Generation und 3-Dimensional Quantifizierung der arterielle Läsionen in Mäuse mit optischen Projektionstomographie

Abstract

Die Erzeugung und Analyse von Gefäßläsionen in geeigneten Tiermodellen ist ein Eckpfeiler der Erforschung von Herzkreislauferkrankungen, Erzeugung wichtige Informationen über die Pathogenese der Läsion Bildung und die Wirkung neuer Therapien. Verwendung von Atherosklerose anfälligen Mäusen, chirurgische Verfahren Läsion Induktion und diätetische Modifikation dramatisch verbesserte Verständnis der Mechanismen, die die Entwicklung der Krankheit und dem Potential neuer Anwendungen beitragen.

Klassischerweise Analyse der Läsionen durchgeführt ex vivo unter Verwendung von 2-dimensionalen histologische Techniken. Dieser Artikel beschreibt die Anwendung des optischen Projektionstomografie (OPT), um 3-dimensionale Quantifizierung von arteriellen Läsionen. Da diese Technik ist nicht destruktiv, kann sie als Zusatz zu Standard histologischen und immunhistochemischen Analysen verwendet werden.

Neointimale Läsionen wurden durch Drahteinführungs oder Unterbindung der Maus Oberschenkelkunst induziertery während atherosklerotische Läsionen wurden durch Verabreichung einer atherogenen Diät auf apoE-defiziente Mäuse erzeugt.

Läsionen wurden mit OPT Abbildungs ​​autofluoreszierender Emission gefolgt von komplementären histologische und immunhistochemische Analyse untersucht. OPT klar unterschieden Läsionen von der zugrunde liegenden Gefäßwand. Läsionsgröße wurde in 2-dimensionalen Abschnitte Planimetrie berechnet, was die Berechnung von Läsionsvolumen und maximale Querschnittsfläche. Erzeugt mit OPT Daten waren konsistent mit Messungen mit Histologie erhalten, bestätigt die Genauigkeit der Technik und sein Potential als Ergänzung (eher als alternative) zu herkömmlichen Analyseverfahren.

Diese Arbeit zeigt das Potenzial der OPT zur Abbildung von atherosklerotischen Läsionen und neointimale. Es bietet eine schnelle, dringend benötigte ex vivo-Technik für die routinemäßige 3-dimensionalen Quantifizierung der Gefäßumbau.

Introduction

Die Bildung von arteriellen Läsionen ist zentral für die hohe Morbidität und Mortalität mit einer kardiovaskulären Erkrankung ¹ verbunden. Läsionsbildung wird als durch einen ungehinderten entzündliche Reaktion hervorgerufen werden, um Verletzungen ² arterielle. Atherosklerotischen Läsionen bilden sich langsam in Reaktion auf chronische Schädigung der Arterienwand in der Erwägung, Restenose Läsionen entwickeln sich schnell nach einer akuten mechanischen Beschädigungen (beispielsweise nach Stentimplantation). Die Mechanismen, die für die Entwicklung von arteriellen Läsionen tragen erheblich durch die Verwendung von geeigneten Tiermodellen häufig in Kombination mit relevanten genetischen Manipulationen ¹ geklärt.

Analyse der Läsionsgröße und Zusammensetzung hat klassischer stark abhing ex vivo, 2-dimensional Histologie (obwohl dies ändert sich mit der Entwicklung von verbesserten Verfahren zur in vivo und ex vivo-Detektion und Analyse von Läsionen im Kleintiere <sup> 3). Die histologische Analyse von arteriellen Läsionen ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig und begrenzt aussage von 3-dimensionalen Struktur. Beispielsweise wird Läsion Belastung üblicherweise durch Messen der Querschnittsfläche einer Läsion beurteilt (entweder an zufällig ausgewählten Stellen oder an der Stelle der maximalen Okklusion). Dies stellt eine unvollständige Analyse der Gesamtbelastung Läsion. Whole-Mount-3-dimensionalen Bildtechnologie stellt eine mögliche Lösung für dieses Problem, aber überraschend wenige geeignete Ansätze wurden beschrieben. Dies kann darauf zurückzuführen vorwiegend auf die Größe des Maus-Arterien, die zu groß für die Einzelphotonen Konfokalmikroskopie aber zu klein für die Magnetresonanztomographie (MRI) ⁴ und der Röntgen-Computertomographie (CT) ⁵ sein. Anwendung der Ex-vivo-MRI und Mikro-CT auf das Studium der atherosklerotischen Läsionen in Mäusen schlägt sie bieten begrenzte Auflösung, auch in größeren Arterien. Hinzu kommt, benötigt die relativ langen MesszeitenDurchsatz begrenzen (und erhöhen Scankosten) ^4,6.

