Imaging molecolare a Target trapiantate cellule progenitrici muscolari

Kelly Gutpell; Rebecca McGirr; Lisa Hoffman

doi:10.3791/50119

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Articolo metodologico

Imaging molecolare a Target trapiantate cellule progenitrici muscolari

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DOI:

10.3791/50119

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27 marzo 2013

Kelly Gutpell¹^,² , Rebecca McGirr¹ , Lisa Hoffman¹^,²^,³

¹Imaging Program, Lawson Health Research Institute, ²Department of Anatomy and Cell Biology, Western University, ³Department of Medical Biophysics, Western University

In questo articolo

Sommario

A mezzi non invasivi per valutare il successo del trapianto di mioblasti è descritto. Il metodo si avvale di un gene reporter di fusione unificato composto da geni la cui espressione può essere ripreso con differenti modalità di imaging. Qui, si fa uso di un Fluttuazioni Sequenza del gene reporter per colpire le cellule tramite l'imaging bioluminescenza.

Abstract

Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una grave malattia genetica neuromuscolare che colpisce 1 su 3.500 maschi, ed è caratterizzata da degenerazione muscolare progressiva ^{1, 2.} In pazienti, la capacità delle cellule satelliti muscolari residenti (SC) per rigenerare miofibre danneggiate diventa sempre più inefficiente ^4. Pertanto, il trapianto di cellule progenitrici muscolari (PPM) / mioblasti in soggetti sani è un approccio terapeutico promettente per DMD. Una limitazione importante per l'uso di cellule staminali terapia, tuttavia, è una mancanza di tecnologie di imaging affidabili per il monitoraggio a lungo termine di cellule impiantate, e per valutare la sua efficacia. Qui, descriviamo un non-invasiva, in tempo reale approccio per valutare il successo del trapianto di mioblasti. Questo metodo si avvale di un gene reporter di fusione unificato composto da geni (lucciola luciferasi [fluttuazioni], proteina monomerica rosso fluorescente [MRFP] e SR39 timidina chinasi [sr39tk]), il cui expression può essere ripreso con diverse modalità di imaging ^{9, 10.} Una varietà di modalità di imaging, tra cui la tomografia ad emissione di positroni (PET), emissione di singoli fotoni SPECT (tomografia computerizzata), risonanza magnetica (MRI), imaging ottico, e ad alta frequenza 3D ad ultrasuoni sono ora disponibili, ognuna con vantaggi e limiti ^11. Di imaging bioluminescenza (BLI) studi, per esempio, hanno il vantaggio di essere relativamente basso costo e ad alta produttività. E 'per questa ragione che, in questo studio, si fa uso della luciferasi di lucciola (fluc) sequenza di gene reporter contenuto all'interno del gene di fusione e di imaging bioluminescenza (BLI) per il breve termine localizzazione di mioblasti C2C12 vitali dopo l'impianto in un topo modello di DMD (distrofia muscolare sul cromosoma X [mdx] del mouse) ^12-14. Soprattutto, BLI ci fornisce un mezzo per esaminare la cinetica di PPM etichettati post-impianto, e sarà utile per monitorare le cellule ripetutamente time e migrazione seguente. Il nostro approccio gene reporter, inoltre, ci permette di unire diverse modalità di imaging in un unico soggetto vivente, data la natura tomografica, fine risoluzione spaziale e la capacità di scalare fino a più grandi animali ed esseri umani ^10,11, PET costituirà la base del lavoro futuro che abbiamo suggeriscono può facilitare la traduzione rapida di metodi sviluppati nelle cellule ai modelli preclinici e alle applicazioni cliniche.

