Un metodo è descritto per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in predeterminate funzionali micro-domini della neocorteccia. Primo, imaging segnale intrinseco ottico viene utilizzato per ottenere una mappa funzionale. Poi microscopia a due fotoni è usato per l'etichetta e neuroni di immagine all'interno di un micro-dominio della mappa.
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Articolo metodologico
Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nella corteccia visiva primaria di non-mammiferi roditori, i neuroni sono raggruppati in base alla loro preferenza per le funzioni di stimolo come l'orientamento 1-4, direzione 5-7, dominanza oculare 8,9 e disparità binoculare 9. Selettività Orientamento è la caratteristica più studiati ed una mappa continua con un quasi-periodico disposizione per l'orientamento preferito è presente su tutta la corteccia visiva primaria 10,11. L'integrazione dei contributi sinaptiche, cellulare e di rete che portano a risposte di stimolo selettivo in queste mappe funzionali richiede l'ibridazione di tecniche di imaging che si estendono su sub-micron di millimetro scale spaziali. Con l'imaging convenzionale segnale ottico intrinseco, il layout generale di mappe funzionali tutta la superficie della corteccia visiva può essere determinato 12. Lo sviluppo in vivo di due fotoni microscopia utilizzando coloranti sensibili calcio permette di determinare la SYNAPTingresso ic arrivare a spine dendritiche singoli 13 o record di attività contemporaneamente da centinaia di singoli corpi cellulari neuronali 6,14. Di conseguenza, combinando l'imaging intrinseca segnale con la sub-micron risoluzione spaziale di due fotoni microscopia offre la possibilità di determinare esattamente quali segmenti dendritiche e cellule contribuiscono al micro-dominio di ogni mappa funzionale nella neocorteccia. Qui mostriamo un alto rendimento metodo per ottenere rapidamente una mappa corticale orientamento e di una versione specifica micro-dominio in questa mappa funzionale per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in un non-roditore mammifero. Con il microscopio stesso utilizzato per l'imaging a due fotoni, dobbiamo prima di generare una mappa di orientamento utilizzando l'imaging intrinseca segnale ottico. Poi ci mostrano come assegnare un micro-dominio di interesse con una micropipetta caricato con colorante per l'etichetta sia una popolazione di corpi cellulari neuronali o l'etichetta di un singolo neurone in modo tale che dendriti e degli assoni, le spine sono visibili invivo. Nostri perfezionamenti rispetto ai metodi precedenti facilitare un esame della neuronali relazioni struttura-funzione con sub-cellulare risoluzione nel quadro neocorticali architetture funzionali.
Protocollo
1. Preparazione chirurgica
- Indurre l'anestesia e monitorare la frequenza cardiaca, terminare CO marea 2, EEG, e la temperatura. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della Medical University of South Carolina e si basano su quelle che abbiamo precedentemente pubblicato con il 9,15.
- Esporre la superficie dorsale del cranio tagliando la pelle con una lama da bisturi. Staccare il tessuto connettivo sovrastanti l'osso con una curette Brudon. Pulire l'osso con applicatori di cotone con punta e garza di cotone. Applicare la cera ossea (se necessario) al cranio....
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Risultati
Per illustrare la precisione dei nostri metodi di etichettatura tinture, abbiamo mirato più piccolo micro-dominio di qualsiasi mappa noto funzionale nella neocorteccia non roditore. Scarsamente punteggiato tutta la mappa di orientamento nella corteccia visiva primaria sono singolarità. Questi si verificano nei punti in cui convergono tutte le orientazioni preferenziali in modo tale che nelle mappe in falsi colori di orientamento preferenziale, le regioni intorno l'aspetto singolarità come "girandole"
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Discussione
Vi presentiamo un metodo per indirizzare l'etichettatura dei corpi cellulari neuronali (o dendriti e degli assoni) in pre-determinati funzionali micro-domini della neocorteccia. Fusione di imaging intrinseca segnale ottico con due fotoni microscopia offre la possibilità di determinare quali sinapsi e cellule contribuiscono al micro-dominio di ogni mappa funzionale, sia correlato selettività neuronali con la posizione del neurone in una mappa funzionale, e il circuito neuronale componenti che cambiano con l'esper.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Eye Institute R01EY017925 e R21EY020985 e finanziamento da parte delle Fondazioni Dana & Whitehall a PK Ringraziamo Matteo Petrella per l'assistenza alle procedure chirurgiche, Grazia Dion a rintracciare i dendriti illustrato nella figura 5a e Pratik Chhatbar per commenti sul manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Nome del reagente / materiale | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |||||
