsazioni durante il segnale intrinseco e due fotoni di imaging
Vetrino: 5 o 8 mm di diametro, 0,17 mm di spessore	Mondo Precisionstruments	502040, 502041	Per ridurre al minimo le pulsazioni durante l'esposizione, il coprioggetto può essere tagliato in base alle esigenze
Brudon curette	George Tiemann	105-715-0, 105-715-3	Pulizia della superficie del cranio
Bone cera	Ethicon	W31G	Rapidamente fermare l'emorragia
Punta in cotone Applicatore	Scienze della microscopia elettronica	72308-05	Osso superficie pulita ed asciutta
Dumont # 5CO Pinze	Strumenti Scienza Belle	11295-20	Prendete singoli strati di durata o di pia
Vannas Primavera Forbici	Strumenti Scienza Belle	15000-03	Cut dura
Gelfoam	Pfizer	09-0396-05	Per arrestare l'emorragia sulla durata
Assorbimento lance	Strumenti Scienza Belle	18105-01	Assorbimento ultra-veloce e privo di lanugine di CSF
Blackout materiale	Thorlabs	BK5	Scudo craniotomia
			2. Tingere preparazione / iniezione
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma	D2650
Pluronic	Sigma	P2443
Oregon verde 488-Bapta 01:00	Invitrogen	O6807	Indicatore di calcio
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A10438
Filtro centrifugo (dimensione dei pori 0,45 um)	Millipore	UFC30HV00	Per rimuovere le impurità prima dell'iniezione
Pipetta di vetro estrattore	Sutter Instruments	P97
Vetro borosilicato filamented capillare (1,5 mm di diametro esterno)	Mondo Strumenti di precisione	1B150F-4	Espulsione pipetta Dye
Microloader	Eppendorf	5242 956 003	Per il caricamento colorante in pipetta
Micromanipolatore	Sutter Instruments	MP-285	Per posizionare pipetta
Pressione a impulsi	Parker Hannifin	PicoSpritzer III	Per pressione di iniezione del colorante
Single-cell elettroporatore	Molecular Devices	Axoporator 800A	Per elettroporazione del colorante
			3. Intrinseca imaging
Obiettivo 4x (0,13 NA, 17 mm WD)	Olimpo	UPLFLN4X
Intrinseca hardware / software	Optical Imaging Inc.	Imager 3001 / VDAQ	VDAQ software viene utilizzato per l'imaging episodica
CCD	Adimec	Adimec-1000
Luce sorgente di alimentazione	KEPCO	ATE 15-15M
Sorgente di luce	Optical Imaging Inc.	HAL 100	L'intensità della luce sulla superficie corticale di 3-5 mW
Filtro verde (per l'immagine vascolare)	Optical Imaging Inc.	λ = 546 nm (banda passante 30 nm)	Per un'immagine di riferimento di vascolarizzazione superficiale
Filtro rosso (per segnale intrinseco)	Ottica Imaging Inc.	λ = 630 nm (banda passante 30 nm)	Per raccogliere segnali intrinseci
Calore filtro	Optical Imaging Inc.	KG-1
			4. Due-fotone rig / immagini
Microscopio a due fotoni e software	Prairie Technologies		Vedi Shen et al. 2012 per percorso della luce, filtri e potenza del laser
Ti: zaffiro laser	Spectra-Physics	Mai Tai XF
20x (0,5 NA; 3,5 millimetri WD)	Olimpo	UMPLFLN20X	0,5 obiettivo NA viene utilizzata solo per l'allineamento pipetta sul craniotomia (non per l'imaging due fotoni)
20x (1,0 NA; 2,0 millimetri WD)	Olimpo	XLUMPLFLN20X
40x (0,8 NA; 3,3 millimetri WD)	Olimpo	LUMPLFLN40X/IR
Air tavolo	Newport	ST-200	Isola preparazione da vibrazioni esterne
xy fase	Mike Machine Co. (Attleboro, MA)		Soggetto sperimentale e micromanipolatore Sutter posto sul palco xy
			Ricette Artificiale liquido cerebro-spinale NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl 2 (1,0 mM), CaCl 2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4 Pipettare Soluzione 14 NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4