Protocollo

1. Mantenimento e la moltiplicazione di mioblasti C2C12

Piastra mioblasti C2C12 in un pallone da ² cm 75 e mantenere le cellule in siero elevato glucosio Dulbecco Modified Eagle (HG-DMEM) supplementato con siero fetale bovino (FBS) ad una concentrazione finale del 10%. Non permettere alle cellule di confluire in qualsiasi momento, in quanto ciò riducono la popolazione myoblastic. Terreno deve essere cambiato ogni altro giorno Nota:. Media sempre calda a 37 ° C in un bagno di acqua prima dell'uso.
Quando mioblasti diventano circa l'80% confluenti, le cellule di passaggio a un nuovo pallone. Aspirare il terreno di coltura. Lavare le cellule con la soluzione di 4-5 ml Sale Hanks Balanced (HBSS) per rimuovere tutte le tracce di terreno di coltura, che contiene tripsina-inibizione siero. Sciacquare brevemente strato di cellule con 2-3 ml 0,25% (w / v) di tripsina-EDTA soluzione di dissociare i mioblasti aderenti nel matraccio. Aspirare tripsina e pallone posto in incubatore a 37 ° C per 5 min.
Durante questa incubazionezione, preparare un pallone nuovo con 9 ml di terreno HG-DMEM/10% FBS. Dopo tripsinizzazione, aggiungere 10 ml di terreno completo alle cellule e pipetta 4-5 volte per assicurare la raccolta di tutte le cellule nel mezzo. Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare al pallone nuovo e incubare in 5% CO ₂ a 37 ° C.

2. C2C12 cellulare Transfection

Una volta che le cellule hanno raggiunto il 50% di confluenza, trasfettare secondo le istruzioni del produttore da Invitrogen. In breve, unire 90 microlitri Lipofectamine 2000 reagente con 4,5 ml OPTI-MEM. In un altro tubo, unire 36 mg CMV-DNA trifusion gene reporter con 4,5 ml di OPTI-MEM. Flick ogni tubo di combinare ed attendere 5 min. Combinare contenuto di entrambe le provette, mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Nota: Un pallone secondo dovrebbe anche essere impostato per cellule non trasfettate che solo ricevere Lipofectamine e OPTI-MEM per servire come controllo negativo.
Estrarre il supporto di cellule C2C12 e aggiungere 15,5ml di terreno fresco HG-DMEM/10% FBS. Aggiungere mezzo trasfezione per portare il volume totale di 20 ml.
Permettere alle cellule di trasfettare notte per almeno 20 ore a 37 ° C.
Il giorno dopo, aspirare media trasfezione e aggiungere 10 ml di HG-DMEM/10% FBS.
Guarda le cellule sotto un microscopio invertito a fluorescenza. Capture sia in campo chiaro e rosso immagini di fluorescenza (utilizzando un cubo TRITC filtro; MRFP ex / em: 584/607 nm). Contare il numero di cellule che esprimono RFP-visti in fluorescenza diviso per il numero totale di cellule viste al campo chiaro per più campi di immagine per generare efficienza di trasfezione.

3. Valutazione della sopravvivenza cellulare / MTT test

Un giorno prima della transfezione, piastra 1x10 ⁵ cellule C2C12 in ciascun pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Cellule devono essere placcato in 500 volumi microlitri HG-DMEM/10% FBS.
Giorno successivo, mioblasti trasfezione overnight come precedentemente descritto. Segui i suggerimenti del produttore per la trasfezione Reagenvolumi t per 24 pozzetti. Incubare una serie di pozzi con Lipofectamine solo (senza DNA) come controllo. Guarda cellule sotto fluorescenza per garantire che la transfezione corretta è verificato.
Rimuovere medie trasfezione e mioblasti incubare con 5 mg / ml tiazolil blu tetrazolio bromuro (MTT) in HG-DMEM/10% FBS. Aggiungere D-luciferina a otto dei pozzi trasfettate, e incubare a 37 ° C per quattro ore.
Estrarre il supporto da pozzi. Solubilizzare cristalli blu formazano aggiungendo 180 microlitri isopropanolo a ciascun pozzetto. Agitare a 37 ° C per 15 min.
Evitando ogni soluzione pipetta precipitato in una piastra a 96 pozzetti e leggere l'assorbanza a 575 nm.

