Summary
Примером нано препарата на основе polymalic кислоты представлена к рациональной конструкции персонализированной медицины, который применим к раку. Он описывает синтез нано препарата для лечения HER2-положительного рака молочной железы человека в голой мыши.
Introduction
В пост-геномной эры, когда геномы рака были разгадали (Национальный центр биотехнологии и Атлас генома рака), будущее лечения рака будет приходиться генетического разнообразия опухолей часто в течение той же опухоли 1-4. Биоинформатика и быстро, не дорого Секвенирование ДНК позволяет приобретение злокачественных генов / мутаций на личном уровне 2,4,5. После того, как гены были идентифицированы, пациенты будут относиться с персонализированной медицины, чтобы изменить или заставить замолчать свое выражение злокачественных генов 6. Необходимость целевой раковые клетки и доставлять лекарства в эти клетки призывает полифункциональных систем доставки. Очевидно, нано препараты могут выполнить это требование 7.
В помпажа волны открытий наночастицы оказались пригодны принести полезных нагрузок химиотерапевтических препаратов, белков и / или генетически активного материала на раковые клетки. Тем не менее, побочные эффекты остаются объявлениеодет. Один из них связан с отсутствием способности к биологическому разложению может вызвать осаждение материала в здоровой ткани и органы с вероятностью спровоцировать заболевания. Чтобы свести к минимуму осаждение, мы ввели нетоксичный и неиммуногенных polymalic кислоту, которая является микробного происхождения и биологическому разложению в H 2 O и CO 2 8. Мы используем полимер синтезировать все-в-одном тип ковалентной нано препарата. Он содержит химически прикреплены химиотерапии, такие как Temozolomide, доксорубицин, или антисмысловых олигонуклеотидов и функциональных групп, обслуживающих экстравазацию, адресности тканей, эндосомолитического доставку. Препараты неразрывно снимают с нано платформы, когда они прибыли в целевой опухолевой клетки, тем самым регенерации их полного фармацевтической деятельности.
Мы описываем метод микробной производства полимерной нано платформы, его очищение, и химический синтез нано препарата, который содержит трастузумаба (Герцептин) для раканацеливание и антисмысловой олигонуклеотид для ингибирования HER2 перепроизводства. При применении нано препарат ксеногенной человеческого рака молочной железы HER2-положительным на голых мышей, мы демонстрируем высокую эффективность лечения рака. Принципы таргетинга опухоли и молчание генов, введенной здесь polymalic нано кислоты препаратов может применяться в лечении других случаев рака.
Protocol
Все эксперименты отвечают официальным правилам животных, включая хирургических и нехирургических процедур, выполненных в естественных условиях и находятся в полном соответствии с протоколами IACUC.
1. Биопроизводство из Polymalic кислоты
- Расти посевной культуры сферулах на агар и передавать плазмодии до 100 мл культуральной среды с использованием 25 ° C Термо заявил инкубатор и базальной культуральной среды 8,9.
- Производят количество гравитационных упаковке 500 мл микро плазмодий при исключении света, чтобы избежать образование спор.
- Подготовка 80 г СаСО 3, взвешенных в 8 L базальной среды в 10 л биореактора. Передача 500 мл упакованных микро плазмодии в смонтированном реакционного сосуда и позволяют биотехнологического в течение 75 ч при 25 ° С, 10 л / мин потока отфильтрованного воздуха и перемешивании 150 об сегментом мешалкой.
- Завершить когда культура бульон имеет рН 4,8 указывает на конец производства PMLA и измерения содержания PMLA Тон гидроксаматный / Fe (III) анализа.
- Охладите отвар до 17 ° С и позволяют клеткам урегулировать под действием силы тяжести.
- Охлаждают до 4 ° С и доведения рН до 7,5 с помощью 2 М NaOH. Насос супернатанта через колонку, заполненную 1,5 л ДЭАЭ-целлюлозе в направлении снизу вверх (грубый DEAE зерно, уравновешенную 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 при 5 ° С).
- Промыть 3 колонкам буфере, содержащем 0,3 М NaCl после изменения направления сверху вниз и элюируют PMLA в присутствии 0,7 М NaCl.
- Отрегулируйте до 0,1 М CaCl 2 и осаждают PMLA-Кальций 80% ледяной этанола. Фракционирования над Сефадекса G25 в PMLA-кальция 80 - 300 кДа, 50 - 80 кДа и 10 - 50 кДа, использовать воду в отсутствие буфера и соли.
- Передайте каждую фракцию над 120H Амберлит ИК + колонки, и сразу же заморозить проточный polymalic кислоту в жидком азоте для лиофилизации.
- Растворите в сухом ацетоне. После фильтрации, удаления растворителяв сухом воздушного потока, лиофилизировать и хранить при минус 20 ° С.
2. Синтез Polymalic кислота основе Nano наркотиками
- Активация карбоксильных групп PMLA (Р) путем смешивания 116 мг (1 ммоль malyl единиц) PMLA-H в 1 мл безводного ацетона и 1 ммоль N-гидроксисукцинимид и 1 ммоль дициклогексилкарбодиимид carbodimide в 2 мл диметилформамида (ДМФ). Перемешивают при 20 ° С в течение 3 часов. Добавить 0,05 ммоль мПЭГ 5000-NH 2 (0,05 моль% от malyl единиц) в 1 мл ДМФА с последующим 0,05 ммоль триэтиламина (TEA).