Entwicklung von neuen optischen bildgebenden Verfahren (wie beispielsweise die optische Kohärenztomographie ^3,7 und photoakustischen Tomographie ⁸⁾ bietet noch viel Potenzial zur Verbesserung der Darstellung von Läsionen in murine Arterien. Ähnliches Potential wird durch optische Projektionstomografie (OPT), die entwickelt wurde, um die Analyse der Maus-Embryonen ermöglichen gezeigt. OPT wurde auf Bild Proben im Bereich von ~ 0,3 bis 10 mm im Durchmesser ⁹ ausgelegt. Übertragungsabbildungs ​​zeichnet die Opazität eines halbdurchscheinend Probe mit polychromatischer sichtbares Licht und können zur Identifizierung von anatomischen Strukturen verwendet werden. Emissionsabbildungssätze Emission von Licht nach der Anregung bei spezifischen Wellenlängen von endogenen (beispielsweise Kollagen, Elastin) und exogenen Fluorophoren in der Probe. Dies kann auch eine anatomische Information (da verschiedene Gewebekomponenten kann in der Art und Dichte des autofluoreszierenden Arten unterscheidenvorhanden). Zusätzlich kann die Verteilung der Immunreaktivität oder die Genexpression unter Verwendung von geeigneten fluoreszierenden Sonden ¹⁰ festgestellt werden. Für beide Bildaufnahmemodus (Übertragung oder Emission) wird Licht auf eine ladungsgekoppelte Anordnung fokussiert, um iterative Bildaufnahme, wie die Probe dreht (in der Regel 400 Bilder bei 0,9 ° Schritten) ermöglichen. Diese können für die Berechnung des Volumens durch Standard tomographische Rekonstruktionsverfahren (wie der gefilterten Rückprojektion (mit einem Kegel-Algorithmus) oder der iterativen Rekonstruktion) verwendet werden.

Dieses Video zeigt unsere neue Anwendung der OPT für eine schnelle, messbare und kostengünstige 3-dimensionale Analyse von atherosklerotischen Läsionen und neointimale, wie bereits in Kirkby et al. ¹¹ beschrieben. Die Technik wurde gezeigt, geeignet zur Quantifizierung Läsionsgröße in drei häufigsten verwendeten Modelle zu sein: (i) Femoralarterie Draht-Verletzung; (Ii) Ligation Femoralarterie, und (iii) Diät-induzierten Atherosklerose in apolipoprotein E defizienten (apoE ^{- / -)} Mäusen.

Protocol

1. Chirurgische Induktion neointimaler Läsionen in der Maus-Oberschenkelschlagader

1. Versuche an Tieren sollten gemäß dem nationalen und Ethikanforderungen durchgeführt werden. All Operation sollte durchgeführt unter Verwendung von geeigneten aseptischen werden. Induktion der neointimalen Läsionen unter Verwendung einer Modifikation des von Roque et al. ¹² und Sata et al. ¹³ beschriebene Technik erreicht.
2. Wiegen männlichen C57Bl6 / J-Mäusen (Alter 10-12 Wochen, Gewicht 25-30 g) dann durch die Bereitstellung von 4-5% Isofluran in einer Induktionskammer betäuben. Sobald die Betäubung induziert worden ist, übertragen die Maus auf einer beheizten Matte, um die Körpertemperatur auf 37 ° C zu halten. Weiter Verabreichung von Isofluran (2-3%) über eine Maske.
3. Sobald ein angemessenes Niveau der Anästhesie induziert wurde (fehlende Reaktion auf Zehen pinch), bieten analgetische Abdeckung durch Verabreichung von Buprenorphin (0,1 mg / kg ^-1). Dann legen Sie die Maus in Rückenlage eind rasieren die Bauchseite des linken Hinterlauf.
4. Einen Einschnitt, um die Muskeln der oberen Hinterlauf freizulegen und zwischen der Gabelung mit der Arteria poplitea und der Bauchwand, verwenden stumpf, um die Arteria und Vena femoralis vom N. femoralis zu isolieren. Bewässerung der Wunde unter Verwendung von 1% w / v Lignocain erforderlich.
5. Zeigen proximal (in der Nähe der Bauchwand) und distalen (direkt unter dem Zweig mit der Arteria poplitea) temporäre Ligaturen (6/0 Mersilk) um die Arteria und Vena femoralis um den Blutfluss zu steuern. Dann isolieren die Arteria poplitea (ca. 2-5 mm distal der Zweig mit der Oberschenkelarterie) und distal zu ligieren. Legen Sie eine zweite, ungebundene Blattschraube unterhalb der A. poplitea.
6. Einen kleinen Einschnitt (Arteriotomie) in der Arteria poplitea, unmittelbar distal zu dem Zweig mit der Oberschenkelarterie, zu verhindern Blutungen durch Aufbringen von Druck auf das proximale temporären Ligatur. Voran einer geraden, entstanden 0.014 "Führungsdraht1-1,5 cm entlang der Oberschenkelarterie in die Richtung der Bauchwand und lassen Sie an Ort und Stelle für 30 Sekunden (Abbildung 1A).
7. Entfernen Sie den Führungsdraht und Ligation der Arteria poplitea oberhalb des Arteriotomie, mit der Ligatur zu diesem Zweck gegeben und kümmert sich nicht um die Oberschenkelarterie zu verschließen.
   HINWEIS: Für die Ligation induzierte Verletzung. Neointimale Umbau ohne intraluminale Verletzung kann durch Ligation der Oberschenkel- oder Kniekehlenarterien (1B und 1C) induziert werden. Um dies zu erreichen folgen die Schritte 1,1-1,5. Doch die Arteriotomie nicht machen, aber (Vermeidung von Schritt 1.6) entweder (i) zu ligieren die Arteria poplitea unmittelbar distal der Oberschenkelarterie oder (ii) zu ligieren der A. femoralis communis an der Verzweigungsstelle mit der Arteria poplitea. Dann fahren Sie mit Schritt 1.8.
8. Entfernen Sie temporäre Ligaturen, die Wunde mit einem diskontinuierlichen äußeren Naht (5/0 Mersilk) und gelten EMLA-Creme (2,5% Lidocain, Prilocain 2,5%). Damit die Tiere neu gewinnen Bewusstsein (in der Regel 5-10 min) und sicherzustellen, dass sie frei um ihren Käfig bewegt (leichte Lahmheit kann in das betroffene Bein offensichtlich sein, aber dies sollte in den ersten 2-3 Tagen nach der Operation zu beheben) vor der Rückkehr in Tierräumen. Mäuse müssen nicht einzeln nach der Operation untergebracht werden.
9. Damit die Tiere für bis zu 3 Monate zu erholen. Kleine Läsionen beginnen zu 7 Tage nach Draht Verletzungen scheinen ~ und eine stabile maximale Größe zu erreichen, nachdem ~ 21-28 Tage.