| 1. Supporto Life / esperimento prep | ||||||||
| Isoflurano | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | ||||||
| Vaporizzatore isoflurano | Midmark | VIP 3000 | ||||||
| Commenti termocoperta regolamentato | Harvard Apparatus | 50-7079F | ||||||
| Monitor ECG | Digicare biomedica | LifeWindow Lite | ||||||
| Amplificatore EEG | AM Sistemi | 1800 | ||||||
| Monitor EEG | Hewlett Packard | 78304A | ||||||
| End tidal CO 2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Ottimizzare la ventilazione | |||||
| Bave trapano in metallo duro per ossa foratura | Henry Schein | bene (0,5 punta mm) e grosso (1,25 punta mm) | ||||||
| Cemento per piastra di testa / camera | Dentsply | 675571, 675572 | ||||||
| Nero Polvere Tempera Vernice | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Aggiungi al cemento per migliorare la luce schermatura e ridurre i riflessi | |||||
| Agarosio - Tipo III-A | Sigma | A9793 | Per ridurre al minimo le pulsazioni durante il segnale intrinseco e due fotoni di imaging | |||||
| Vetrino: 5 o 8 mm di diametro, 0,17 mm di spessore | Mondo Precisionstruments | 502040, 502041 | Per ridurre al minimo le pulsazioni durante l'esposizione, il coprioggetto può essere tagliato in base alle esigenze | |||||
| Brudon curette | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Pulizia della superficie del cranio | |||||
| Bone cera | Ethicon | W31G | Rapidamente fermare l'emorragia | |||||
| Punta in cotone Applicatore | Scienze della microscopia elettronica | 72308-05 | Osso superficie pulita ed asciutta | |||||
| Dumont # 5CO Pinze | Strumenti Scienza Belle | 11295-20 | Prendete singoli strati di durata o di pia | |||||
| Vannas Primavera Forbici | Strumenti Scienza Belle | 15000-03 | Cut dura | |||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | Per arrestare l'emorragia sulla durata | |||||
| Assorbimento lance | Strumenti Scienza Belle | 18105-01 | Assorbimento ultra-veloce e privo di lanugine di CSF | |||||
| Blackout materiale | Thorlabs | BK5 | Scudo craniotomia | |||||
| 2. Tingere preparazione / iniezione | ||||||||
| Dimetilsolfossido (DMSO) | Sigma | D2650 | ||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | ||||||
| Oregon verde 488-Bapta 01:00 | Invitrogen | O6807 | Indicatore di calcio | |||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | ||||||
| Filtro centrifugo (dimensione dei pori 0,45 um) | Millipore | UFC30HV00 | Per rimuovere le impurità prima dell'iniezione | |||||
| Pipetta di vetro estrattore | Sutter Instruments | P97 | ||||||
| Vetro borosilicato filamented capillare (1,5 mm di diametro esterno) | Mondo Strumenti di precisione | 1B150F-4 | Espulsione pipetta Dye | |||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | Per il caricamento colorante in pipetta | |||||
| Micromanipolatore | Sutter Instruments | MP-285 | Per posizionare pipetta | |||||
| Pressione a impulsi | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | Per pressione di iniezione del colorante | |||||
| Single-cell elettroporatore | Molecular Devices | Axoporator 800A | Per elettroporazione del colorante | |||||
| 3. Intrinseca imaging | ||||||||
| Obiettivo 4x (0,13 NA, 17 mm WD) | Olimpo | UPLFLN4X | ||||||
| Intrinseca hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software viene utilizzato per l'imaging episodica | |||||
| CCD | Adimec | Adimec-1000 | ||||||
| Luce sorgente di alimentazione | KEPCO | ATE 15-15M | ||||||
| Sorgente di luce | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | L'intensità della luce sulla superficie corticale di 3-5 mW | |||||
| Filtro verde (per l'immagine vascolare) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (banda passante 30 nm) | Per un'immagine di riferimento di vascolarizzazione superficiale | |||||
| Filtro rosso (per segnale intrinseco) | Ottica Imaging Inc. | λ = 630 nm (banda passante 30 nm) | Per raccogliere segnali intrinseci | |||||
| Calore filtro | Optical Imaging Inc. | KG-1 | ||||||
| 4. Due-fotone rig / immagini | ||||||||
| Microscopio a due fotoni e software | Prairie Technologies | Vedi Shen et al. 2012 per percorso della luce, filtri e potenza del laser | ||||||
| Ti: zaffiro laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | ||||||
| 20x (0,5 NA; 3,5 millimetri WD) | Olimpo | UMPLFLN20X | 0,5 obiettivo NA viene utilizzata solo per l'allineamento pipetta sul craniotomia (non per l'imaging due fotoni) | |||||
| 20x (1,0 NA; 2,0 millimetri WD) | Olimpo | XLUMPLFLN20X | ||||||
| 40x (0,8 NA; 3,3 millimetri WD) | Olimpo | LUMPLFLN40X/IR | ||||||
| Air tavolo | Newport | ST-200 | Isola preparazione da vibrazioni esterne | |||||
| xy fase | Mike Machine Co. (Attleboro, MA) | Soggetto sperimentale e micromanipolatore Sutter posto sul palco xy | ||||||
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Riferimenti
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of....
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Ristampe e permessi
