Vi beskriver en roman<em> In vivo</em> Billeddannelse teknik, at par fluorescerende kimære mus med intrakranielle vinduer og høj opløsning 2-foton mikroskopi. Denne billeddiagnostiske platform hjælpemidler studier af dynamiske ændringer i hjernevævet og microvasculature, til en enkelt celle niveau, efter patologiske fornærmelser og kan tilpasses til at vurdere intrakraniel drug delivery og distribution.
Vi har med succes integreret tidligere fastlagte Intrakranielt vindue (ICW) teknologi 1-4 med intravital 2-foton konfokal mikroskopi til at udvikle en ny platform, der giver mulighed for direkte langsigtede visualisering af væv strukturændringer intrakranialt. Imaging på en enkelt celle opløsning i et real-time mode giver supplerende dynamiske oplysninger, der gives ved standard end-point histologisk analyse, der ser udelukkende på 'snap-shot' tværsnit af væv.
Etableringen af denne intravital imaging teknik i fluorescerende kimære mus, vi er i stand til at afbilde fire fluorescerende kanaler samtidigt. Ved at inkorporere fluorescensmærkede celler, såsom GFP + knoglemarv, er det muligt at spore skæbne af disse celler studerer deres langsigtede migration, integration og differentiering inden væv. Yderligere integration af en sekundær reporter celle, såsom en mCherry gliom tumorlinie, muliggør karakteterization af celle-celle-interaktioner. Strukturelle ændringer i vævet mikromiljø kan fremhæves ved tilsætning af intra-vitale farvestoffer og antistoffer, for eksempel CD31 mærkede antistoffer og dextranmolekyler.
Desuden beskriver vi kombinationen af vores ICW tegnemodel med en lille dyr mikro-strålerøret der giver stereotaktisk bestråling, skaber en platform, hvorigennem de dynamiske væv forandringer, der sker efter administration af ioniserende bestråling kan vurderes.
Nuværende begrænsninger i vores model omfatter penetrans af mikroskopet, der er begrænset til en dybde på op til 900 um fra sub kortikale overflade, begrænser billedbehandling til den dorsale akse af hjernen. Tilstedeværelsen af kraniet gør ICW en mere udfordrende teknisk procedure, sammenlignet med de mere etablerede og udnyttede kammer modeller der anvendes til at studere brystvæv og fedtpuder 5-7. Desuden ICW provIdes mange udfordringer, når optimerer imaging.
En bedre forståelse af de strukturelle og biologiske ændringer, som opstår i hjernen som reaktion på forskellige patologier og terapeutiske indgreb er afgørende for at forbedre behandling strategier. Men en af de nuværende udfordringer i at studere disse strukturelle og biologiske forandringer, især med hensyn til de intrakranielle patologier, er den manglende adgang til vævet og den manglende evne til at studere den tidsmæssige udvikling og dynamisk progression af ændringer i en in vivo omgivelser. Den generation af "vinduet" teknologi har tidligere vist sig at være en succes i at undersøge blødt væv ændringer gennem tumor udvikling 5-7. Udvikling af ICW modeller viser sig at være mere teknisk udfordrende, fordi det er nødvendigt at fjerne kraniet uden at beskadige den anstiftelse infektion i den underliggende hjernevævet. Tidligere papirer har forsøgt at fortynde kraniet for at visualisere væv 8-10 dog til at producere høj opløsning klar imaldre fuld fjernelse af kraniet kræves 11. Gentag langsigtet imaging (30 dage +) er først for nylig blevet en realistisk mulighed gennem imaging 1,11, har tidligere kortere tidsrammer blevet undersøgt 5.
Gennem det seneste årti et vigtigt mål har været at belyse oprindelsen af neo-vaskulatur følgende patologiske stimuli, navnlig som reaktion på tumordannelse og progression, at tilvejebringe hidtil ukendte terapeutiske mål til behandling af tumorer. Megen polemik forbliver omkring kilden til ny vaskulatur i hjernen under tumorudvikling eller efter stråling. Traditionelt vaskularisering blevet anset for at forekomme gennem angiogenese, en proces, hvor nye fartøjer dannes fra spiring af allerede eksisterende fartøjer 12. Nyere undersøgelser tyder imidlertid på, at den tidligere antaget embryonale proces vaskulogenese kan spille en mere betydelig rolle i dannelsen af patologiske kar. Vasculogenesis involverer rekruttering af de voksne angioblast kolleger fra knoglemarven som igen er så direkte involveret i dannelsen af nye fartøj endotel 12-14. Akkumulere tyder på, at endotel præcursorceller mobiliseres fra knoglemarven til at indlede de novo fartøj dannelse som reaktion på onkogene mediatorer 15-17. Men disse undersøgelser giver modstridende evidens for det direkte bidrag af disse knoglemarv afledt celler (BMDCs) til fartøjets endotel med procentvise bidrag varierer med den type af patologiske stimulus og respons på behandlingen 18-21.