2. Induktion von atherosklerotischen Läsionen in der Apolipoprotein E ^{- / -} Mäusen

1. Verwalten westliche Ernährung (0,2% Cholesterin, Diäten Forschung, USA), um männlich, 6 Wochen alten ApoE-null-Mäusen (in eigener Zucht) für 12 Wochen.
2. Atherosklerotischen Läsionen sind häufig auf die Brutto Inspektion des Aortenbogens und seiner Hauptzweige (Abbildung 2) sichtbar.

3. Analysieren arterielle Läsionen mit optischen Projektionstomographie (OPT)

nt "> Hinweis: OPT Bilder von Läsionen in murine Oberschenkelarterien und Aortenbogen Proben wurden unter Verwendung eines optischen Projektionstomographen erhaltene.

1. Euthanize Mäusen durch transcardiac Perfusionsfixierung und Ausbluten unter Betäubung Anschluß (80 mg / kg Natriumpentobarbital) mit heparinisiertem (10 U / ml) Phosphat-gepufferter Saline (PBS) und anschließend mit 10% neutralem gepuffertem Formalin.
2. Isolieren Oberschenkelarterien oder die Aortenbogen und seine wichtigsten Branchen (linke Halsschlagader, linken Schlüsselbeinarterie, Truncus brachiocephalicus), soweit angemessen, und entfernen Sie Fremd peri-adventitiellen Material. Postfix-in 10% gepuffertem Formalin O / N, vor der Lagerung in 70% Ethanol, bis sie benötigt.
3. Einbetten Arterien in 1,5% niedrigschmelzender Agarose, durch Whatman 113 V Papier vorgefiltert. Befestigen Sie jede Probe auf eine Magnethalterung mit OPT Cyanacrylatklebstoff mit den Gefäßachse im Einklang mit der von der Halterung. Schneiden Sie überschüssige Agarose zu einer konischen Form. Dehydratisieren in 100% Methanol für mindestens 12 Std.
4. CLear Gefäße durch Eintauchen (12-24 h) in einer Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat (1: 2 v / v).
5. Platzieren gelöscht Proben in einem kalibrierten Tomographen. Stellen Sie die Auflösung auf 1.024 x 1.024, und festzustellen, eine optische Vergrößerung, die das gesamte Gebiet von Interesse zu sehen erlaubt. OPT Volumen isotrop die z-Achse wird auf die gleiche Auflösung rekonstruiert (dh 1,024 x 1,024 x 1,024) Voxelgrße ~ 200 um. Dies kann eine Überschätzung der Auflösung darstellen, da es wahrscheinlich Rekonstruktion Artefakte sein. Probenposition einzustellen, so dass er sich dreht, auf seiner eigenen Achse in der Mitte des Sichtfeldes in der Hellfeld, Übertragungskanal.
6. Im GFP1 Filteremissionskanal (Anregungsfilter 425 nm mit 40 nm Bandpass; Emissionsfilter: 475 nm Langpass), konzentrieren sich die Probe und die Belichtungszeit, den Dynamikbereich des sich ergebenden Bildes zu maximieren (Vermeidung von Übersättigung). Scannen Sie den Behälter nur in der GFP1 Emissionskanal, mit einem 0,9 ° -Drehung Schritt. </ Li>
7. Nach Abschluss bestätigen Qualität der Datenerfassung mit Dataviewer-Software. Probe entfernen aus dem Scanner.
8. Um die anschließende histologische Untersuchung, Ort Probe in 100% Methanol für> 24 h vor der Bearbeitung zu ermöglichen Wachs als normale Paraffin.

