Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Summary

Acquose due sistemi monofase sono stati usati per simultaneamente popolazioni modello multiple di cellule. Questo metodo semplice e veloce per patterning cellulare sfrutta la fase di separazione di soluzioni acquose di destrano e polietilene glicole e la tensione interfacciale che esiste tra le due soluzioni polimeriche.

Abstract

Tecnologie di patterning cellulari che sono veloci, facili da usare e conveniente sarà necessario per il futuro sviluppo di saggi cellulari di throughput elevati, piattaforme per lo studio di interazioni cellula-cellula e sistemi di ingegneria tessutale. Questo protocollo dettagliato descrive un metodo per generare co-colture di cellule utilizzando soluzioni biocompatibili di destrano (DEX) e polietilene glicole (PEG) che di fase separata quando combinato sopra concentrazioni soglia. Cellule può essere modellato in una varietà di configurazioni con questo metodo. Esclusione patterning cella può essere eseguita stampando goccioline di DEX su un substrato e rivestimento con una soluzione di cellule contenenti PEG. La tensione interfacciale formato tra le due soluzioni polimeriche induce le cellule a diminuire verso l'esterno della goccia DEX e formare una radura circolare che può essere utilizzata per i saggi di migrazione. Isole di cellule può essere modellato erogando una cellula fase ricca DEX in una soluzione di PEG o coprendo il DEXgoccia con una soluzione di PEG. Co-colture possono essere formati direttamente dalla combinazione di esclusione delle cellule con patterning DEX isola. Questi metodi sono compatibili con una varietà di approcci manipolazione di liquidi, inclusi micropipetting manuale, e può essere utilizzato con qualsiasi tipo di cellule aderenti.

Introduction

Acquose di due sistemi monofase (ATPSs) forma quando le soluzioni di due polimeri incompatibili sono miscelati assieme a concentrazioni sufficientemente elevate. Separazione di fase è influenzata da una varietà di fattori che includono il peso molecolare e la polarità dei polimeri, temperatura, pH e soluzioni contenuto ionico del solvente acquoso ^{1, 2.} Il punto in cui viene determinato le due soluzioni di polimeri distinte dalle proprietà fisico del sistema fase prescelto, ma generalmente avviene a basse concentrazioni di polimero (meno del 20% peso / peso) sotto condizioni non denaturanti, permettendo ATPSs da utilizzare per la biotecnologia applicazioni ^3-9.

Di gran lunga i più studiati ATPS è il polietilene glicole (PEG) / destrano (DEX) sistema. Le ATPS formati da questi polimeri economici e biocompatibile è stato originariamente descritto per la purificazione di biomolecole mediante partizionamento molecolare ^{2, 10.} Partizionamentosi verifica quando le molecole aggiuntive o particelle che non contribuiscono al sistema di fase sono mescolati con PEG e DEX. Sulla base delle loro affinità relative sia per DEX o PEG, le molecole o le particelle sarà preferenzialmente trovarsi all'interno di una delle due fasi o all'interfaccia. Un'altra proprietà della PEG / DEX ATPS è l'esistenza di tensione interfacciale tra le due fasi polimeriche. ATPSs formate da PEG e DEX mostrano generalmente tensioni interfacciali che sono molto più basso rispetto agli altri liquido-liquido a due fasi di sistemi come l'olio e l'acqua, ma le forze di tensione di interfaccia ancora esercitare effetti su particelle di piccole dimensioni come i virus, le cellule e aggregati proteici ^{2 , 11-13.} Infine, poiché il peso molecolare più elevato e PEG DEX separato a basse concentrazioni (meno del 5% peso / peso di alta varietà polimeri peso molecolare) in presenza di concentrazioni fisiologiche di sali, ci sono pochi eventuali effetti deleteri sulle cellule di mammifero incorporato in questi sistemi^14-16.

