Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare

Sommario

Una tecnica per manipolare geneticamente le cellule epiteliali in tutta Ex vivo Embrionali di topo in coltura ghiandole sottomandibolari (SMG) con il trasferimento del gene virale è descritto. Questo metodo sfrutta la capacità innata di SMG epitelio e mesenchima di ricombinare spontaneamente dopo la separazione e l'infezione dei rudimenti epiteliali con vettori adenovirali.

Abstract

Branching morfogenesi avviene durante lo sviluppo di molti organi, e l'embrione ghiandola sottomandibolare mouse (SMG) è un modello classico per lo studio di branching morfogenesi. Nel SMG sviluppo, questo processo comporta fasi iterative di gemma epiteliale e formazione condotto, per dare infine origine a una complessa rete ramificata di acini e condotti, che servono per produrre e modificare / trasportare la saliva, rispettivamente, nella cavità orale ^{1 - 3.} Il epiteliale associata membrana basale e aspetti del compartimento mesenchimale, comprese le cellule mesenchimali, fattori di crescita e la matrice extracellulare, prodotti da queste cellule, sono fondamentali per il meccanismo di ramificazione, anche se come gli eventi cellulari e molecolari sono coordinate rimane poco compresa ⁴ . Lo studio dei meccanismi molecolari di guida anticipi morfogenesi epiteliali la nostra comprensione dei meccanismi di sviluppo e permette di comprendere meglio possibile rigeapprocci di medicina ative. Tali studi sono stati ostacolati a causa della mancanza di metodi efficaci per la manipolazione genetica dell'epitelio salivare. Attualmente, trasduzione adenovirale rappresenta il metodo più efficace per il targeting cellule epiteliali in ghiandole adulti in vivo ^5. Tuttavia, in espianti embrionali, mesenchima denso e la membrana basale che circonda le cellule epiteliali ostacolo all'accesso virale alle cellule epiteliali. Se il mesenchima viene rimosso, l'epitelio possono essere trasfettate con adenovirus, e può riprendere rudimenti epiteliali branching morfogenesi in presenza di Matrigel o laminina-111 ^6,7. Mesenchima-free crescita epiteliale rudimento richiede anche una ulteriore integrazione con fattori di crescita solubili e non pienamente ricapitolare morfogenesi ramificazione come si verifica in ghiandole intatti ^8. Qui si descrive una tecnica che facilita adenovirale trasduzione delle cellule epiteliali e la cultura del e transfettatepithelium con mesenchima associati. Dopo microdissezione dei fucili mitragliatori embrionali, la rimozione del mesenchima, e l'infezione virale dell'epitelio con una GFP contenente adenovirus, si dimostra che l'epitelio ricombina spontaneamente con mesenchima non infetti, ricapitolando intatta la struttura ghiandolare SMG e la ramificazione morfogenesi. La popolazione geneticamente modificato delle cellule epiteliali possono essere facilmente monitorato con metodi standard di microscopia a fluorescenza, fluorescenza se-tagged costrutti adenovirali sono utilizzati. Il metodo di ricombinazione tessuto descritto è attualmente il metodo più efficace ed accessibile per la trasfezione di cellule epiteliali con un vettore wild-type o mutanti all'interno di un costrutto complesso tessuto 3D che non richiede la generazione di animali transgenici.

Protocollo

Il protocollo prevede quattro fasi principali, come illustrato nella Figura 1. Tutti i passaggi sono descritti in dettaglio. Costruzione adenovirus e purificazione virale deve essere fatto prima della raccolta di organi per l'uso nella trasduzione genetica di sezionati rudimenti epiteliali. Tutti gli standard di BSL-2 misure di sicurezza devono essere seguite quando si lavora con adenovirus.

1. Embrionali di topo sottomandibolare Gland (SMG) Raccolta e Microdissection

1. Eutanasia topi di sesso femminile a tempo-in stato di gravidanza (ceppo consanguinei CD-1 o ICR) con emissioni di CO ₂ narcosi, se....