4. Bildrekonstruktion und -analyse

Tomographische Rekonstruktion durch gefilterte Rückprojektion durchgeführt wird unter Verwendung NRecon Software oder ähnliches. Rekonstruktionen können unbeaufsichtigt durchgeführt werden, in den Reihen.

1. Verbesserung der Bildqualität durch Ausgleich der Fehlausrichtung und Einstellung der Bildintensitätsstufen.
2. Prüfen Sie die Qualität der Bildrekonstruktion mit Dataviewer-Software.
3. Identifizieren Sie den entsprechenden Abschnitt der Probe zur Analyse. Bewahren Sie diese Länge konsistent zwischen Schiffen, wenn luminalen Abmessungen sind aufzuzeichnen.
4. Definieren Sie den Überblick über die Läsionen durch manuelles Tracing die entsprechende Grenze für 1 in jeden 50 rekonstruierten Querschnitten.
5. Überprüfen Sie jede verschachtelt Querschnitt, um sicherzustellen, computer-generierte Interpolationen korrekt sind. Die Grenze manuell anpassen, wenn nötig.
6. Legen Sie die Grauwertschwelle, so dass nur die Läsion ausgewählt ist und exportieren Sie die Messdaten.
7. Für jeden Scan, definieren einen vertikalen Bereich von Interesse, die die Läsion und Spuren die Grenze zwischen Medien und Neointima (dh., Die Position der innere elastische Lamina) für jede ^{50-Scan-Linie.} Interpolieren Intima / Media-Grenzen für den verschachtelten Abtastzeilen in Software und überprüfen und korrigieren Sie den Sitz, wo erforderlich. Weitere Segment diese definierten dreidimensionalen Volumens zu einer manuell definierten Intensitätsschwelle um ein binäres Bild Satz, in dem weiße Pixel darstellen Neointima und schwarze Pixel darstellen Patent Lumen zu erzeugen.
8. Messungen sind: Gesamt Läsionsvolumen (Objektvolumen), Lumenvolumen (Volumen - Objektvolumen) und die Verteilung der Läsion und Lumenquer Sekteional Bereich entlang der axialen Länge des untersuchten Behälters.

Representative Results

Vorabtastung gesunder (unverletzten) murine Oberschenkelarterien (n = 5), dass Übertragungsabbildungs ​​keine präparativ Bilder. Dies war eine Folge der ausgeglichenen Adern immer zu transparent (anstatt zu opak) zur Übertragung imaging.However, ist dies vorteilhaft für die Emissions Bildgebung, da es keine Absorption / Streuung des emittierten Signals. Im Gegensatz dazu Autofluoreszenz Femoralarterien stark im Emissionskanal, mit dem größten Signal nach Anregung bei 405 bis 445 nm (im Einklang mit einer 410 nm Anregungsspitzen für Elastin ^14). 2-dimensionalen Schichten aus diesen Bildern rekonstruiert klar unterschieden das Medium aus dem Hohlraum und Adventitia und Lumen.

In murinen Oberschenkelarterien entnommen 28 Tage nach der Draht- (n = 6) oder Verknüpfungs (n = 5) induzierte Schädigung neointimale Verdickung zeigte sich in nicht-Tomographieemissions Vorsprüngen (3A). Im rekonstruierten 2-dimensional Scheiben könnte konzentrischen neointimale Läsionen aus den Medien von ihren schwächeren Emissions (3B und Abbildung S1) zu unterscheiden.

OPT Emissions Bilder der ganze Berg Proben des Aortenbogens und seiner Zweige von atherosklerotischen Mäusen (n = 8) identifizierten Läsionen, die mit der zu erwartenden anatomische Verteilung (dh., In der kleinen Kurvatur des Aortenbogens, der Truncus brachiocephalicus und die Ursprünge der linke Halsschlag und linken Schlüsselbeinarterien (4A). Schnittbilder angedeutet, dass es sich in der Regel exzentrische Läsionen und waren leicht von den Medien und Lumen (4B, Fakten S2 und S3).

Verarbeitung Arterien für die histologische Analyse folgende OPT bestätigte die zerstörungsfreie Art des OPT, mit Abschnitten mit histologischen (USA Trichrome, Picr erfolgreich gefärbtosirius rot) und immunhistochemischen (α-SMA, Mac-2) Techniken (3C und 4C).

Die Messung der Größe der Läsion mit OPT hat sich gezeigt, die mit Messungen mittels Bildanalyse von histologischen Schnitten von der gleichen Arterie ¹¹ entnommen erhalten sein.

