Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare

Sharon J. Sequeira; Elise M. Gervais; Shayoni Ray; Melinda Larsen

doi:10.3791/50060

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Articolo metodologico

Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare

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DOI:

10.3791/50060

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28 gennaio 2013

Sharon J. Sequeira^*¹ , Elise M. Gervais^*¹ , Shayoni Ray¹ , Melinda Larsen¹

¹Department of Biological Sciences, University at Albany, SUNY

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Una tecnica per manipolare geneticamente le cellule epiteliali in tutta Ex vivo Embrionali di topo in coltura ghiandole sottomandibolari (SMG) con il trasferimento del gene virale è descritto. Questo metodo sfrutta la capacità innata di SMG epitelio e mesenchima di ricombinare spontaneamente dopo la separazione e l'infezione dei rudimenti epiteliali con vettori adenovirali.

Abstract

Branching morfogenesi avviene durante lo sviluppo di molti organi, e l'embrione ghiandola sottomandibolare mouse (SMG) è un modello classico per lo studio di branching morfogenesi. Nel SMG sviluppo, questo processo comporta fasi iterative di gemma epiteliale e formazione condotto, per dare infine origine a una complessa rete ramificata di acini e condotti, che servono per produrre e modificare / trasportare la saliva, rispettivamente, nella cavità orale ^{1 - 3.} Il epiteliale associata membrana basale e aspetti del compartimento mesenchimale, comprese le cellule mesenchimali, fattori di crescita e la matrice extracellulare, prodotti da queste cellule, sono fondamentali per il meccanismo di ramificazione, anche se come gli eventi cellulari e molecolari sono coordinate rimane poco compresa ⁴ . Lo studio dei meccanismi molecolari di guida anticipi morfogenesi epiteliali la nostra comprensione dei meccanismi di sviluppo e permette di comprendere meglio possibile rigeapprocci di medicina ative. Tali studi sono stati ostacolati a causa della mancanza di metodi efficaci per la manipolazione genetica dell'epitelio salivare. Attualmente, trasduzione adenovirale rappresenta il metodo più efficace per il targeting cellule epiteliali in ghiandole adulti in vivo ^5. Tuttavia, in espianti embrionali, mesenchima denso e la membrana basale che circonda le cellule epiteliali ostacolo all'accesso virale alle cellule epiteliali. Se il mesenchima viene rimosso, l'epitelio possono essere trasfettate con adenovirus, e può riprendere rudimenti epiteliali branching morfogenesi in presenza di Matrigel o laminina-111 ^6,7. Mesenchima-free crescita epiteliale rudimento richiede anche una ulteriore integrazione con fattori di crescita solubili e non pienamente ricapitolare morfogenesi ramificazione come si verifica in ghiandole intatti ^8. Qui si descrive una tecnica che facilita adenovirale trasduzione delle cellule epiteliali e la cultura del e transfettatepithelium con mesenchima associati. Dopo microdissezione dei fucili mitragliatori embrionali, la rimozione del mesenchima, e l'infezione virale dell'epitelio con una GFP contenente adenovirus, si dimostra che l'epitelio ricombina spontaneamente con mesenchima non infetti, ricapitolando intatta la struttura ghiandolare SMG e la ramificazione morfogenesi. La popolazione geneticamente modificato delle cellule epiteliali possono essere facilmente monitorato con metodi standard di microscopia a fluorescenza, fluorescenza se-tagged costrutti adenovirali sono utilizzati. Il metodo di ricombinazione tessuto descritto è attualmente il metodo più efficace ed accessibile per la trasfezione di cellule epiteliali con un vettore wild-type o mutanti all'interno di un costrutto complesso tessuto 3D che non richiede la generazione di animali transgenici.

Protocollo

Il protocollo prevede quattro fasi principali, come illustrato nella Figura 1. Tutti i passaggi sono descritti in dettaglio. Costruzione adenovirus e purificazione virale deve essere fatto prima della raccolta di organi per l'uso nella trasduzione genetica di sezionati rudimenti epiteliali. Tutti gli standard di BSL-2 misure di sicurezza devono essere seguite quando si lavora con adenovirus.