Derfor, om reproducerbare eksperimentelle metoder, der tillader høj opløsning intravital billeddannelse til gentagen langsigtet undersøgelse af processen BMDC integration i tumorvaskulatur og som reaktion på terapi er uvurderlig. Standard histologiske teknikker undlader at give den dynamiske oplysningerninger der kræves for at bestemme den langsigtede overlevelse, differentiering og integration af de celler, der giver anledning til neovaskulatur og kan derfor ikke påvise endeligt mekanismer celle interaktion.
Vi har vist ved hjælp af vores eksperimentelle tilgang, der er en varierende grad af BMDC rekruttering efter både intrakraniel ioniserende stråling og tumorvækst, en rekruttering der er dog patologi stedsspecifik og ikke en invasion af hele intrakranielle væv 11,22. Vi har vist, at ansættelsen følger en tidsfølsomme mønster fremgår af gentagne billeder af et enkelt dyr 11,22. Ligeledes kan in vivo imaging også give uvurderlig indsigt i tumorceller mimicry hvorved fluorescens mærkede tumorceller kan afbildes og spores med en intra-vital CD31 antistof til endothelceller til at fremhæve muligheden for tumorceller transdifferentiation til direkte at danne sit eget endotel.
<pclass = "jove_content"> Alsidigheden af modellen forstærkes af evnen til at billedet 4 fluorescerende kanaler, der giver en udtømmende antal kombinationer for studiet af varierende cellulær og biologisk proces. Vi er i stand til at intravitally billede CFP (blå), GFP (grøn), Kirsebær / RFP (rød) og Alexa647/APC (langt rød), samtidigt i et enkelt felt gentagne gange over tid. Forskerne kan gensplejse celler til at udtrykke fluorokromer for hver af de kanaler, samt køb farvestoffer og antistoffer til at fremhæve strukturelle ændringer af særlig interesse. Til dato farvestoffer og antistoffer almindeligvis anvendes i undersøgelser omfatter CD31 og dextran som begge understreger mikrovaskulaturen og dets ændringer i væv 1,11,23,24, selvom vi udnyttet den langt røde kanal til dette formål både er tilgængelige til brug i den anden kanaler nævnt. Tilsvarende har andre farvestoffer, herunder Sytox Orange, hvilket vil fremhæve områder af apoptose, og markører, såsom dem fra selskabet Visen, været specielt konstrueret til anvendelse in vivo. Udover de fire almindeligt anvendte fluorescerende nævnte kanaler, kan en anden harmonisk generation (SHG) kanal tilsættes og optimeres til billede endogene collagenfibre af modellen 7, visualisere basalmembranen omgivende kar.For at demonstrere tilpasningsevne vores model, samt celle-celle interaktioner nævnt ovenfor, har vi været i stand til at studere medicin-celle interaktioner. Vi har kigget på narkotika-hæmmere som AMD3100 en SDF-1 hæmmer, og dens rolle i signalering netværk, der er involveret i BMDC rekruttering 11.. Ligeledes har vi gensplejsede ud U87 gliom xenotransplantater celler til at udtrykke VEGFTrap, en VEGF-inhibitor 25, sammenholdt gennem et IRES til en GFP molekyle. Ved at bruge RFP + BM vi er i stand til at undersøge, hvilken rolle VEGF har på rekruttering af BMDCs til kar. Senest har vi udnyttet den model for at studere medicin kinetik kigge på mechanism bag tumor-afgrænse lægemiddel Fluorescein 26, på et cellulært niveau. Gennem brug af en specialbygget i huset små dyr strålerøret har vi været i stand til at integrere stereotaktisk leveret stråling at vurdere respons både tumor og BMDCs til behandling.
Gennem brug af vores nye intravital billeddiagnostiske metode forskere vil få indsigt i de encellede realtid forandringer, der sker i forskellige patologier og systemer, medvirken belysning af mange funktionelle og biologiske funktioner i væv ændringer.
De tre kanaler er beskrevet i alle de billeder hidtil er udskiftelige for tre markører af interesse i andre modeller og blade forskere med en uvurderlig sæt værktøjer til at se en lang række celletyper og interaktioner. Planlægning er nødvendig for at sikre, at alle markører og celletyper har med succes integreret en reporter fluorescens molekyle i en særskilt kanal.
Ud over de standard tre kanaler, der anvendes her kunne vi også integrere en fjerde FFP-kanal (figur 4A) og en SHG-baseret collagen kanal 7 (figur 4B). Dette udvider muligheden for at kigge på cellulære interaktioner i vivo og derudover giver brugeren til at foretage befolkning blanding til undersøgelse af specifikke celle-celle interaktioner og samtidig bevare to kanaler for andre markører. For eksempel har vi kigget på tumorceller (RFP) og kræft stamceller (CFP) i et forhold på 1:3 med en interesse i at sammenligne deres intratummundtlige interaktioner (figur 4A). Vi observerede, at 7 dage efter implantation af blandet population forholdet blev stadfæstet, og begge cellepopulationer kan stadig ses.