Planimetrische Messungen Läsionsfläche von OPT und Histologie eng durch lineare Regression korreliert für drahtlose (R ² = 0,92) und Ligation induzierte (R ² = 0,89) neointimale Läsionen und atherosklerotischen Plaques (R ² = 0,85) erhalten. Ein wichtiger Vorteil der OPT ist ihre Fähigkeit, 3-dimensionale Analyse zu ermöglichen. Durch die Entwicklung von Volumen Quantifizierung von Läsionen, die mit dieser Technik konnten wir die Läsion Volumina in kabel Aufzeichnung (0,1100 ± 0,0091 mm ^3; n = 6) und Ligation-verletzten Oberschenkelarterien (0,0200 ± 0,0089 mm ^3; n = 5) und auch in atherosklerotischen brachiocephalic Arterien (0.180 ± 0,018 mm ^3; n = 8). Messungen wurden in hohem Maße reproduzierbar (Variationskoeffizienten von 5,4%, 11,4% bzw. 4,8%, bzw. n = 4) für alle Arten von Läsionen. Neointimale Läsionen in draht verletzten Gefäße waren größer (p <0,0001) als die durch Ligation erzeugt, im Einklang mit dem höheren Grad der Schäden, die durch die ehemalige Schaden ein.

Die erzeugten Daten können auch als Läsion Profile (5) ausgedrückt und für dynamische, qualitative Beurteilung gemacht werden (siehe S1 - S3). Dieser Ansatz zeigte deutlich die Ausdehnung der Läsionsbildung in Reaktion auf verschiedene Verletzungen Verfahren und hob die ungleichmäßige Verteilung der Bildung von Läsionen in verletzten Gefäßen.

Abbildung 1: Methoden für die Einleitung Läsion Bildung in Maus-Oberschenkelarterie & #.160 (a) Retrograde Insertion einer Angioplastie in die Femoralarterie Führungsdraht mittels einer Arteriotomie in der A. poplitea stimuliert die Bildung von Läsionen in Reaktion auf eine Verletzung und Entfernen des Endothels zu dehnen. Blutstrom über den verletzten Gefäßabschnitt wiederhergestellt. (B) Proliferation der Neointima in Abwesenheit von intraluminalen Streck Denudation oder Unterbrechung des Blutflusses kann durch Ligation entweder den Oberschenkel- oder Kniekehlenarterie unmittelbar distal zu der Bifurkation Oberschenkelarterie induziert werden. (C) Eine strengere nicht denuding Verletzung / Proliferationsantwort kann durch Ligation sowohl die Oberschenkel- und Kniekehlenarterien über den Verzweigungspunkt des gemeinsamen Oberschenkelarterie induziert werden. Diese Technik wird auch die Durchblutung in dem distalen Abschnitt des Oberschenkelarterie zu blockieren.

Abb. 2: Kenn Ablagerung von Atherom in der Maus Aortenbogen Atherosklerose neigen (Apolipopotein E defizienten Mäusen) gefüttert einen hohen Cholesterin-westliche Ernährung für 12 Wochen entwickeln ein charakteristisches Muster der Läsion Abscheidung in den Aortenbogen und seine wichtigsten Branchen. Wie gezeigt, Läsionen sichtbar (Pfeile), durch grobe Inspektion unter einem Binokular, im Aortenbogen, der Truncus brachiocephalicus und der Ostien der linken Halsschlagader und der linken Schlüsselbeinarterie.

Abb. 3: Bildung von Läsionen nach Ligation des linken Oberschenkelarterie (A) Nicht-Fluoreszenz-Emissionstomographiebilder (invertiert, um Klarheit zu erhöhen - dunkle Bereiche entsprechen stärkere Emission) die Identifizierung der Verdickung der Intima (red arrowheAnzeigen). (B) Ausgeprägte Gefäßregionen und das Lumen können in tomographischen Rekonstruktionen unterscheiden. (C) Die histologische Analyse (USA trichrome) betont die klare Ähnlichkeit mit Bildern mit OPT erhalten. Maßstabsbalken in (AC) sind 200 mm. Von Kirkby et al. ¹¹ Maßstabsbalken in (AC) angepasst sind 200 um.

Abb. 4: Imaging Atherom im Aortenbogen von Atherosklerose neigen Mäusen (A) Atherom (rote Pfeile) ist leicht ersichtlich, in einer Nicht-Schichtaufnahmen (invertiert, so daß dunkleren Bereiche zeigen stärkere Emission verbessert so die Klarheit) des Aortenbogens, in Websites wie vorhergesagt Atherom-Lager durch Inspektion unter dem Lichtmikroskop (siehe Abbildung 2). (B) Das Muster der Verteilung wird in tomographischen cr bestätigtoss-Sektionen. (C) Die histologische (USA trichrome) Färbung zeigt große Ähnlichkeit mit tomographischen Abschnitten und Immunhistochemie unter Verwendung von mehreren verschiedenen Antikörpern unterstreicht die Komplementarität von OPT mit traditionellen Ansätze zur Läsion Analyse. Maßstabsbalken in (A-B) sind 1 mm; Maßstabsleiste in (C) ist 250 um. RSA, rechten A. subclavia; RCA, rechte Halsschlagader; LCA, linken Halsschlagader; LSA, links subclavia; BCA, brachiocephalic Arterie; AAO, aufsteigend Aorta; Dao, Aorta descendens. Von Kirkby et al angepasst. ¹¹