Recentemente, le proprietà interfacciali e gli effetti di partizionamento ATPSs sono stati applicati dal nostro laboratorio per patterning cella ^{14, 16-20.} Ciò è stato realizzato micropatterning una soluzione densa DEX su substrati di coltura cellulare in presenza di PEG. Quando le cellule sono incorporati nella fase di PEG, sono escluse le goccioline di entrare DEX causa di PEG / DEX tensione interfacciale ^20. Quando le cellule sono modellati in fase di DEX, che vengono trattenuti sulla superficie del substrato di coltura cellulare da tensione interfacciale e partizionamento ^{16, 17, 19.}

A differenza di altri metodi di patterning cellulare, patterning cellulare ATPS è facile da imparare e richiede solo una conoscenza rudimentale sugli stessi polimeri, e la possibilità di effettuare la coltura cellulare e utilizzare una micropipetta. Altri metodi per patterning cellulare spesso coinvolgono attrezzature specializzate e di formazione che non sono facilmente tradotto in the scienze della vita. Ad esempio, alcuni metodi (microcontact stampa o stampa a getto d'inchiostro) cellule reticolo indirettamente applicando modelli di biomolecole adesive cellulari ad un substrato cultura che successivamente servire come siti per attaccamento cellulare ^{21, 22.} Sebbene approcci indiretti sono utili per alcuni tipi di cellule, che richiedono un alto grado di abilità dell'utente e attrezzature specializzate per fabbricare lo strumento patterning, e può mancano di specificità a seconda del particolare tipo di cellula / biomolecola pattern. In alternativa, le cellule possono essere depositati presso specificità modello alto per mezzo di approcci diretti patterning che includono flusso laminare patterning, stencil e la stampa a getto d'inchiostro ^23-26. Tuttavia, queste tecniche richiedono anche competenze dell'utente e attrezzature specializzate, e può danneggiare le cellule durante il processo di stampa. Sebbene questi approcci generalmente producono schemi precisi di cellule, per patterning cella per essere un utile strumento nelle scienze della vita, deve essere conveniente unand semplice da implementare.

Qui riportiamo un protocollo dettagliato per la generazione di colture cellulari a motivi geometrici utilizzando le ATPSs descritti nelle nostre applicazioni precedentemente pubblicate. Utilizzando micropipettatori solo, gli utenti possono generare zone di esclusione cellulari o isole di cellule per saggi di migrazione. Questo è ottenuto per mezzo di PEG / DEX tensione interfacciale che mantiene sia le cellule in fase di DEX o esclude cellule depositati nella fase PEG da DEX. Combinando queste due patterning tecniche fondamentali, è possibile generare rapidamente co-colture di cellule quali fibroblasti cellule epatiche-co-colture. Metodi di patterning, parametri ATPS e risultati attesi sono descritti in dettaglio.

Protocol

1. Fase di caratterizzazione del sistema: soglie che determinano la separazione delle fasi

1. Preparare soluzioni contenenti PEG e DEX nel buffer desiderato o terreno di coltura cellulare come mostrato in Figura 1 (punti viola) in 15 ml o 50 ml provette coniche. D'ora in avanti, PEG e DEX farà riferimento a 35 PEG kDa e 500 kDa DEX, tuttavia, concentrazioni critiche cambierà a seconda dei due polimeri utilizzati. Registrare la massa di PEG e DEX in ciascuna soluzione. Ad alta concentrazione di soluzioni di polimeri può richiedere alcune ore per sciogliere. Vortexando può essere utilizzato per senza siero soluzioni. Per i supporti contenenti proteine ​​o siero, posizionare i tubi su un palco a dondolo fino a quando entrambi i polimeri sono completamente sciolti. Registrare il peso dei supporti utilizzati per sciogliere i polimeri e prendere atto delle concentrazioni iniziali.
2. Una volta che i polimeri sono completamente sciolti, le soluzioni dovrebbero apparire nuvoloso. Questa è la prima indicazione che si è verificata la separazione di fase. A conferma di ciò, consentire lasoluzioni polimeriche a riposo in posizione verticale a temperatura ambiente per 20 min. Centrifugazione a 1000 xg può essere utilizzato per accelerare il processo di separazione di fase. La fase di fondo più denso sarà DEX-ricchi e la fase superiore sarà PEG-ricchi.
3. Aggiungere lentamente buffer aggiuntivo o un supporto per i tubi. Piccoli incrementi dovrebbe essere usato in modo da non superamento del punto di separazione di fase.
4. Quando la soluzione diventa limpida e non più di fase dopo centrifugazione separa, la soglia per separazione di fase è stato raggiunto. Registrare il peso finale del tubo.
5. Utilizzando i pesi registrate in precedenza per i polimeri, insieme con il peso finale dopo l'aggiunta di supporto, determinare la% in peso / peso di ciascuno dei due polimeri in cui la separazione di fase non si verifica più.
6. Tracciare questi valori come% p / p PEG sulla y e% peso / peso DEX sul asse x. Questa trama, detto curva binodal, può essere utilizzato per determinare la concentrazione di soglia per la separazione di fase per Concentrati diversaons di PEG / DEX in un mezzo di coltura cellulare specifico.