1. Embrionali di topo sottomandibolare Gland (SMG) Raccolta e Microdissection

Eutanasia topi di sesso femminile a tempo-in stato di gravidanza (ceppo consanguinei CD-1 o ICR) con emissioni di CO ₂ narcosi, seguita da dislocazione cervicale e archi raccolta di embrioni di topo al giorno embrionale 13 (E13, 3-5 gemme epiteliali) seguenti procedure approvate dal IACUC istituzionale comitato. Il giorno della scoperta tappo vaginale è designato come E0. Ghiandole salivari possono essere raccolte e coltivate nella fase E12 quando vi è un singolo germoglio primario e gambo con fessure iniziandoper iniziare. SMGs prima di questa fase, richiedono condizioni di coltura diverse da quelle indicate.
Trasferire stringhe embrioni in sterili 10 piatti tessuto centimetri coltura riempite con 25 ml di DMEM / Ham 's Medio F12 (F12) manca rosso fenolo (Life Technologies), integrato con 100 U / ml di penicillina, e 100 pg / ml di streptomicina (pen-strep, Life Technologies).
Usando un bisturi sterile (# 11 pale) e pinza (# 5, Strumenti scientifici Arti, 11252-20), rimuovere gli embrioni dalle sacche in una separata 10 portata cm contenente 25 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco.
Sever le teste di embrioni con un taglio angolato appena sotto la mascella inferiore.
Isolare le mandibole inferiori dalle teste sotto un microscopio da dissezione stereo con una base di luce trasmessa (Nikon SMZ645 o equivalente) con un taglio sotto la mascella superiore. Posizionare i tessuti sopra un ulteriore pezzo di vetro piuttosto che direttamente sul componente in vetro della base del microscopio.
Raccogliere le mandibole inferiori in 3 ml di DMEM/F12 + pen-strep in una piastra da 35 sterile cultura del tessuto mm.
Una fetta mandibola sulla scena microscopio da dissezione modo che la linguetta è sul fondo della fetta, ma è rivolta verso la posizione 12:00.
Utilizzando un lato due pinze incrociate in un movimento a forbice, rimuovere ed eliminare il ^rd 1/3 inferiore della fetta mandibola.
Ruotare di 90 ° sezione a destra (se la mano destra) e, con un taglio a forbice con le pinze, tagliare la parte superiore della fetta mandibola (senza il taglio della lingua) a metà strada nella fetta.
Sbucciare il tessuto in eccesso e rimuoverlo per esporre i fucili mitragliatori sotto. Ci sarà uno su ciascun lato vicino alla base della lingua.
Usando un paio di pinze a tenere premuto il tessuto con la lingua, usare il forcipe altri a prendere in giro la SMG di distanza dalla lingua. Ripetere l'operazione per la ghiandola altro.
Raccogliere le ghiandole salivari microdissezione in 3 ml di DMEM/F12 + pen-strep in un nuovo tessuto sterile 35 millimetricultura piatto. Nota: le ghiandole sottomandibolari più grandi (3-5 gemme epiteliali) insieme al più piccolo collegato ghiandola sublinguale (1 auricolari) possono essere coltivate intatto saltando al punto 4 ed eseguito le fasi 4.1, 4.3, e 4.4, come descritto in precedenza ^2,8.

2. SMG separazione epiteliale Rudiment

Posto 5 (o più) ghiandole salivari in un fondo di vetro, diametro 50 mm micropozzetti piatto (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) contenente 200 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS privo di Ca ^{+ +} e Mg ^{+ +,} Life Technologies) contenente 0,4% (v / v) dispasi (Life Technologies, cat. no. 17.105-041) e incubare per 15 min a 37 ° C.
Dopo l'incubazione, utilizzando una sterile 200 microlitri punta della pipetta, aspirare accuratamente la soluzione dispasi senza disturbare le ghiandole. Immediatamente aggiungere 200 microlitri di DMEM/F12 supporto contenente 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pre-sterilizzati con un filtro di 0,22 micron) per neutralizzare l'dispasi.
Sotto un microscopio da dissezione, usando un paio di pinze con le punte fini (# 5 Dumostar, Strumenti scientifici Arti, 11295-20), separare delicatamente il mesenchima allentato intorno ai germogli SMG epiteliali e condotti, avendo cura di lasciare l'epitelio intatto .
Pre-wet una sterile 200 ml con puntale DMEM/F12-BSA media e pipettare delicatamente i rudimenti epiteliali in un nuovo piatto di 50 mm di diametro pozzetto contenente 200 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. Utilizzare una punta di alta qualità 200 microlitri pipetta con un bordo liscio.
Nel piatto che contiene i pezzi mesenchima, scartare qualsiasi non-tessuto mesenchimale comprese le ghiandole sublinguali e le gemme staccate ghiandola sottomandibolare.