Risultati

Il flusso delle fasi principali sperimentali è descritto nella Figura 1. Un esempio di un SMG intatto, un rudimento isolato epiteliale, e il mesenchima corrispondenti sono mostrati nella Figura 2. Immagini brightfield di SMGs ricombinati, che continuano a subire branching morfogenesi quando coltivate ex vivo per i tempi riportati, sono mostrati in Figura 3. Ghiandole ricombinati coltivate per 48 ore esprimere GFP epiteliale sono mostrati in Figura 4.

Discussione

L'ex vivo epitelio-mesenchimale tecnica di ricombinazione è stato pubblicato per la sottomandibolare ghiandole salivari nel 1981 ^16. In questo protocollo, si ampliano il metodo originale, usando l'infezione adenovirale per manipolare cellule epiteliali espressione genica nel contesto di una ghiandola ricombinato. Abbiamo dimostrato che una percentuale delle cellule epiteliali sono infettati con l'adenovirus, mentre la percentuale di cellule che sono infettate dipende dalle proprietà del p.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM / Ham 's F12 americano senza rosso fenolo	Life Technologies	21041-025
Penicillina e streptomicina	Life Technologies	15070-163	Magazzino 10X
Dispasi	Life Technologies	17105-041	Congelare aliquote monouso a-20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Frazione V, endotossine basso
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Dovrebbe essere alto titolo (1x10 10 pfu / ml). CsCl virus purificate sono più efficaci di virus purificato su colonna in questo saggio.
16% paraformaldeide	Scienze della microscopia elettronica	15710	Diluita al 2% in PBS con 5% di saccarosio (w / v)
1X tampone fosfato salino (PBS)	Life Technologies	70011-044	Preparato da stock 10X
Sale di Hank soluzione equilibrata	Life Technologies	14175095	no Calcio, Magnesio no, no rosso fenolo
Transferrina	Sigma	T8158	25 mg / ml di soluzione in magazzino DMEM/F12 media. Congelare monouso aliquote a-20C
Acido L-ascorbico (vitamina C)	Sigma	A4403	75 mg / ml di soluzione concentrata in DMEM/F12 media.Freeze monouso aliquote a-20C
			Tabella 1. Elenco dei reagenti necessari per SMG protocollo ricombinazione.
10 piatti centimetri plastica sterili	Corning	430167	Piastre di coltura di tessuti-non-trattata può anche essere usato.
Stereo microscopio da dissezione con base a luce trasmessa	Nikon	SMZ645	Ogni dissezione stereo microscopio può essere utilizzato che ha una base a luce trasmessa.
35 millimetri di tessuto di coltura piatti	Falco	353001	Piastre di coltura di tessuti-non-trattata può anche essere usato.
Diametro 50 mm micropozzetti piatti	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch filtri a membrana	Whatman	110405	Diametro di 13 mm, 0,1 millimetri dimensione dei pori
Widefield microscopio a fluorescenza	Carl Zeiss, Stati Uniti d'America	Axio Observer Z1	Ogni microscopio a fluorescenza (in posizione verticale, inverted o stereo microscopio da dissezione) può essere utilizzato per monitorare l'espressione della GFP a basso ingrandimento con una fotocamera digitale allegata.
Microscopio confocale	Leica Microsystems	TCS SP5	Microscopia confocale è necessario vedere le strutture cellulari dettagliate. Qualsiasi microscopio confocale può essere utilizzato.
Topi di sesso femminile in stato di gravidanza, a tempo-deformazione CD-1 o ICR	Charles River Labs		Gli embrioni sono raccolti il ​​giorno 13 (con il giorno della scoperta spina designato come giorno 0).
Bisturi # 11	Strumenti Scienza Belle	10011-00
Manico bisturi # 3	Strumenti Scienza Belle	10003-12
Dumont # 5 pinze in lega di acciaio inox, 0,05 millimetri 0,02 millimetri X	Strumenti Scienza Belle	11252-20	Ideale per la raccolta di ghiandole da embrioni
Dumont # 5 forcipe dumostar lega, 0,05 millimetri 0,01 millimetri X	Strumenti Scienza Belle	11295-20	Punta fine sono necessari per la rimozione di mesenchima da epitelio. Aghi tungsteno può anche essere usato.
			Tabella 2. Apparecchiatura utilizzata nelle SMG protocollo di ricombinazione.