2. Configurazione 1: Patterning Esclusione (formato a 96 pozzetti Plate)

1. Preparare soluzioni separate di 5,0% p / p PEG e 12,8% peso / peso DEX in mezzo di coltura cellulare. Usare soluzioni ATPS di almeno due volte il punto critico per garantire che un ATPS rimane dopo i polimeri equilibrare con rispetto all'altro. Vi è una piccola quantità di flusso di DEX nel PEG fase ricca e viceversa, pertanto, lavorando troppo vicino alla concentrazione critica può comportare la perdita di fase come sistema goccia concentrazioni sotto il punto critico. Analogamente, il trasferimento del piatto di coltura cellulare ad una umidità e temperatura controllata incubatrice può alterare le due fasi proprietà e rendere le due soluzioni miscibili. Nota: Alcune cellule potrebbero funzionare meglio con le altre formulazioni ATPS. Formulazioni accettabili possono essere selezionati in base alle curve binodal determinati dalla parte 1.
2. Raccogliere le cellule da utilizzare per l'esclusione patterning. Determinare il numero totale / concentrazione di cellule disponibili. Opzionale: marcare le cellule con CellTracker o altri non-citotossici etichette per microscopia a fluorescenza.
3. Il pellet e risospendere il pellet in un volume adeguato di 5,0% PEG per ottenere il numero desiderato di cellule di esclusione. Per esempio, un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti richiede 37.500 cellule di fibroblasti da risospese in 200 pl di PEG per produrre confluenza il giorno seguente. Scala questi numeri a seconda dei casi per altri tipi di cellule e dimensioni del substrato di coltura.
4. Utilizzando una micropipetta, dispensare 0,5 pl di goccioline DEX su un substrato secco coltura cellulare. Goccioline di volume maggiore produzione di zone di esclusione più grandi. Gocce di dimensioni variabili 0,1-1 microlitri sono raccomandati per micropatterning esclusione. Opzionale: DEX goccioline possono essere depositati 24 ore prima del tempo e lasciati disidratare a temperatura ambiente. Questo può produrre modelli più puliti.
5. Pipettare 200 ml di sospensione cellulare PEG in tegli bene a coprire le goccioline DEX.
6. Posto in un incubatore umidificato per 12 ore a 37 ° C, 5% di CO _2. Assicurarsi che il piatto non sia inclinato durante la movimentazione e che sia posizionato su una mensola livello incubatore per evitare di interrompere i modelli.
7. Rimuovere la soluzione di PEG e lavare tre volte con 200 microlitri di terreno di coltura.
8. Aggiungere mezzo fresco cultura e tornare alla incubatrice.
9. Monitorare periodicamente le culture di osservare il movimento delle cellule nella zona di esclusione.

3. Configurazione 2: Island Patterning (formato a 96 pozzetti Plate)

1. Preparare soluzioni di 5,0% p / p PEG e 12,8% peso / peso DEX in mezzo di coltura cellulare, come sopra.
2. Raccogliere le cellule da utilizzare per patterning isola. Determinare il numero totale / concentrazione di cellule disponibili.
3. Pellet e risospendere le cellule in un volume adeguato di DEX% 12,8 per ottenere la concentrazione desiderata di celle per patterning isola. Le concentrazioni di 5000 ceLLS / microlitri o meno sono raccomandati per tipi cellulari fortemente aderenti. Per le celle che hanno difficoltà di collegare o cellule che aderiscono liberamente, le concentrazioni fino a 10.000 cellule / mL possono essere considerate.
4. Lavorando rapidamente per evitare l'essiccamento, pipette goccioline 0,5 pl di DEX su un substrato secco coltura cellulare, come descritto sopra. Non lasciare asciugare gocce. Opzionale: 200 pl di soluzione di PEG può essere aggiunto al ben prima del tempo. DEX goccioline possono essere depositati nella soluzione PEG dove potranno depositano sul fondo e la superficie di contatto cultura. Questo in grado di produrre modelli più puliti dell'isola.
5. Coprire le goccioline DEX con 200 ml di PEG.
6. Posto in un incubatore umidificato per 12 ore a 37 ° C, 5% di CO _2. Assicurarsi che il piatto non sia inclinato durante la movimentazione e che sia posizionato su una mensola livello incubatore per evitare di interrompere i modelli.
7. Rimuovere la soluzione di PEG e lavare tre volte con 200 microlitri di terreno di coltura.
8. Aggiungi coltura frescamedie e ritorno al incubatore.
9. Monitorare periodicamente le culture di osservare il movimento delle cellule verso l'esterno e la proliferazione delle isole.