3. L'infezione adenovirale di Rudimenti epiteliali

Marca 200 pl di supporti infezione virale diluendo l'adenovirus di interesse in DMEM/F12 + pen-strep in una provetta da microcentrifuga modo che il titolo della soluzione risultante è 1x10 ⁸ -10 ⁹ PFUs. Iltitolo ottimale necessaria per diversi virus possono variare. È importante usare cloruro di cesio (CsCl)-preparazioni purificate virali per efficienza assorbimento ottimale.
Rimuovere il supporto dal piatto contenente i cinque rudimenti epiteliali. Rapidamente aggiungere 200 microlitri di media infezione, mantenendo i rudimenti sempre umida. Prendere le necessarie precauzioni nel maneggiare il virus e lo smaltimento dei puntali contaminati. Disinfettare eventuali virus superfici contaminate con soluzione di candeggina al 10%.
Spostare i rudimenti epiteliali lontani l'uno dall'altro con una pinza per evitare che si attacchino e consentire loro di depositarsi sul fondo della piastra. Incubare rudimenti in media virali per 1 ora a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, separare i rudimenti, se si muovono vicini. Dondolo eccessivo o movimento permetterà le ghiandole ad ammassarsi.
Dopo l'incubazione, rimuovere delicatamente le virali contenenti i media ed eliminare in modo appropriato, facendo attenzione a non disturbare il rudiments. Aggiungere 200 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. Ripetere il lavaggio almeno altre due volte e sostituirlo con 200 ml di DMEM/F12 + pen-strep media. I lavaggi sono fondamentali per rimuovere eventuali virus che non è fortemente collegato al epitelio e per prevenire l'infezione del mesenchima.
Incubare rudimenti epiteliali con 200 ml di DMEM/F12 contenente 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356.231) per 20 min. Troviamo che questo breve incubazione in Matrigel minimizza la regressione di fessure esistenti durante il periodo di coltura iniziale, ma questo passaggio può essere omesso se l'esposizione a Matrigel non è desiderato.

4. Ex vivo di cultura fucili mitragliatori ricombinato

Posizionare ogni rudimento, uno alla volta, utilizzando un pre-wet 200 microlitri punta della pipetta, sopra un intaglio (piccolo taglio) 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch membrana filtro (Whatman) galleggianti su 200 microlitri di terreni di coltura ( 5 rudimenti / filtro) in un fondo di vetro per micropiastre. La cultura dei mediaè: DMEM/F12 + pen-strep contenente 50 ug / ml di transferrina e 150 ug / ml di acido ascorbico, come precedentemente descritto ^2,8. La transferrina è noto per stimolare la sopravvivenza e la ramificazione morfogenesi delle ghiandole salivari e espianti di organi di altri ^9. Aggiunta di acido ascorbico è stato mostrato per stimolare SMG ramificazione. ¹⁰ E 'noto per agire come cofattore in molte reazioni di idrossilazione di vie metaboliche (come idrossilazione prolina durante la formazione di fibre collagene ¹¹⁾ e stimola anche la produzione di fibronectina e laminina in espianti altri organi ^12.
Rimuovere come media molto sulla parte superiore del filtro possibile dopo l'aggiunta di ogni rudimento epiteliale. Quantità eccessiva di supporti sulla parte superiore del filtro può causare il filtro di affondare, mentre meno dei media, rende il posizionamento dei rudimenti e mesenchima molto più facile. Supporti in eccesso può essere rimosso o con una pipetta o utilizzando pinze per afferrare il materiale tra le punte.
Luogo pezzi mesenchima derivato from 3-4 ghiandole sulla parte superiore e / o intorno ad ogni rudimento epiteliale. Rimuovere eventuali supporti aggiuntivi che circonda le ghiandole per evitare movimenti del mesenchima lontano dai rudimenti. Mesenchima deriva dal più ghiandole non è utile ma meno può essere dannoso per la crescita epiteliale rudimento.
Incubare SMGs ricombinati in un incubatore umidificato (95% aria / 5% CO ₂₎ a 37 ° C per 48 -72 ore, come desiderato.
Acquisire campo chiaro e / o immagini fluorescenti di ghiandole in scena a 0 ore (se lo si desidera), 2 ore dopo la ricombinazione e ogni 24 ore in seguito con microscopio ottico invertito, in posizione verticale, o stereo dotato di una fotocamera digitale con un obiettivo di ingrandimento 4X o 5X per catturare l'intera ghiandola ricombinato in un singolo fotogramma di vista. Immagini della ghiandola salivare mostrano il miglior contrasto utilizzando l'impostazione campo chiaro o l'anello di fase eventualmente montata un certo punto del percorso della luce (che non è possibile a completamente automatizzati microscopi). Contrasto di fase standard non èt necessario poiché la ghiandola è spesso e crea contrasto.
I desiderati punti temporali, SMGs ricombinati possono essere fissate per 20 minuti con soluzione fissativa realizzati 2% paraformaldeide (PFA) in 1X PBS contenente 5% (w / v) di saccarosio (per preservare meglio la struttura cellulare interna, mantenendo le cellule in uno stato isosmotic). Diversamente 4% PFA, 2% PFA manterrà una quantità significativa del segnale GFP se il fissativo è completamente rimosso dopo fissazione. Le ghiandole possono essere conservati per un massimo di 1 settimana in 1X PBS al buio a 4 ° C fino intera immunocitochimica montaggio e di imaging confocale viene eseguita, come riportato precedentemente ^3,6,13-15. Idealmente, immunocitochimica e di imaging deve essere eseguita subito dopo la fissazione per ottenere le migliori immagini. Ghiandole possono anche essere lisate in tampone RIPA per SDS-PAGE seguita da Western blotting.