FFP kanal giver tekniske problemer på grund af overlapningen med GFP kanal i både excitations-og emissionsspektre og som sådan kræver efter billeddannelse behandling for at definere den sande FFP +-celler fra dem, der er faktisk GFP +. Indlæg imaging behandling kan udføres på 2-foton mikroskoper bygget i Zeiss LSM software direkte hvorved, bliver GFP billedet trækkes fra den fælles fiskeripolitik billedet resulterer i de sande FFP cellerne bliver efterladt (figur 4A). Forudsætningen for forholdet subtraktion er afhængig af lige lyse billeder og skyldes den fælles fiskeripolitik laser (458 nm) fluorescerende både fælles fiskeripolitik og GFP celler mens GFP laser (488 nm) er for høj til at fluorescere den fælles fiskeripolitiks celler. Ud over at den fælles fiskeripolitik har vi også været i stand til at bruge tidligere offentliggjorte opsætninger til at se på SHGniveauer og så skildrer collagenfibre, som udgør basalmembranen omkring vaskulatur (figur 4B).
En anden tilpasning af denne model har benyttet sig af en specialbygget lille dyr strålerøret, som har evnen til at anvende stereotaktisk vejledt strålebehandling at bestråle sektioner af væv så lille som 2 mm i diameter. Ved at målrette vinduet med bestråling er det muligt at se på effekten stråling har på det underliggende væv. Vi har for nylig offentliggjort en undersøgelse ser på effekten stråling har på normal hjernevæv med hensyn til rekruttering af BMDCs til vaskulaturen, specielt på deres rolle i post stråling vævsforandringer. Vi fandt, at ansættelsen af de BMDCs var både tid og dosisafhængig i normalt væv 11.
Det er muligt at undersøge mekanismerne for levering og integration af terapeutiske leverer lægemidlet er mærket med en fluorescerende markør. Undervores forskning, vi har været i stand til at spore produktionen af VEGFTrap en antiangiogent lægemiddel, som blokerer al VEGF signalering i det lokale område af produktionen 25.. Ved genetisk ændring vore tumorceller at udtrykke VEGFtrap genet kombineret med et IRES til EGFP (Figur 4CI) og bruge RFP "donor" BM var vi i stand til billede EGFP: VEGFtrap produktion, BMDC interaktion og karrene samtidigt (figur 4Cii). Dette viste alsidigheden i model og tilgængelige kanaler. Det er også muligt at se på kinetikken af lægemidlet på grund af løftet om enkelt-celle opløsning. Fluorescein (GFP +) bruges til at afgrænse tumorer under operationen for at sikre maksimal resektion opnås 26. Ved at indsprøjte intravenøst, mens imaging er det muligt at påvise, at afgrænsningen ikke sker gennem den aktive optagelse af Fluorescein ind tumorcellerne selv, men i stedet gennem indsamling af lægemidlet i det stromale område med time, ses ved manglen på co-lokalisering 10 min efter injektion af fluorescein (figur 4D).
Samlet vores strategi kombinerer nye og eksisterende teknikker til at opnå en unik eksperimentel platform, hvilket er fordelagtigt i studiet af dynamiske cellulære interaktioner. Denne strategi har vist sig at være en uvurderlig metode til at undersøge høj opløsning encellede dynamiske udvikling af BMDC, tumor og normal hjerne vascularity reaktion på behandlingen, intrakranialt. Intravital imaging kan give en bedre forståelse for de molekylære regulatorer af BMDC rekruttering, migration og differentiering i intrakraniel hjernesvulst kar samt mange andre dynamiske processer tilpasses til andre forskningsområder. Hæmmende formodede faktorer, der regulerer BMDC i kombination med andre terapeutiske strategier kan hjælpe identifikationen af den præcise timing af kombinatoriske behandlingsformer. Desuden kan denne strategi tilpasses mange fremtidige PRojects udnytte ikke blot in vivo intravital farvning farvestoffer, men også små molekylære inhibitorer og nanopartikler, der er fluorescens mærkede giver forskerne at spore distribution og trækmønstre mere målrettede lægemidler samt se på langs på deres kinetik.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Advanced Optical Microscopy Facility på prinsesse Margaret hospital, især James Jonkman for deres bistand i den indledende opsætning af kanaler på 2Photon mikroskop. Forfatterne vil gerne anerkende Spatio-Temporal Targeting og Forstærkning af Radiation Response (STTARR) program og dets tilknyttede finansieringsorganer. Vi takker Dr. Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael og Dr.Andras Nagy for at levere de VEGFTrap plasmider og for deres manuskript rettelser og feedback. Den fortsatte støtte og diskussion fra personalet på BTRC har været uvurderlig, og vi vil gerne fejre Dr.Abhijit Guha for hans videnskabelige input. Arbejdet blev finansieret af CIHR og NIH tilskud.
Reagent | |||
NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
Equipment | |||
Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
22G Needle | BD | 305156 | |
27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI |