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Articolo metodologico

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

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DOI:

10.3791/50590

⸱

23 febbraio 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UPRES EA3830, Institute for Research and Innovation in Biomedicine, University of Rouen, 2Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Rouen University Hospital, 4Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Amiens University Hospital

In questo articolo

Sommario

Cellule ensheathing olfattive (OECs) sono cellule della cresta neurale che permettono la crescita dei neuroni olfattivi primari. Questa proprietà specifica può essere utilizzato per il trapianto cellulare. Presentiamo qui un modello di trapianto cellulare basata sull'uso di OECs in un modello di lesione del nervo laringeo.

Abstract

Cellule ensheathing olfattive (OECs) sono cellule della cresta neurale che permettono la crescita e ricrescita dei neuroni olfattivi primari. Infatti, il sistema olfattivo primario è caratterizzato dalla sua capacità di dare origine a nuovi neuroni anche in animali adulti. Questa particolare abilità è in parte dovuta alla presenza di OECs che creano un microambiente favorevole per neurogenesi. Questa struttura di OECs è stato usato per il trapianto cellulare come nei modelli di lesione del midollo spinale. Sebbene il sistema nervoso periferico ha una maggiore capacità di rigenerare dopo lesione del nervo rispetto al sistema nervoso centrale, sezioni complete indurre misrouting durante ricrescita assonale in particolare dopo facciale di transezione del nervo laringeo. In particolare, pieno sezionamento del nervo laringeo ricorrente (RLN) induce aberrante ricrescita assonale conseguente synkinesis delle corde vocali. In questo modello specifico, abbiamo dimostrato che OECs trapianto aumenta efficacemente la ricrescita assonale. ve_content "> OECs sono costituiti da diverse sottopopolazioni presenti sia nella mucosa olfattiva (OM-OECs) e bulbo olfattivo (OB-OECs). Presentiamo qui un modello di trapianto cellulare basata sull'uso di questi differenti sottopopolazioni di OECs in un modello di lesione RLN. Utilizzando questo paradigma, colture primarie di OB-OECs e OM-OECs sono stati trapiantati in Matrigel dopo la sezione e anastomosi del RLN. due mesi dopo l'intervento, abbiamo valutato animali trapiantati da analisi complementari sulla base di videolaryngoscopy, elettromiografia (EMG) , e studi istologici. Innanzitutto, videolaryngoscopy permesso di valutare le funzioni della laringe, in particolare cocontractions muscolari fenomeni. Poi, EMG analizza dimostrato ricchezza e la sincronizzazione delle attività muscolari. Infine, studi istologici basato su colorazione blu di toluidina permesso la quantificazione del numero e profilo di fibre mieliniche.

Tutti insieme, si descrive qui come isolare, cultura, identify e trapianto OECs da OM e OB dopo RLN sezione-anastomosi e come valutare e analizzare l'efficienza di queste cellule trapiantate sulle funzioni ricrescita e laringei assonale.

Introduzione

Il sistema olfattivo primario è composto di due parti distinte: la mucosa olfattiva (OM) nel sistema nervoso periferico e il bulbo olfattivo (OB) nel sistema nervoso centrale. Il sistema olfattivo primario è caratterizzato dalla capacità dei neuroni olfattivi primari (PON) auto-di rinnovare tutta la vita in specie di mammiferi. Questa capacità è reso possibile grazie alla presenza di cellule staminali neurali nel OM. La crescita PON e la ricrescita da OM a OB è facilitata dalle cellule gliali specializzate chiamate cellule ensheathing olfattive (OECs). OECs sono cellule della cresta neurale che creano un microambiente favorevole per la neurogenesi del PON da OM a OB 1. In tal modo, OECs può essere trovato in OM e in OB costituendo diverse sottopopolazioni di cellule 2,3. Le diverse proprietà di OECs gli scienziati hanno di piombo per usarli per trapianti cellulari in diversi paradigmi sistema nervoso lesione 4. Infatti, OECs fattori di crescita prodotti, ridurre spaventare gliali, prOmote ricrescita assonale, e può mescolarsi liberamente con astrociti 5,6. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi studi si basano su lesioni del midollo spinale (SCI), pochi di loro hanno usato OECs dopo la lesione del nervo periferico (PNI) 7,8.

Sebbene il sistema nervoso periferico ha una grande capacità di rigenerarsi dopo una lesione del nervo, sezioni complete indurre aberrante assonale ricrescita. Infatti, dopo transections complete del viso o dei nervi laringei ricorrenti (RLN) assoni pervenute all'indirizzo sbagliato causano cocontractions muscolari chiamati synkinesis. Pertanto è di primaria importanza per proporre un modello di PNI quantificare non solo ricrescita assonale ma anche per valutare l'efficienza delle contrazioni muscolari. Nella letteratura il modello più comune descritto è basato sulla lesione del nervo facciale 9,10. In questo modello, valutazioni funzionali sono basati sul recupero dei movimenti whisker 10. Tuttavia è complicato per dimostrare l'efficacia del movENTI e discriminare i fenomeni cocontractions muscolari. Proponiamo qui un modello basato su una lesione RLN. Questo modello permette di valutare non solo la ricrescita degli assoni e dei movimenti delle corde vocali, ma anche l'efficienza e la funzionalità di questi movimenti dopo trapianti cellulari 11,12. Questo protocollo fornisce una procedura passo passo alla cultura e trapianto OECs da OM e OB in un modello sezione RLN / anastomosi e di valutare animali dopo l'intervento chirurgico.

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Protocollo

1. Colture primarie di mucosa olfattiva e olfattiva Bulbi

  1. Prima di dissezione
    1. Fai medio, per 50 ml, con l'aggiunta di 44 ml di calcio senza di Dulbecco Modified Eagle / medio di Ham F12 (DMEM/F12), supplementato con 5 ml di siero fetale bovino (FBS) e 1 ml di penicillina / streptomicina.
    2. Coat 75 centimetri 2 palloni con poli-L-lisina (50 mcg / ml, 1,5 mg / cm 2), 1 ora a temperatura ambiente.
    3. Risciacquare boccette con PBS 1x.
    4. Conservare i flaconi rivestiti in frigo per un massimo di 1 settimana.
  2. Dissezione
    1. Qualsiasi metodo di eutanasia deve essere preventivamente approvato dal cura degli animali e l'uso comitato dell'istituto e realizzato da personale qualificato.
    2. Scegli ratti inbred come ratti Fischer.
    3. Dopo il ratto è stato confermato essere entrato anestesia profonda con sodio pentobarbital o altre forme iniettabili di anestesia come la chetamina / xilazina, lui e r decapitareTogliete la pelle.
    4. Aprire il cranio dalla anteriore alla parte posteriore.
    5. Rimuovere la presa in carico OB per evitare le meningi.
    6. Nella stessa ratto, aprire la cavità nasale sagittale.
    7. Rimuovere l'OM avendo cura di evitare la mucosa respiratoria. Si noti che l'epitelio OM può essere facilmente identificato dal suo colore giallastro.
    8. Protocolli ulteriormente dettagliate sulla dissezione di OM si possono trovare in una precedente J. Vis. Esp . pubblicazione 13.
  3. Cultura
    1. Posizionare OB in soluzione tamponata di Hank sale (HBSS) contenente 0,1% di tripsina per 45 min a 37 ° C.
    2. Posizionare OM in HBSS contenente 0,05% di collagenasi A per 45 min a 37 ° C.
    3. Smettere di digestione enzimatica con l'aggiunta di 2 ml di terreno caldo.
    4. Lavare le cellule con mezzo e centrifugare a 300 xg per 3 min.
    5. Campioni triturare di 2ml di terreno usando una pipetta P1000 fino ad ottenere una sospensione cellulare omogenea.
    6. Piastra le cellule in fiasche pretrattate (5-10 x 10 6 cellule / fiasco) con 25 ml di terreno caldo.
    7. Incubare e coltura le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2.
    8. Cambiare la metà del mezzo ogni 2 giorni.
    9. Dopo 6-8 giorni in vitro, controllare la percentuale di p75 cellule positive su campioni di piccole cellule, presume essere OECs nei roditori, mediante citometria di flusso o immunocitochimica. Per queste analisi, altri marcatori possono essere studiati come GFAP e S100β.
  4. Citometria a flusso
    1. Raccogliere le celle come descritto in (sezione 2.2) "trapianto cellulare".
    2. Incubare con p75 anticorpo primario (1:100) durante 15 min a 4 ° C.
    3. Lavare le cellule con 2 ml di PBS-EDTA e centrifugare a 300 xg per 3 min.
    4. Incubare le cellule con PE anticorpo secondario anti-topo coniugato in 15min a 4 ° C al buio (1:200).
    5. Lavare le cellule con 2 ml di PBS-EDTA e centrifugare a 300 xg per 3 min.
    6. Risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS-EDTA.
    7. Analizzare 10-30 x 10 3 celle con flusso citometro.
  5. Analisi immunocitochimica
    1. Piastra le cellule in piastre da 6 pozzetti prerivestite per 48 ore come descritto in "cultura" (sezione 1.1.2 di seguito).
    2. Lavare le cellule con PBS.
    3. Fissare le cellule con PFA 4% per 15 min a RT.
    4. Lavare le cellule con PBS.
    5. Incubare le cellule con PBS / Triton X100 (0,1%) per 15 minuti a RT.
    6. Lavare le cellule con PBS.
    7. Incubare le cellule con anticorpi primari (1:200): p75, S100β e GFAP notte a 4 ° C.
    8. Lavare le cellule con PBS.
    9. Incubare le cellule con gli anticorpi secondari (1:500) per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
    10. Lavare le cellule con PBS.
    11. Incubare le cellule con Hoechst 10 min a RT nel buio.
    12. Lavare le cellule con PBS.
    13. Analizzare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza.
  6. Cellule GFP etichettatura
    1. Cinque giorni prima del trapianto, infettare culture OB e OM notte con vettore lentivirale ospitare rafforzata GFP (molteplicità di infezione: 20).
    2. Prima del check trapianto su piccoli campioni il tasso di cellule GFP positive per citometria a flusso come descritto in precedenza in "cultura" (sezione 1.1).

2. Chirurgia e Trapianti

  1. Ricorrente anastomosi nervo
    1. Tutti gli esperimenti con gli animali devono essere approvati preventivamente dalla cura degli animali e l'uso comitato dell'istituzione ed eseguite da personale qualificato.
    2. Prima dell'intervento autoclave tutti gli strumenti e mantenere la sterilità durante gli interventi chirurgici.
    3. Anestetizzare ratto mediante iniezione intraperitoneale di ketamina cloridrato (12,5 mg / kg) e clorpromazina cloridrato (0,625 mg / kg). Valutare l'adeguatezza di anestesia pizzico punta prima dell'intervento.
    4. Posizionare il ratto in decubito dorsale.
    5. Eseguire una verticale di medie incisione cutanea cervicale due centimetri con un bisturi.
    6. Eseguire un'incisione verticale dei muscoli sottoioidei seguendo la linea bianca mediale.
    7. Esporre laringe utilizzando divaricatore autostatico tra i muscoli sottoioidei.
    8. Esporre il RLN.
    9. Sotto il controllo microscopico, tagliare il nervo pienamente con microscissors a livello dell'anello tracheale settima.
    10. Eseguire anastomosi utilizzando un punto di 11,0 sutura sotto controllo microscopico. Questo intervento comporta una specifica denervazione motore della laringe.
  2. Il trapianto cellulare
    1. Appena prima del trapianto, rimuovere le cellule dalle stoviglie utilizzando 0,05% tripsina EDTA per 5 min a 37 ° C.
    2. Smettere di digestione enzimatica con l'aggiunta di 2 ml di terreno caldo.
    3. Centrifugare a 300 xg per 3 min.
    4. Al microscopio contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare secondo protocollo specifico. In questo modello, concentrazioni desiderate erano tra 1,2-6 x 10 6 cellule in 30 ml di DMEM/F12.
    5. Fare la preparazione cellulare con 1:02 mix (30 e 60 microlitri in questo esperimento) di DMEM/F12-Matrige l in provetta da 1,5 ml prima di innesto e posizionarlo sul ghiaccio. Per evitare effetti non specifici, utilizzare il fattore di crescita ridotta Matrigel.
    6. Appena prima del trapianto tenere il tubo in mano per pochi secondi a scaldare la Matrigel-medio impasto.
    7. Deporre il mix sul sito anastomosi con una pipetta e attendere finché il composto auto-assembla sul nervo feriti.
    8. Chiudere i muscoli e la pelle con una sutura 4.0.
    9. Casa ratti individualmente e tenere sotto una lampada riscaldante per 24 ore.

3. Valutazione

  1. Laringoscopia
    1. Anestetizzare ratti intraperitOneal iniezione di ketamina cloridrato (12,5 mg / kg) e clorpromazina cloridrato (0,625 mg / kg). Conferma ratti vengono anestetizzati con un pizzico punta prima di procedere con il protocollo.
    2. Posizionare il ratto in decubito dorsale.
    3. Inserire un 30 ° videolaryngoscope adeguati per fornire la migliore visione della laringe. Determinare punti di riferimento anatomici di riprodurre la stessa vista per ogni registrazione.
    4. Registrare i movimenti delle corde vocali utilizzando il videolaryngoscope (5-10 sequenze / animale). Per ciascun animale selezionare tre sequenze successive di adduzione e abduzione massima massima.
    5. Analizzare la funzione laringea utilizzando il software di analisi delle immagini. Determinare il movimento angolare assoluta misurando la differenza tra movimento di abduzione massima e adduzione massima delle corde vocali. Determinare punteggio dinamico misurando l'ampiezza del movimento. Determinare il punteggio funzionale, misurando la synkinesis e movimenti paradossali.
  2. Elettromiografia (EMG)
    1. Posizionare un elettrodo sui muscoli posteriori della coscia del ratto per l'isolamento elettrico.
    2. Esporre laringe e della trachea con l'apertura della pelle e dei muscoli, come descritto in precedenza nella (sezione 2.1) "anastomosi nervo ricorrente".
    3. Esporre la cartilagine crico-tiroidea.
    4. Aprire la cartilagine cricotiroidea per esporre il cricoarytenoid posteriore (PCA) del muscolo utilizzando microscissors.
    5. Introdurre un elettrodo ad ago monopolare (38 x 0,45 millimetri) nel muscolo PCA.
    6. Registrare l'attività muscolare elettrica del muscolo PCA utilizzando un sistema di acquisizione durante la ventilazione spontanea.
    7. Analizzare l'attività muscolare in termini di ricchezza e la sincronizzazione con il respiro. Per analizzare EMG, assegnare un punteggio qualitativo 0-3 usando la seguente scala: 0: tracciato senza rima, senza aumento durante l'inspirazione, 1: rima tracciando con inspiratori in aumento, ma povero tracing (Neurogen), 2: rima tracciando con l'attività più ricchi, 3: rima rintracciamento, molto ricco, che costituisce un iReticolo nterferenze, simile ad una massima attività intenzionale.
    8. Esporre il nervo vago per misurare la durata latenza e potenzialità. Il nervo vago è scelta come sede della stimolazione perché RLN può essere danneggiato durante la stimolazione grazie alle sue piccole dimensioni.
    9. Stimolare il nervo vago con un elettrodo.
    10. Registrare i segnali elettrici nel muscolo PCA. Misurare la latenza e la durata del potenziale. Se possibile utilizzare un modulo di acquisizione per registrare l'attività muscolare, la latenza e la durata potenziale come il sistema Powerlab.
  3. Istologia
    1. Euthanize l'animale con overdose di pentobarbital.
    2. Rimuovere il moncone distale del RLN sotto controllo microscopico. La parte distale del RLN è definita come la parte tra anastomosi e della laringe. Si noti che è possibile trovare il sito di anastomosi diverse settimane dopo l'intervento chirurgico perché il 11.0 sutura è una sutura non assorbibile.
    3. Posizionare la porzione distale del RLN in 2% glutaraldeide 0,1 M fosfato(PH = 7,3) per 2 ore a 4 ° C.
    4. Orientare con attenzione i campioni per realizzare sezioni coronali.
    5. Lavare campioni in tampone fosfato.
    6. Tagliare in segmenti più piccoli (3-4 mm di lunghezza) e postfix per 60 minuti a temperatura ambiente in 1% cacodilato tamponata OsO 4 e disidratate con etanolo.
    7. Campioni orientare in stampi in silicone e incorporato in resine consistenti in POLYBED 812, DDSA e MNA, a cui è stato aggiunto il 2% di acceleratore BDMA.
    8. Fai sezioni trasversali semi-sottile (1μm di spessore) con un ultramicrotomia sistema Pyramitome.
    9. Colorazione con blu di toluidina 0,1% in 1% tetraborato di sodio per 75 sec a 70 ° C.
    10. Analizzare campioni RLN con un sistema di analisi di conteggio. Contare il numero di fibre e misurare profili di fibre nervose mielinizzate determinando il contorno esterno e interno della guaina mielinica.
  4. Trapianto
    1. Preparazione delle cellule per il trapianto e trapianto di cellule come precedentemente descrittoin "Il trapianto cellulare" (paragrafo 2.2).
    2. Analisi
    3. Euthanize l'animale con overdose di pentobarbital. Si noti che la fissazione degli animali può essere eseguita utilizzando iniezione intracardiaca di PFA 4%.
    4. Rimuovere circa 2 cm di RLN. Utilizzare prossimale e parti distali del RLN.
    5. Fissare campione RLN in azoto liquido.
    6. Conservare i campioni a -80 ° C.
    7. I campioni tagliati longitudinalmente con criostato (spessore 10-20 micron).
    8. Analizzare i campioni al microscopio a fluorescenza per rilevare le cellule GFP positive. Si noti che l'anticorpo anti-GFP può essere usato per aumentare emissione di fluorescenza ed effettuare costainings.

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Risultati

Illustrazioni di controllo e reinnervated (sezione / anastomizzata) gli animali sono stati scelti come i risultati possono variare a seconda delle trapianti cellulari effettuati (OM, OB o OM + OB).

Coltura cellulare
Le cellule aderiscono rapidamente alla superficie plastica e divenne segregata in andane parallele di cellule che sono allungate o rastremata, triangolare, multipolare, o forma-mandrino (Figure 1A e 1B). Dopo 8 giorni in vitro

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Discussione

Le tecniche qui presentate fanno OECs un modello utile per studiare trapianti cellulari in modelli di lesione dei nervi periferici. Il protocollo di coltura cellulare è relativamente semplice e può essere facilmente effettuata. D'altro canto, le procedure chirurgiche, in particolare la sezione / anastomosi del RLN, richiedono esperienza e devono essere eseguite da personale qualificato.

Le procedure descritte in questo protocollo evidenziano fattori importanti per concentrarsi su al fine...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrebbero riconoscere ADIR (Aide à Domicile aux Insuffisants Respiratoires) e Fondation de l'Avenir per il loro sostegno finanziario e al dottor Fanie Barnabé-Heider per la modifica del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM/F12InvitrogenE3521T
FBSInvitrogenE3387M
Penicilina/streptomicinaInvitrogen1152-8876
HBSSInvitrogenM3467Y
Tripsina-EDTAInvitrogenM3513P
CacodilatoMerck1.03256.0100
DDSABiovalley00563-450
MNABiovalley00886-450
BDMABiovalley00141-100
Polybed 812Biovalley08791-500
PE anti-topo BD Bioscience550589
Matrigel GFRBD Bioscience356231
Collagenasi ARoche10103586001
Topo anti P75ChemiconMAB 365
11.0 FiloEthiconFG 2881
Blu Toluidina...Ral Diagnostics361590-0025
CentrifugaSigmaSigma 2-16PK
Incubatore Thermo Scientific
Cappa a flusso laminareFasterBH-EN 2003 S Citometro
flussoBD BioscienceFACSCalibur
MicroscopioZeiss
VideolaringoscopioKarl Storz EndoskopeTelecam SL NLSC 20212120
Sistema di acquisizioneAD InstrumentsPowerlab
Sistema di ultramicrotomia piramitomoLeicaUltracut S
Sistema di analisi delle immaginiExplora NovaMercator
a

Riferimenti

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