Figur 5: Analyse der Läsion und Lumen Profile anzeigt unterschiedlichem Ausmaß der neointimalen Proliferation in Reaktion auf verschiedene Methoden der arteriellen Verletzung optische Projektionstomografie ermöglicht Läsion und Lumenquerschnitts Messung!.ts gegen Entfernung entlang der Oberschenkelarterie, aufgetragen werden. Dies zeigt deutlich, dass, verglichen mit einem unverletzten Arterie (A), partielle Ligation (B) erzeugt kleine, relativ diskreten Läsionen, die Gesamtbindung (C) produziert komplette Okklusion am Ort der Ligation, aber die Läsion nicht weit entlang der Arterie erweitern . Intraluminal Draht Schädigung (D) eine Läsion, die fast vollständig verschließt das distale Teil der Probe ist und sich entlang der gesamten Länge des abgetasteten Schnitt der Arterie. Von Kirkby et al angepasst. ¹¹

Abbildung S1. Animated Rekonstruktion der Schnittbilder nach Ligation Verletzungen von einer Maus Femoralarterie gewonnen. Dies ist Art von animiertes Bild nützlich für sowohl qualitative und quantitative Analyse. Als die Animation bewegt sich von dem proximalen zu dem distalen Abschnitt der Arterie die allmähliche Entwicklung eines okklusiven Neointima, Scheibenernible aus dem Lumen und der Medien, ist leicht ersichtlich. Seitenzweige können leicht identifiziert werden, und es ist offensichtlich, luminale Okklusion und nach außen Remodeling der Arterie wie die Läsion in der Größe zunimmt. Vollständige Verschluss des Gefäßes eintritt, nachdem der Ligationsstelle erreicht ist. Von Kirkby et al angepasst. ¹¹

.. Abbildung S2 Animated Rekonstruktion von Querschnittsbildern eines Aortenbogen aus einer Atherosklerose anfällig Maus Die Animation beginnt mit Querschnitten des aufsteigenden (links - die zuerst erscheint) und absteigend (rechts) Aorta. Kleine Läsionen erscheinen in der aufsteigenden Aorta als Scan bewegt sich in Richtung des Aortenbogens. Die Bilder dann durch den Bogen zu bewegen, um den stark lädierten Ostien des brachiocephalicus (links), linke Halsschlag (Mitte) und linken Schlüsselbein (rechts) Arterien zeigen. Da der Scan bewegt distal entlang dieser Zweige die Läsionen schrittweise zu reduzieren und verschwinden, zuerst in der subcLavian Arterie, dann in der Carotis und schließlich in die Arteria brachiocephalica. Interessanterweise ist die Läsion in der brachiocephalic Arterie bewegt sich auf den Strömungsteiler wie diesem Schiff teilt sich in die rechte Halsschlagader und rechten subclavia. Von Kirkby et al angepasst. ¹¹

Abbildung S3. Animation, Volumen-gerenderten Bild eines Aortenbogen aus einer Atherosklerose anfällig Maus. Optische Projektionstomografie erlaubt die Erzeugung von 3-dimensionalen Bildern, in diesem Fall demonstriert Läsion Verteilung in den Aortenbogen eines Apolipoprotein E-defizienten Mäusen. (A) Atherom ist in der erwarteten Stellen vorhanden (in der gesamten brachiocephalic Arterie, in der Ostien der linken Halsschlagader und subclavia und in der kleinen Kurvatur des Aortenbogens). (B) Segmentierung und Wiedergabe der Läsion (in rot) tragenden Querschnitte unterstreicht die Verteilung der Plaques, wenn sie auf dem Originalbild überlagert.Von Kirkby et al angepasst. ¹¹

Discussion

3-dimensionale Analyse hat ein großes Potenzial für den Ersatz oder zur Ergänzung der 2-dimensionalen histologischen Techniken, die immer noch den Großteil der Untersuchungen der arteriellen Läsion Bildung zu untermauern. Hier OPT in kleinen murine Arterien (mit Maus-Oberschenkelarterien wahrscheinlich, die die kleinsten Gefäße, die erfolgreich mit dieser Technik analysiert werden kann) gezeigt. Es ist jedoch auch für die Verwendung mit Arterien (und Läsionen) von anderen Arten, darunter kleine bis mittelgroße menschliche Gefäße; unsere Gruppe erfolgreich die Technik verwendet, um Läsionen in Kaninchenaorta analysieren (Bezuidenhout et al;. unveröffentlicht). OPT verspricht schnellere Analyse und eine erhöhte strukturelle Information im Vergleich zu herkömmlichen Histologie und hat den Vorteil der anschließenden Analyse der Probe unter Verwendung sowohl histologische und immunhistochemische Techniken nicht verhindert wird.