4. Configurazione 3: Esclusione Co-colture (formato a 96 pozzetti Plate)

1. Preparare soluzioni di 5,0% p / p PEG e 12,8% peso / peso DEX in mezzo di coltura cellulare, come sopra.
2. Raccogliere le cellule da utilizzare per l'esclusione e patterning isola. Determinare il numero totale / concentrazione di cellule disponibili per ogni tipo cellulare. Opzionale: Alcuni abbinamenti cellulari possono visualizzare indici di proliferazione drammaticamente diversi. Per evitare che le cellule escluse dal overpopulating cellule fantasia insulari (soprattutto per le culture a lungo termine), trattare le cellule utilizzate per l'esclusione con mitomicina C per 2 ore o irradiare prima raccolta. Ciò impedirà la proliferazione. CellTracker coloranti fluorescenti possono essere utilizzati per distinguere le due popolazioni cellulari se necessario.
3. Il pellet e risospendere il pellet per exclusion patterning in un volume appropriato di 5,0% PEG per ottenere il numero desiderato di cellule, come sopra. Risospendere il pellet di patterning isola in un volume appropriato di DEX 12,8% per ottenere la concentrazione desiderata di cellule, come sopra.
4. Utilizzando una micropipetta, dispensare 0,5 goccioline pl di sospensione cellulare DEX su un substrato secco coltura cellulare. Non lasciare asciugare gocce.
5. Coprire le goccioline DEX con 200 microlitri di sospensione cellulare PEG.
6. Posto in un incubatore umidificato per 12 ore a 37 ° C, 5% di CO _2. Assicurarsi che il piatto non sia inclinato durante la movimentazione e che sia posizionato su una mensola livello incubatore per evitare di interrompere i modelli.
7. Rimuovere la soluzione di PEG e lavare tre volte in 200 ml di terreno di coltura.
8. Aggiungere mezzo fresco cultura e tornare alla incubatrice.
9. Monitorare i co-colture di osservare l'interazione tra popolazioni cellulari. Opzionali: I controlli possono essere preparate eseguendo esclusione o isola patterning individually, mediante co-coltura delle cellule che non interagiscono o bloccando percorsi di interesse in una o entrambe le popolazioni cellulari prima o dopo patterning.

Results

Per selezionare una combinazione appropriata di PEG e DEX per patterning cella è importante per determinare la curva binodal. Questa curva delinea i punti in cui si possono formare un ATPS e può variare per un dato insieme di polimeri a base di temperatura, pH e contenuto ionico. Per coltura di cellule che richiedono formulazioni personalizzate medio può essere necessario determinare sperimentalmente la curva binodal. Questo si ottiene generando una serie di ATPSs che sono lontani dal binodal e variando nel loro contenu...

Discussion

Il metodo delle celle ATPS micropatterning richiede competenze molto poco al di là di idoneità all'uso di tecniche di coltura cellulare e può essere rapidamente padronanza. I vantaggi di questo sistema è che è poco costoso, rapido e compatibile con una varietà di tipi cellulari e formati coltura. Per queste ragioni, il nostro protocollo deve essere facilmente adottato dagli scienziati della vita, in particolare quelli che studiano la proliferazione cellulare, la migrazione e la chemiotassi, e l'influenza delle i...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente	Fabbricante
Destrano 500.000 kDa	Pharmacosmos, Danimarca
Polietilene glicole 35.000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
3T3 NIH	ATCC, Manassas, VA
Cella Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Siero fetale bovino	Gibco, Carlsbad, CA