4. Preparazione di mioblasti per il trapianto

Estrarre il supporto, lavare con HBSS mioblasti, cellule e Tripsinizzare come indicato al punto 1.1.
Risospendere le cellule in 4 ml di mezzo completo.
Utilizzando un emocitometro, contare le cellule per generare volumi contenenti 10 ⁶ mioblasti. Pipettare volume in sterili microprovette 1,5 ml. Con una efficienza di trasfezione di ~ 10%, questi valori indicano che 100.000 luciferasi-esprimenti cellule sono rilevabili sullo scanner GE ExploreOptix dopo trapianto.
Raggiungere un volume finale di iniezione di 15 microlitri, contenente 10 ⁶ cellule C2C12. Se necessario, centrifugare microprovette a 2.000 rpm per un minuto. Aspirare accuratamente il surnatante con una pipetta. Risospendere le cellule in 15 ml di HG-DMEM privo FBS.

5. Cella impianto

Anestetizzare il mouse con il 2% isoflurano / 2% O _2. Pluck capelli dalla zona dorsale degli arti posteriori. Mantenere l'anestesia al 1,5% isoflurano / 2% O _2.
Assicurarsi mioblasti C2C12 sono ben sospese. Con il mouse in posizione prona, estendere l'arto posteriore e utilizzare una siringa da insulina iniettare le cellule direttamente nella testa laterale del muscolo gastrocnemio con un angolo di 30 °. Iniettare mioblasti trasfettati nella parte posteriore destra e non trasfettate int mioblastio controlaterale (a sinistra) degli arti posteriori.
Eseguire una scansione bioluminescenza di base: Trasferisci velocemente i mouse fase della scanner ottico, che il mouse in posizione prona. Collegare la linea di anestetico. Al fine di garantire il mouse rimane anestetizzato, una seconda persona dovrebbe essere presente per collegare la linea di anestetico, mentre gli altri posti l'animale nello scanner.
Delicatamente estendere l'arto posteriore quindi la zona di iniezione è visibile. Arti posteriori nastro in posizione con un adesivo delicato come nastro medico.
Chiudere la camera e garantire che nessuna luce può accedere all'interno dello scanner, in quanto ciò aumenterà il segnale di fondo rilevato. Lo scanner deve essere impostata su parametri inclusi nelle istruzioni del produttore per l'imaging bioluminescenza. In particolare, garantire la "non laser" sia selezionata.
Disegnare una regione di interesse (ROI) intorno alla zona a pizzico e la scansione iniziale.

6. Iniezione di substrato Fluc, D-luciferina, nel topo mdx

Mentre il mouse è intraperitoneale anestetizzati iniettare 150 mg / kg di substrato lucciola luciferasi, D-luciferina (da 40 mg / ml di soluzione concentrata, costituita secondo le istruzioni del produttore).
Recuperare mouse e consentire un periodo di 15 minuti prima di preparare l'assorbimento del mouse per la scansione successiva.

7. BLI a Target Luc-esprimono PPM dopo l'impianto in modelli murini di DMD

Dopo il periodo di assorbimento, anestetizzare mouse di nuovo, come descritto al punto 5.1.
Trasferire il mouse sullo scanner ottico ed eseguire un'altra scansione bioluminescenza nello stesso modo della scansione sfondo.
Anche se un periodo di 20 min assorbimento dovrebbe fornire la massima intensità del segnale, una successiva scansione può essere eseguita.
Al termine di acquisizione delle immagini, sacrificare il mouse secondo le linee guida stabilite dal Comitato Etico Istituzionale degli animali e il Canadian Council on Animal Care (CCAC). Isolare dei muscoli degli arti posteriori e posto immediatamente in formalina al 10% per fissare per incastro paraffina. Eseguire la colorazione immunoistochimica per la luciferasi per confermare l'iniezione intramuscolare di mioblasti.