Die Verwendung OPT erzeugten Bilder gab anatomischen Details, welche Websites der Läsion Bildungund die Größe der Läsionen in diesen Bereichen. Die in diesen Untersuchungen verwendet Arterien sind wahrscheinlich in der Nähe der Grenze der Auflösung für die Technik und die Bildqualität wird daher zu einem gewissen Grad durch Artefakte (in der Regel von Drehfehlausrichtung, unvollständige Clearing, Reflexion / Refraktion an den Ecken Agarose und Fokussierung Probleme ergeben) beeinträchtigt . Trotz dieser, die Angaben (dh Schichten der Gefäßwand) erkennbar bleiben und somit der Technik ist äußerst nützlich für die Quantifizierung der einzelnen Schichten. Tatsächlich könnte Bilder schnell und reproduzierbar zu quantifizieren, um Messungen der Läsion und Lumenvolumen in Plaque-Lagerabschnitte des Schiffes sowie Querschnittsflächen der Läsion und Lumen an ausgewählten Stellen in der Probe bereitzustellen. Large (Aorta) und mittlere (Oberschenkel, Carotis, subclavia) murine Arterien - diejenigen, die allgemein für die Analyse von atherosklerotischen und neotintimal Läsion Bildung in Mäusen verwendet - erfolgreich warenanalysiert mit dieser Methode. In der Tat haben wir nun verwendet OPT, um die Wirkung von pharmakologischen Interventionen und genetische Manipulation auf atherosklerotische und neointimale Läsion Größe zu demonstrieren. Zum Beispiel Endothelin-Rezeptor-Blockade verändert neointimale Läsion Bildung in der Erwägung, selektives Löschen des Endothelin B Rezeptor aus der vaskulären Endothel nicht ^15. Bei der Atherosklerose neigen Mäusen wurden genetische Deletion der Enzyme 11β-HSD1 ¹⁶ oder Galectin 3 ¹⁷ gezeigt, um die Größe von atherosklerotischen Läsionen zu verringern.

Die Quantifizierung der Läsionsvolumen ist eine offensichtliche Vorteil der OPT. Es gibt eine informative Anzeige der Gesamtlast Läsion in einer Arterie ⁴ als normalerweise mit histologischen Methoden erhalten. Analyse des gesamten Läsion reduziert Selektionsbias und Fehler, die unweigerlich auftreten, wenn einzelne Abschnitte eines Gefäßes für die Analyse ausgewählt. Herstellung von Längsprofilen Läsion ist eine weitere Stärke des OPTDurch den Vergleich von Läsionen, die durch verschiedene Arten von Verletzungs ^13,16 (Abbildung 5) induzierten hervorgehoben. Beispielsweise können sowohl vollständige Ligation und Drahteinführungs induzierte fast vollständigen Verschluss der Nähe des femero-poplitea Bifurkation. Draht Schädigung erzeugte jedoch Läsionen, die entlang der gesamten Länge des abgetasteten Abschnitt verlängert, während Läsionen durch Arterienligation induziert rasch verkleinert und verschwinden. Dieses Muster stimmt mit dem größeren Umfang der Verletzung durch Insertion des Angioplastie-Führungsdraht verursacht. Erzeugen ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von histologischen Schnitten ist teuer, zeitaufwendig und arbeitsintensiv.

Die Vorteile des OPT gehören die Qualität der Bilder, sie produziert und dessen relative Geschwindigkeit und Einfachheit (wir routinemäßig gescannt 20 Schiffe pro Tag). Bildqualität angezeigt überlegen oder zumindest vergleichbar sind, zu anderen Verfahren zur Erzeugung von 3-dimensionalen Bildern ex vivo (wie MRI und Mikro CT), yet OPT erfordert kürzere Scanzeiten (Integrationszeit für unsere Studien war typisch 1-2sec / Bild) und ist weniger teuer. Probenvorbereitung erstreckt sich über mehrere Tage benötigt aber wenig Arbeit können Gefäße in Chargen hergestellt werden, und die Daten können in einem Durchgang erfasst werden. Folglich ist Hochdurchsatz und erweiterte Nutzung der Scanner nicht erforderlich. Wichtig ist, dass die nicht-destruktive Natur des OPT bedeutet, es kann verwendet werden, um Seiten von Interesse für die immunhistochemische Untersuchung zu identifizieren; wodurch die Menge an Schneidreduktions und Färben erforderlich. Es ist möglich, dass die Entwicklung von hochauflösenden Ultraschalls wird ein alternatives Verfahren zur volumetrischen Quantifizierung von Läsionen in Arterien diese Größe bereitzustellen, aber die Autoren keine Kenntnis von Publikationen, die diese Anwendung zeigen.

Vielleicht nicht überraschend, ist die Bildqualität in OPT legen mikroskopischen Techniken (die natürlich nur auf kleinere Stichproben durchgeführt werden können). Vorgeschlagene Verfeinerungen wiederaufbaun von Daten kann diese Einschränkung zu beheben, indem zukünftige Verbesserung der Bildqualität ^19,20. Ein weiteres Anliegen ist, dass methodische Gewebebearbeitung verändert Eigenschaften der Probe. Zum Beispiel die lipophile Natur der Clearingstelle, dürfte Lipid von atherosklerotischen Läsionen zu entfernen, während vor Austrocknung kann Schrumpfung führen (obwohl natürlich auch Dehydration und Lipidentfernungsschritte eine Funktion von Benzylalkohol / Benzylbenzoat (BABB) Probenvorbereitung für die Einbettung in Paraffin). BABB wurde in dieser Untersuchung als verwendet wird, im Vergleich zu hydrophilen Clearingstellen (zB Glycerin ²¹⁾ es nur kleine Veränderungen in der Morphologie bewirkt.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten für die weitere Entwicklung und Verfeinerung der OPT, insbesondere im Hinblick auf die Verfolgung der 3-dimensionale Anordnung von Schlüsselzellen und Signalfaktoren im arteriellen Remodeling beteiligt. Die starke Autofluoreszenz Arteriengewebe, das eine solche istn Vorteil bei der Erzeugung von anatomischen Bildern wird nicht durch bestehende Verfahren zum Bleichen von ²² abgeschreckt und können die Verwendung von Fluoreszenzsonden zu beschränken, um RNA und Proteinverteilungsmuster zu beurteilen. Die Verwendung von farbmetrischen Sonden (zB β-Galactosidase) durch Übertragung Bildgebung visualisiert kann diese Einschränkung zu überwinden.

Abschließend weist OPT großes Potential für 3-dimensionale Darstellung von Läsionen in der Intima von murinen Arterien. Es stellt einen erheblichen Fortschritt gegenüber 2-dimensionale Methoden, die in der Regel sind arbeitsintensiv und nicht wirksam vertreten Gesamt Läsionsvolumen. OPT ist relativ schnell, bequem und zerstörungsfrei. Neue Entwicklungen in der Bildanalyse versprechen, die Macht und die Nützlichkeit der Technik weiter zu erhöhen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating Microscope	Zeiss, Germany		OPMI Pico i
Anesthetic Machine	Vet Tech, UK
Fluovac	Harvard Apparatus UK	340387
Fluosorber	Harvard Apparatus UK	340415
Bead Sterilizer	Fine Science Tools, UK	1800-45
Heated Mat	Fine Sceince Tools, UK	21061-10
Balance	Mettler Toledo	MS1602S	PB1502 or equivalent
Sutures	Ethicon, UK		5/0 Mersilk
Guidewire	Cook Inc, USA	C-PMS-251	0.014”
Suture Silk	Fine Science Tools, UK	18020-60	6/0 Mersilk
Surgical Tools	Fine Science Tools, UK	14058-09	Toughcut Iris scissors
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools, UK	15000-01
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools, UK	11251-35
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools, UK	11370-31
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools, UK	13008-12
Bulldog clips	Fine Science Tools, UK	18050-35
Bioptonics 3001 Tomograph	Bioptonics, UK
Magnetic OPT Mount	Bioptonics, UK
Computer	Dell Inc, UK
Peristaltic pump	Gilson	F117606	Minipuls 3
DataViewer software	Skyscan, Belgium	v.1.4.4
NRecon software	Skyscan, Belgium	v.1.6.8
CTan software	Skyscan, Belgium	v.1.12
Isoflurane	Merial Animal Health Ltd, UK	AP/Drugs/220/96	100% Inhalation vapor, liquid
Medical Oxygen	BOC Medical, UK	UN1072
Vetergesic	Alstoe Animal Health Ltd, UK		0.3 mg/ml
1% Lignocaine	Hamlen Pharmaceuticals, UK	LD1010	10 ml ampoule
EMLA Cream	Astra Zeneca, UK
Sodium Pentobarbital	Ceva Animal Health Ltd, UK
Western Diet	Research Diets, USA	D12079B	0.2% cholesterol
Phosphate Buffered Saline	Sigma UK	P4417
Heparin (Mucous)	Leo Laboratories, UK	PL0043/003GR	250,000 Units
Neutral Buffered Formalin	Sigma, UK	HT501128	10%
Ethanol	VWR BDH Prolabo, UK	20821.33	Absolute AnalaR
Agarose	Invitrogen, UK	16020050	Low melting point
Filter Paper	GE Healthcare, UK	113v	Whatman
Cyanoacrylate adhesive	Henkel, UK	4304	Loctite
Benzyl alcohol	Sigma, UK	B6630
Benzyl benzoate	Sigma, UK	402834
Methanol	VWR BDH Prolabo, UK	20856.296	100%