Una tecnica semplice e affidabile per la visualizzazione e la quantificazione delle vie aeree ciglia motilità e ciglia flusso generato usando il mouse trachea è descritto. Questa tecnica può essere modificato per determinare come una vasta gamma di fattori influenza cilia motilità, compresi agenti farmacologici, fattori genetici, esposizioni ambientali, e / o fattori meccanici come carico muco.
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Articolo metodologico
Metodo ex vivo per l'imaging ad alta risoluzione di Cilia Motilità in roditori Airway epiteli
In questo articolo
Sommario
Abstract
È stata stabilita una tecnica ex vivo per l'imaging del mouse epiteli delle vie respiratorie per l'analisi quantitativa della funzione ciglia motile importante per la comprensione funzione della clearance mucociliare. Appena raccolto il mouse trachea è tagliato longitudinalmente attraverso il muscolo trachealis e montato in una camera murata bassa su un piatto fondo di vetro. Il campione trachea è posizionato lungo il suo asse lungo di approfittare del muscolo trachealis ad arricciarsi longitudinalmente. Questo permette l'imaging di movimento ciliare nella vista profilo lungo l'intera lunghezza tracheale. I video a 200 frame / sec si ottengono utilizzando interferenza differenziale microscopia a contrasto e una fotocamera digitale ad alta velocità per consentire l'analisi quantitativa delle ciglia frequenza del battito ciliare e forma d'onda. Con l'aggiunta di perline fluorescenti durante l'imaging, cilia flusso di fluido generato anche può essere determinato. Il tempo di protocollo si estende a circa 30 minuti, con 5 minuti per la preparazione della camera, 5-10 min per campionemontaggio, e 10-15 minuti per videomicroscopia.
Introduzione
Analisi della funzione di cilia motili nella epiteli delle vie aeree è sperimentalmente importanti per la comprensione dei fattori genetici e ambientali che possono influenzare la clearance mucociliare e la salute polmonare 1. La semplice protocollo sviluppato per l'imaging del mouse epiteli delle vie aeree fornisce un metodo efficiente per interrogare vie respiratorie ciglia motilità nei modelli mutanti e knockout topo e richiedono solo competenze di base in topo tracheale dissezione dei tessuti ed ex imaging in vivo di vie ciglia motilità con videomicroscopia alta risoluzione. Questo protocollo è stato istituito e perfezionato nel c....
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Protocollo
1. Setup Reagenti
1.1 Dissezione e immagini Media
L-15 Leibovitz (L15) è completato con FBS (10%) e penicillina-streptomicina (100 unità / ml di penicillina G sodica e 100 pg / ml di streptomicina solfato) è usato sia durante il raccolto e di imaging di campioni trachea.
2. Shallow Walled Cultura della Camera dell'Assemblea
La camera utilizzato per contenere trachea tessuto è mostrato in Figura 1. Il pavimento della camera è il fondo di vetro 35 millimetri capsula di Petri. La parte superiore e laterale della camera è generato mettendo un ....
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Risultati
Controllo ciglia delle vie aeree deve essere chiaramente visibile e visto da battere in modo coordinato (Movie Supplemental 1; la riproduzione del filmato è rallentato a tempo reale 15%), con un flusso notevole nella direzione di battito delle ciglia (Movie Supplemental 2; la riproduzione di film è al 100% tempo reale). Quantificazione dei film ciglia dovrebbe produrre risultati simili a quello visto in Figura 3. Raccolta di film DIC alta velocità rende possibile la qua.......
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Discussione
Misura della frequenza del battito delle ciglia (CBF) è relativamente facile usando obiettivi del microscopio ad alta potenza e le immagini veloce acquisizione hardware 13,15, e spiega perché le misure CBF sono alla base della maggior parte degli studi indagano clearance mucociliare durante la salute e la malattia. Tuttavia, mentre la misurazione CBF è essenziale per comprendere la clearance mucociliare, la misurazione della CBF solo ignora l'importanza di fondo di entrambi i flussi generati ciliare e cig.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il progetto è stato sostenuto da NIH concedere U01HL098180 dal National Heart, Lung, and Blood Institute. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Heart, Lung, and Blood Institute e il National Institutes of Health
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Leibovitz' s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No rosso fenolo |
| Siero fetale bovino | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillina-Streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x pinze fini | Roboz | RS-4976 | |
| Forbici da dissezione | Roboz | RS-5676 | |
| Forbici da micro dissezione | Roboz | RS-5620 | |
| Bisturi | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipettatore | Gilson, Inc | F123602 | |
| punte P1000 | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm rotondo in vetro vetrino vetrini | Fisher Scientific | 430588 | |
| Fisher Scientific Piastre per colture in plastica da 35 mm | Corning | 430588 | |
| Piastre per colture da 35 mm con fondo in vetro | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Foglio di silicone 0,012" (0,3 mm) di spessore | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0,20 μ m diametro Fluoresbrite YG Microsfere di carbossilato | Polysciences | 09834-10 | |
| Microscopio invertito, con obiettivo a olio 100x e filtri DIC | Lecia | DMIRE2 | non è critico. |
| Lampada al mercurio da 100 watt, filtri di eccitazione/emissione FITC epifluorescenti | Lecia | Brand non è fondamentale. | |
| Tavolino per microscopio Incubatore | Lecia | 11521749 | Non necessario se si esegue l'imaging delle ciglia a temperatura ambiente |
| Fotocamera ad alta velocità in campo chiaro | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand non è critico. Deve essere più veloce di 125 fps |
| Fotocamera fluorescente ad alta velocità | Hamamatsu | C9100-12 | Marca non è critico. Deve essere più veloce di 10 fps |
| Software di analisi video | National Institutes of Health | ImageJ con plug-in |
Riferimenti
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in....
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Ristampe e permessi