- Добавить по каплям раствор ли в ДМФ 0,4 ммоль лейцин этилового эфира (Loet) (40% мол malyl единиц), 0,1 ммоль 2-тиол-1-этиламина (2-MEA) (10% мол malyl единиц) и 0,5 ммоль TEA, все растворяют в ДМФА. После каждого добавления позволить 1 час и проверки завершения реакции по отрицательный ответ нингидрина (после тонкослойной хроматографии, тонкослойной хроматографии).
- Ли удалить остатки NHS-эфир спонтанным гидролиза с фосфатно-солевом буфере (30 мин, рН 6,8). Опреснения над PD-10 Колонка, получить "preconjugate" в виде белого порошка путем лиофилизации. Магазин сухой при температуре минус 20 ° С.
- Растворите 30 мг антитела (MAB, IgG2a-κ) в 4,5 мл 100 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, рН 5,5.
- Уменьшение дисульфидные связи с 5 мМ трис (2-карбокси-этил) фосфин гидрохлорида в течение 30 мин при 20 ° С и очищают над PD-10 колонке.
- Растворить Mal-PEG 3400-Mal в 2 мл того же буфера и добавить снижение мАт в конечном объеме 10 мл и перемешивают в течение ночи при 4 ° С. Сконцентрируйтесь на 2,5 мл в течение Vivaspin 20, исключение 30 кДа и очистить более Сефадекса G75. Убедитесь, произведение по SEC-HPLC и измерить количество фотометрически при 280 нм.
- Прикрепите Mal-ПЭГ-Mal-МАБ в "preconjugate" тиолов получение P / ПЭГ 5000 (5%) / Loet (40%) / МКА (0,2%) / 2-MEA (10%). Сделайте это путем смешивания 5 мл 200 нмоль МКА-PEG 3400-Mal до 50 мг (Р / MPEG 5000 / LOEt/2-MEA) в приведенном выше буфера, рН 5,5, отрегулируйте концентрацию sulfhyДрыль до 2 мм и инкубируют при 20 ° С в течение 3 ч. (выход 98%).
- Солюбилизировать 3'-H 2 N-АОН в ДМФ / PBS (рН 7,2) и реагируют с N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионат (SPDP) в (1:1 об / об) в ДМФА / метанол (нингидринового теста ) и очистить АОН-ПРП над Сефадексе-LH20 в метаноле, затем в воде и лиофилизировать.
- Выдержите 800 нмоль активированные AONs в буфере 5,5 рН с выше подготовленного Мал-PEG 3400-Мал-МКА-preconjugate ночь, пока реакция обмена дисульфида не будет прекращено.
- Включение люминесцентные Alexa Fluor 680-малеимида формирования тиоэфирной с полимером-2-MEA-SH. Блок лишние sulfhydryls с 3-пиридилдитио-пропионата (PDP) и очистить более Сефадексе G75. Хранить при 4 ° С или замораживали при -80 ° С до дальнейшего использования.
3. Анализы и свойства
- Выполнение тестов для чистоты и стабильности в PBS и сыворотки при 4 ° С и 37 ° С с помощью анализа SEC-HPLC. Используйте полистиролсульфонатным как Molecулар стандарты веса. Измерьте распределение размера нано и дзета-потенциал. Используйте коммерческие системы.
- Добавить в 320 мкл образца 160 мкл 10% (вес / объем) хлорида гидроксиламмония и 160 мкл 10% (вес / объем) NaOH. После 10-15 мин, смешивают с 160 мкл 5% (вес / объем) Fe (III) Cl 3 в 12% (объем / объем) HCl и прочитать 540 из гидроксамата / Fe (III). Рассчитать PMLA предполагая 1 мг / мл PMLA соответствует 2,5 A 540.
- Гидролизуют нано препарат в течение ночи в 2 М HCl при 110 ° С и анализ яблочная кислота в хроматографии с обращенной фазой со ссылкой на образцах с шипами со стандартами яблочная кислота. Сколите нано препарат с 100 мМ дитиотреитола и измерить морфолинодоксорубицин АОН с помощью количественной обратной фазой по стандартам Морфолино АОН.
- Возьмите нано препарат без расщепления и измерить антитела с использованием набора для анализа белка. Количественная мПЭГ, позволив своему реакцию с ferrothiocyanate аммония, а затем извлечь хлороформом и измерить оптическую плотность при 510 нм длиной волны 10
- Выполните ELISA с 5 мкл нано препарата (1-10 мкг МАБ) в испытании скважин активность антител и colligation. С помощью 0,5 мкг / лунку рецептора трансферрина и HER2, соответственно, как пластины с покрытием антигенов и пероксидазой вторичных антител в сочетании.
- Рассчитать достигнутый% для АОН, MPEG и МАБ в отношении яблочной кислоты (100%) и сравнить с% с намерениями дизайна (см. примеры в таблице 1 и таблицу 2).
4. Экстракорпоральное Тестирование
- Инкубируйте нано препарат с культивируемых раковых клеток и меры выживших клеток в течение долгого времени по их активности, чтобы уменьшить желтого реагент [3 - (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5 - (3-карбоксиметоксифенил) -2 - (4-сульфофенил )-2H-тетразолия, внутренняя соль] (MTS) в синий краситель и читать относительное поглощение при помощи фотометра. Следуйте инструкциям на комплекте поставщика.
- Подготовка клеточных экстрактов в пробирке или экс естественных условиях для вестерн-блоттинга. Используйте ледяной экстракции бuffer который содержит SDS и ингибитор протеазы коктейль. Отдельные белки за счет снижения гель-электрофореза в SDS-полиакриламидном.
- У Вестерн-блоттинга белков, представляющих интерес в образце экстрактов. С помощью вторичных антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой.
- Используйте конфокальной микроскопии продемонстрировать поглощение клеток и ко-локализацию нано наркотиков полимерной платформы, АОН и эндосомах помощью флуоресцентной маркировки. Прикрепите Alexa Fluor 680 к нано сопряженной платформы и Lissamine в АОН как флуоресценции этикетки. Используйте микроскоп 5X спектральный сканер и живые раковые клетки визуализировать распределение меченых молекул
- Пятно эндосоме мембраны с Стирил Красной флуоресцентным красителем и продемонстрировать эндосом колокализацию или освобождение.
В естественных условиях Тестирование 5.
- Подготовьте человека HER2-положительным раком молочной железы мыши модель (обнаженная Tac мыши: Cr: (MCR)-Foxnnm). Вставьте 0,72 мг 17β-эстрадиола выпуская шарик (90-дневная релиз) сubcutaneously в шейке каждой мыши.
- Тогда придать 1 х 10 7 BT-474 опухолевых клеток подкожно в правый бок и пусть опухоль расти.
- Начинать лечение, когда опухоли 120 мм 3 в размерах путем инъекции в хвостовую вену 150 мкл конъюгата нано, содержащий 2,5 мг / кг АОН и / или 4,5 мг / кг каждого антитела. Для лечения вводить два раза в неделю, полностью шесть раз.
- Измерьте размер опухоли с суппортами дважды слабых и рассчитать объемы по формуле (длина х глубина х ширина) х (π / 6). Эвтаназии животных через 2 недели после последней инъекции и после седации с раствором кетамина и дексмедетомидина с последующим смещением шейных позвонков.
- Изолировать опухоли и пятна разделы с H & E для оценки морфологического.
- Для оценки распределения наркотиков на шкале животных, использовать систему формирования изображения флуоресценции. Введите Alexa Fluor 680 помечены нано наркотиков и изображение в 24 и 48 часов.
- Усыпить животное и обнаружить Fluorценции в изолированных и перфузированных опухолей и органов.
Representative Results
Ингибирование человеческой рака молочной железы HER2-положительным глушителей экспрессии рецептора HER2 и блокирования HER2-сигнализации 12
Стратегия
Среди различных форм рака молочной железы человека, HER2-положительные опухоли имеют худший клинический исход. Мы представляем успешное лечение человека рака молочной железы HER2-гиперэкспрессией в обнаженном мышиной модели. Стратегия включает в себя нано препарат активно и в непосредственной молчание сигнального пути HER2, использующей Герцептин и HER2-специфический АОН для блокирования HER2-мРНК в зависимости синтез рецептора (рис. 1). Ведущий сопряжены нано, который содержит Герцептин и анти-HER2 АОН показано на рисунке 3 вместе с двумя контроля, которые лишены либо Герцептина или АОН. Ведущий соединение, содержащееся анти-MsTfRmAb для достижения активного экстравазацию по трансцитозом беспересадочныйтьфу привязки к эндотелиальной TfR из сосудов опухоли. Гораздо меньше поглощение в опухоль была отмечена в отсутствие антитела и были отнесены к опухоли зависимого эффекта ЭПР 13. Люминесцентные версии нано конъюгатов, содержащих Alexa Fluor 680 были синтезированы для визуальных исследований.
. Рисунок 1 Механизм АОН доставки в HER2-положительным раком молочной железы клеток и ингибирования роста опухоли левый верхний угол:. Нано сопряжены адаптировано из рисунке 3. Нижний левый угол: Mouse опухолевые сосуды, выражающие TfR на поверхности. Нано препарат связывается с рецептором и входит в опухоль путем трансцитоза. Кроме того, некоторая степень доступа к опухоли можно через неупорядоченных эндотелиальных слоев, которые участвуют в опухоли в зависимости увеличенное всасывание и retentiна (ЭПР) 13. Далее, nanodrug связывается с HER2 экспрессируется на раковых клетках человека и усваивает в ранних эндосом. Связывание также блокирует HER2 сигнального пути. После созревания эндосомах и их подкисления, ядрышко побег механизм нано препарата активируется. Nanodrug ввода в цитоплазму высвобождается из нано платформы восстановительным расщеплением дисульфидной спейсером и связывается с HER2-мРНК блокирования HER2-синтез. Блокирование синтеза расширяет блокирование HER2 сигнализации и вызывает задержку роста опухоли.
Микробная производство платформы polymalic кислоты
Нано сопряжены платформа, polymalic кислота (PMLA), был произведен культурного microplasmodia из Physarum polycephalum и очищенный из бульона, как описано в протоколе и, изображенной на рисунке 2. Производство и очистка были гладкими и воспроизводимым. Важно было продолжение следует ROL время, рН и температура, чтобы избежать спонтанное расщепление полимера. Тщательное мытье и вымывание ДЭАЭ-колонке рекомендуется для удаления ДНК, углеводы, токсины и цветной материал. Экстремальные чистота была получена после растворения в безводном ацетоне и удаления нерастворимого материала. Общий объем произведенной PMLA было 5 ± 1 г на кампании. Суммы 1,5 ± 0,5 г высокой степени очистки PMPLA М ж 80,000-100,000 были воспроизводимо достигается при использовании 10 л биореактор. SEC-HPLC профиль элюции были симметричными. Динамический анализ рассеяния света в соответствии с распределением числа указано один пик, соответствующий гидродинамической диаметром 8 ± 1 нм и показатель полидисперсности PDI = 0.10 ± 0.02, рассчитанный с помощью программного обеспечения прибора для предполагаемых сферических частиц. Зета-потенциал был -22 ± 2 мВ (рН 7,5).
/ 50668/50668fig2highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 2. Производство и очистка polymalic кислоты из культивируемых микроорганизмов плазмодиев из Physarum polycephalum (взято из Ли и др.. 9). Polymalic кислоты (PMLA) получают из плазмодий из Physarum polycephalum в биореакторе и собирают из культуральной надосадочной жидкости путем связывания на анионита (ДЭАЭ). Элюент этанол-осаждают в виде кальциевой соли. Растворы соли кальция являются Mw фракционировали в течение Sephadex G25-. PMLA содержащие фракции преобразуются из Са-соли в кислоту над амберлит ИК-120H +. Свободный PMLA, наконец, лиофилизировали с получением сухой белый порошок.
Химический синтез главного конъюгата нано
P / MPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / АОН (2,5%) / Герцептин (0,2%) / NTI-MsTfRmAb (0,2%)
Принципиальные структуры ведущего нано препарата и двух нано предшественником конъюгатов показаны на Рисунке 3. Ведущий содержит все компоненты, в то время как предшественники были разработаны, чтобы не хватает либо АОН HER2 или антител Герцептина. Кроме АОН и моноклональных антител, соединения, содержащиеся полиэтиленгликоль, MPEG 5000, чтобы свести к минимуму связывания с белками плазмы, зазор через ретикулоэндотелиальной системы (РЭС), и деградации в результате ферментативного расщепления. Последовательность антисмысловой 5'-CAT-ГГТ-GCT-САС-ТГК-GGC-TCC-GGC-3 'дополняет Her2 мРНК и был тщательно протестирован в лабораторных несколько HER2-выражения клеточных линий для получения высокой специфичностью к блокирования HER2 синтез и не хвастаясь-воздействие на цель.
8/50668fig3highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 3. Нано сопрягает для лечения человека рак молочной железы HER2-положительным. Ведущие нано препарат (структура высшего) содержит два наркотики (Герцептин, АОН HER2). Версии 2 и 3 содержат только один из препаратов. Поглощение 1 и 2 в HER2-экспрессирующих опухолевые клетки человека управляется связывание Герцептина. Нано сопряжены 3, который не содержит Герцептин, получил анти-HuTfRmAb для поглощения эндосом на человеческих клетках. Сопряжение с Alexa Fluor 680 была необязательной для целей визуализации. Красная полоса представляет собой нано сопряженную платформу PMLA / Loet (40%). % Обозначает долю остатков яблочная кислота, потребляемых в связывание указанного лиганда (общее количество кислотных остатков яблочной в nanodrug = 100%).
Рисунок 4. Химический синтез наносопряженные P / Loet / АОН HER2 / anti-MsTfR/Herceptin Сверху вниз:. Синтез PMLA-N-гидрокси сукцинимидиловым эфиром (PMLA-NHS) висячих карбоксилатами (химической активации). Замена NHS образованием амидной с 2-меркапто-1-аминоэтан (2-MEA), метил-PEG 5000-амин (мПЭГ 5000-NH 2), trileucine (LLL) или лейцин этиловый эфир (Loet). Это "preconjugate" придает MAB-Mal-ПЭГ-Мал по тиоэфирной формирования и АОН по образованию расщепляемых дисульфидных связей. Остатки 2-MEA ограничен формирования amidoethyl-дитио пропионовой кислоты. Только прикрепление одного мАт показано. Несколько вложения управляются с помощью смеси моноклональных антител. Процент% обозначает фракции карбоксилатами, связанных с различными лигандами (100% бесплатно PMLA).
Нано конъюгаты были синтезированы, как описано на Рисунке 4. Рассчитанная молекулярная масса свинцаконъюгат 719000. Общий выход синтеза составила 45 ± 5% в отношении содержания кислоты яблочной. В среднем, из 862 malyl единиц (= 100%) платформы кДа PMLA 100, 40% осуществляется Loet, 5% MPEG, 2% АОН 2%, 0,2% Герцептин и 0,2% анти-MsTfR мАт. Сумма для каждого антитела соответствует в среднем на 1,7 молекул на молекулу платформы PMLA. % Разработаны и% проверяется группового анализа были такими же, в пределах ± 5%. Примером может служить случай приведены в таблице 1 для расчета экспериментального содержания яблочной кислоты, АОН, монАТ и мПЭГ 5000 и в таблице 2 показано сравнение с содержанием продукта. Высокой чистоты в соответствии с критериями по разделу 3 было достигнуто на основе высокими выходами реакции и эффективное разделение с помощью гель (например, свободный мАт и мАт-nanoconjugate разделены 1 мин на SEC-HPLC), а также селективной растворимостью в растворителях. Активность моноклональных антител было Показано, что сохраняется на протяжении нано синтеза наркотиков, и было подтверждено, что эти два вида антител были собраны на той же полимерной платформы. Результатом атипичной эксперимента ИФА показано на Рисунке 5. В общем, анализы для количественного анализа группы для яблочной кислоты, АОН, белка, ПЭГ и для ELISA были надежными, что дает воспроизводимые результаты, когда проводится разных кадров и аппаратуры, не только в случае отчетный синтеза, но также и при использовании для анализа других синтезированных nanoconjugates.
Таблица 1. Расчет nanodrug композиции со ссылкой на содержание кислоты яблочной.
668table2.jpg "ширина =" 600 "/>
Таблица 2. Сравнение экспериментального нано лекарственной композиции с разработанной композиции.
Рисунок 5 ELISA. Для измерения аффинности антитела после химического синтеза, и для демонстрации многократного связывания различных антител. Нано Препарат содержит антитела мАт (а) и антитело монАТ (B) против антигенов А и В, соответственно. ELISA планшеты сенсибилизируют антигеном (A). Свободный мАт (А), свободной мАт (B), и нано препарат наносят на ELISA-планшетах. После промывки, антитела тестируют с пероксидазой вторичных антител, специфичных в сочетании либо мАт (а) или мАт (B), в то время как только мАт (A) связан с антигеном (A). Видно, что свободный и нано препарат, конъюгированного с мАт (A), так и косвенно, конъюгированный мАт (B) того же нано молекулы лекарственного средства, но не свободный мАт (B), Сохраняются на тарелке. Зависимость концентрации показывает сравнимые аффинности связывания для свободного и связанного мАт (А), что указывает на химическое конъюгирование не влияет на активность связывания антитела. Кроме того, со-перевязка МКА (B) с МКА (А) на том же физического лица (нано платформы) приводит к выявления антител МКА (B). Экспериментальные результаты, показанные здесь, относятся к анти-человеческого TfRmAb (А) и анти-мыши TfRmAb (B). Аналогичные результаты были показаны для других антител пар тестируемых, таких как анти-MsTfR монАТ и анти-HER2 мАт (Herceptin).
Физико-химический расследование показало, гидродинамический диаметр 22,1 ± 2,3 нм для P / MPEG (5%) / Loet (40%) / АОН (2%) / Герцептин (0,2%) / анти-MsTfRmAb (0,2%) (свинец, двух- версия наркотиков), 20,1 ± 2,4 нм для P / MPEG (5%) / Loet (40%) / АОН (2%) / анти-MsTfRmAb (0,2%) / анти-HuTfRmAb (0,2%) (версия АОН наркотиков) и 15,1 ± 1,2 нм для P / MPEG (5%) / Loet (40%) / Герцептин (0,2%) (версия Герцептин препарат). Дзета-потенциалы при рН 70,5 были в таком порядке -5,2 ± 0,4 мВ, -5,7 ± 0,6 мВ, и -4,1 ± 0,4 мВ. Следует отметить, что измеренное гидродинамический диаметр нано конъюгатов не следовал аддитивность диаметров, измеренных бесплатные компонентов.
Доставка нано препарата через мембране опухолевой клетки и выпустить в цитоплазму после 0 ч и 3 ч т
Доставка нано препарата через клеточную мембрану по поглощению эндосом показано на Рисунке 6 после 0 ч и 3 ч. Флуоресцентные метки прикреплены к нано лекарственной платформы (Alexa Fluor 680, зеленый) и АОН (Lissamine, красный). Их суперпозиция показан на панели D & L и вместе с флуоресценции меченых эндосомах (синий) в панели G & O. Коэффициенты корреляции Пирсона (R (г) были рассчитаны из изображений относительно совместной локализации Платформа / эндосомах, АОН / эндосомы, платформа / АОН для 0 ч и 3 ч. Tон 3 часа изображение показано высвобождение из эндосом в цитоплазму и диссоциации АОН от нано препарата по глутатион-зависимой дисульфидной расщепления в цитоплазме.
Рисунок 6. Конфокальной микроскопии для нано сопряженной поглощения клетками-мишенями (взято из Дин и др.. 11). Клетки инкубировали в течение 30 мин при 37 ° С с нано препарата, который был дважды меченного Alexa Fluor 680 (зеленый) на полимерной платформы и с Lissamine (красный) прикреплен к АОН. Кроме того, эндосомы окрашивали FM1-43 (синий). Локализация показан после 0 ч (а) и 3 часа (B) инкубации. Панели, AB, и B, И.Я. шоу окрашивание по нано сопряженных только флуорофорами, иих совместная локализация в A, кд & B, KL. Кроме того, окрашивание эндосомах показан на панели, э & B, м и колокализации нано конъюгату и endosomesin панелей А, Ф. & B, нет. Панели, ч & B, стр. шоу фазового контраста для соответствующих панелей. (С) корреляция Пирсона коэффициенты R (г) для колокализации платформы эндосомах, АОН-эндосомах, платформы-АОН, рассчитанной для 0 ч и 3 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное рисунке.
Ингибирование рака молочной железы человека в пробирке и в естественных условиях
Ингибирование роста HER2 гиперэкспрессией клеточной линии BT-474 в комнению с низким выражая клеточной линии MDA-MB-231 показано на Рисунке 7. Степень ингибирования составляет 50% и 30%, соответственно, от ведущего нано сопряженной P / MPEG / Loet / АОН HER2 / Герцептин / анти-MsTfRmAb. Ингибирование других соединений меньше, но выше для ВТ-474, чем для MDA-MB-231 клеток. Линия клеток ВТ-474 был выбран для лечения ксеногенного мыши рака молочной железы.
На рисунке 7. Ингибирование in vitro рост HER2 гиперэкспрессией BT-474 клеток рака молочной железы и низкий выражения MDA-MB-231 клетки (адаптировано из Inoue и соавт. 12). Сравнение ингибирования роста для HER2 гиперэкспрессией BT-474 раковых клеток молочной железы линии ( слева) и HER2 низким выражая линию клеток рака молочной железы MDA-MB-231 (справа). TfR (ы) обозначает анти-MsTfRmAb и TfR (Ху / Ms) обозначает анти-HuTfRmAb & анти-MsTfRmAb. Ведущий нано препарат, P / MPEG / Loet / АОН HER2 / Герцептин / TfR (г-жа), и нано препараты, лишенные любой Герцептина или АОН HER2 сравниваются с PBS, Герцептин и АОН HER2. При отсутствии Герцептин, анти-MsTfRmAb конъюгируют чтобы обеспечить поглощение эндосом опухолевыми клетками. Концентрации были 40 мкг / мл в отношении антител, 4 мкМ по отношению к HER2 АОН, 4 мкМ endoporter (применение АОН). Значение обозначены *, Р <0,05: ** Р <0,02: *** р <0,003 по сравнению с PBS.
Результаты в естественных условиях лечения в рисунке 8 представлены для мышей, несущих BT-474 HER2 гиперэкспрессией рака молочной железы человека. Рост ингибируется> 95% по ведущим nanodrug содержащей Герцептин и HER2-специфический АОН по сравнению с контрольной группой, получавших только с PBS (Рисунке 8). Ингибированиесоставила 60% или менее с одним только Герцептин, P / MPEG / Loet / Герцептин или P / MPEG / Loet / АОН / анти-MsTfRmAb / анти-HuTfRmAb. Вестерн-блот анализ экстрактов опухолевых показали ингибирование как синтеза HER2 и Akt фосфорилирования, но без изменений общего Akt и уборка фермент GAPDH. PARP расщепляли в соответствии с повышенным уровнем апоптоза. Фотографии опухоли после лечения, и срезах тканей, окрашенных H & E, иллюстрирующая регрессию опухоли показаны на Рисунке 9.
Рисунок 8. Размер опухоли и белки во время лечения с свинца и прекурсоров нано препаратов (адаптировано из Иноуэ и др.. 12). . Размер опухоли для различных обработок (день с 21 по 42 день, всего 8 инъекций). Бары показывают стандартотклонения от среднего. Ведущий сопряжено с анти-Her2 АОН и Герцептина превосходил либо только Герцептина или отдельных наркотиков, содержащий нано конъюгатов. B. Влияние различных обработок на экспрессию HER2, фосфорилированным Akt, общей Akt, PARB, расщепляется PARB и GAPDH показаны вестерн-блоттинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 9. Лечение HER2-положительного BT-474 рака молочной железы человека на голых мышей. Регрессия опухоли и некроз / апоптоз в срезах тканей (взято из Ionue др.. 12). Верхняя: усадка опухоли (красные стрелки). Индикация таблетки эстрогена, чтобы поддержать рост опухоли (синяя стрелка). Лоут: гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание срезов опухоли. Пролиферирующих опухоли показано на плотной упаковки опухолевых клеток. Некротических тканей видно, где опухолевые клетки были устранены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Экспериментальный маршрут для приготовления препаратов из нано биоразлагаемого природного полимера представлен которые могут быть использованы в синтезе персонализированной медицины. Описание начинается с контролируемой получения и очистки polymalic кислоты, которая является универсальным платформа для синтеза нано наркотиков. Использование методов воспроизводимые полимер, полученный с высокой молекулярной массой и в крайней степени чистоты, пригодной для фармацевтических синтеза. Синтез описан для нано препарат, который, как показано, эффективно лечить рак молочной железы HER2-положительным. Описание может быть переведен на синтезе большинства других нано препаратов для лечения рака. Ориентация включает в себя антитела, такие как Герцептин, которые связываются опухолеспецифического антигена например HER2 белка или любого другого опухолевого маркера, который эффективно интернализованной. Нано препарат обеспечивает выбор антисмысловых олигонуклеотидов и химиопрепаратов, которые будут эффективно ингибировать рост рака под третерпимостью и лечением. В примере, Герцептин связывания с HER2 и удельной антисмысловых олигонуклеотидов отжига с HER2-кодирования мРНК в результате длительного блокирования HER2 сигнализации и резкого снижения рака молочной железы HER2-позитивным. Исходя из основополагающего принципа адресности опухоли и ингибирование экспрессии генов с помощью антисмысловых олигонуклеотидов мы актуальный синтезированы несколько других нано наркотики и успешно ингибирует доклинические глиобластомы человека и тройной негативный рак молочной железы 11,14-18.
Синтетический работа начинается с подготовки высоко очищенного платформы нано наркотиков, который является polymalic кислоты из культуральной жидкости Physarum polycephalum (видов из "слизь формы« семьи). Препарат подчеркивает высокие молекулярные массы полимера, в принципе, позволяя вложение многочисленных антител, пептидов, олигонуклеотидов и других молекул, функционирующих в активной доставки лекарств и ингибирование роста опухоли. Followiнг контролируемое культивирование и очистку, воспроизводимое качество полимера в предсказуемых урожайности был подготовлен. Полимер хранили в удобных условиях в течение любого времени.
Синтез конъюгатов PMLA нано, начиная с химической активации полимер-подвесных карбоксилатов осуществляется в несколько стадий синтеза. В между шагами, синтез может быть дополнительно помещается на удержание, позволяя подготовки произвольных количеств промежуточных соединений и, таким образом, может быть использован в до масштабирования. Прогресс синтеза анализировали методом тонкослойной хроматографии и SEC-HPLC, и оба состав и активность нано препарата контролируется определенной группы количественный химических анализов ELISA, и различных физических измерений. Наш опыт показывает, что эти синтезы были прогрессировала плавно и воспроизводимо с превосходными выходами и чистотой. Выбрав специфичность антител и антисмысловых олигонуклеотидов любой вариант нано препарата выгодно синтезированы по мере необходимости в PErsonalized лекарство.
Порядок проведения успешного лечения человека рака молочной железы HER2-положительным являются допустимыми представители для приготовления моделях рака мыши, применение нано наркотиков, визуализации и анализа роста опухоли. Результаты испытаний в пробирке жизнеспособности полезны при выборе линии клеток и ведущий препарат, используемый в эксперименте на животных. В естественных изображений Xenogen подтверждает, что нано препарат действительно доставлен в опухоль. Результаты вестерн-блоттинга показывает ли ответил уровень определенных белков в предсказанном моды во время лечения рака. Измерение размера опухоли сообщает об успехе лечения, то есть о ингибирования, спада или регрессии. Описанный пример отражает нашим опытом с другими кислоты на основе нано наркотиков polymalic указанием высокую степень предсказуемости, воспроизводимости и отсутствие заметных токсичности. Новые исследования о токсичности и эффективности многократного тargeted сопряженные polymalic кислоты для тройной отрицательный лечения рака молочной железы в сильной поддержке этого понятия 18. Ключевой особенностью является то, что наш нано препарат способен проникать био-барьеров: эндотелиального барьера на экстравазационным в промежуточные опухоли, опухоль клеточной мембраны по поглощению эндосом и эндосом нарушения на действия лейцин этилового или trileucine групп. Экстравазационным и поглощение ядрышко надежно достигается путем специфических антител, прикрепленных к нано препарата. Рецептор трансферрина антитело против мышиного опосредует эффективный приток в опухоль путем трансцитоза, вероятно потому что рецептор избыточно экспрессируется на большинстве сосудистую сеть опухоли. Другой антитела прилагается на тех же функций нано сопряженная молекула в специально направляя нано препарат в получателя опухолевой клетки. Наличие обоими антителами, а один для трансцитоза, а другой для поглощения эндосом, имеет важное значение для оптимального функционирования. Количественный анализ мAlic кислоты и антитела настоятельно рекомендуется, чтобы контролировать оптимальный состав нано препарата. В заключение следует отметить, что все-в-одном ковалентная нано препарат поставляет препарат в химически прилагаемой форме пути через хост-сосудистой в получателя опухолевой клетки. Химическая привязанность оказывает большинство лекарств неактивным (пролекарства), пока они не преобразован в свободные лекарственные средства путем расщепления от нано сопряженной платформы на целевой сайт. Это важно, потому что реактивация модальность обеспечивает высокую степень безопасности во время родов и минимальным шансом, чтобы вызвать вредные побочные эффекты. Универсальность, эффективность и безопасность являются необходимыми атрибутами хорошей персонализированной медицины.
Disclosures
Авторы Юлия Юрьевна Любимова, Кейт Л. Черные и Eggehard Holler являются акционерами Arrogene Technology Инк
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine; 2MEA) | Sigma-Aldrich | 30078-25G | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| 90-Day release 17β-estradiol pellet | Innovative Research of America | ||
| Alexa Fluor 680 C2 maleimide | Invitrogen | A20344 | |
| Amberlite IR 120H | Sigma-Aldrich | 6428 | |
| Antifoam Y-30 Emulsion | Sigam-Aldrich | A5758 | |
| Anti-laminin-411 chain mAbs | Santa Cruz | SC-59980 | |
| Anti-pAkt mAb | Cell Signalling | 9271S | |
| Anti-PARB mAb | BD Biosciences | 556494 | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | AB6994 | |
| Bacto Yeast Extract | Bacto, Dickinson/Sparks, MD | 212720 | |
| Beta-actin | Cell Signalling | 3700 | |
| BT-474 | ATCC | HTB-20 | |
| Calcium Carbonate | Alfa Aesar | 36337 | |
| Cell Proliferation Assay kit | Promega, Madison, WI, USA | PR-G3580 | |
| Centriplus 100 | Millipore | 4414 | |
| Dicyclohexylcarbodimide | Fluka | 36650 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Eosin | Cardinal Health | S7439-4 | |
| Galardin (MMP-inhibitors) | Santa Cruz | SC-994 | |
| GAPDH | Cell Signalling | 2118 | |
| Hematoxilin | Cardinal Health | S7439-3 | |
| Hemin from porcine | Sigma-Aldrich | 51280 | |
| Herceptin | Genentech | 15534 | |
| Herceptin (Western blotting) | Cell Signalling | 2165S | |
| IgG2a-kappa murine malignoma | Sigma | M77695X5m | |
| Immun-Star AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| Immun-StarTM AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| LAL Reagent water | Lonza, MD | W50-1000 | |
| Laminin-411 mAbs | Abcam | ||
| Leucine ethyl ester (LOEt) | Sigma-Aldrich | 61850-10G-F | |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests | Cambrex BioScience | N384 | |
| Lissamin-Morpholino AON | Gene Tools | Custom made | |
| L-malic acid | Sigma-Aldrich | M6413 | |
| Malate dehydrogenase | Sigma-Aldrich | M2634 | |
| Mal-PEG-Mal | Laysan | mal-PEG-mal-3400 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354248 | |
| Milk, nonfat powdered | Proteomics | M203-10G | |
| Morpholino oligonucleotides | GeneTools | custom made | |
| mPEG5000 | Lysan | mPEG-NH2-5000 | |
| N-hydroxysuccinimde (NHS) | ACROS Organics | 15727100 | |
| Ninhydrin | Merck | 1.06762.0100 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm | Invitrogen | LC2001 | |
| Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25x) | Invitrogen | LC3675 | |
| Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] | Taconic | ||
| PBS pH 7.2 10x | Gibco | 10010-49 | |
| PBS pH 7.2 1x | Gibco | 70013 | |
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851 | |
| Physarum polycephalum M3CVII | ATCC | 204388 | |
| Pierce BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 1.18362E+11 | |
| Protein Detector ELISA Kit | KPL | 54-62-18 | |
| Sephadex G-25 superfine | GE Healthcare | 17-0031 | |
| Sephadex G-75 | GE Healthcare | 17-0050 | |
| Sephadex-LH20 | GE Healthcare | 17-0090 | |
| SKBR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| SPDP | Proteochem | C1116 | |
| Streamline-DEAE | GE Healthcare | 17-0994 | |
| Styryl Red FM 1-43 | Life Technologies | T-3163 | |
| TBS 10x | Bio-Rad | 170-6435 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| TLC, silica coated aluminia sheets | Merck, Darmstadt, DE | 60F254 | |
| Trileucine (LLL) | Bachem | H-3915 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | X114 | |
| Tween®20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vivaspin 20 | VWR | 14005-302 | |
| DAPI | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| Dexmedetomidine | Pfizer | ||
| Atipamezole | Pfizer | ||
| Carprofen | Pfizer | ||
| Betadine | Foster and Smith, Wisconsin |
References
- Koboldt, D. C., Fulton, R. S., McLellan, M. D. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Cancer Genome Atlas Network. Nature. 490, 61-70 (2012).
- Kwong, L. N., Costello, J. C., et al. Oncogenic NRAS signaling differentially regulates survival and proliferation in melanoma. Nat. Med. 18, 1503-1510 (2012).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. Gerlinger, M., Rowan, A. J. 366, 883-892 (2012).
- Yap, T. A., Workman, P. Exploiting the cancer genome: strategies for the discovery and clinical development of targeted molecular therapies. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52, 549-573 (2012).
- Chatterjee, S. Cancer Biomarkers: Knowing the Present and Predicting the Future. Future Oncol. 1, 37-50 (2005).
- Suh, K. S., Sarojini, S., Youssif, M., et al. Tissue Banking, Bioinformatics, and Electronic Medical Records: The Front-End Requirements for Personalized Medicine. J. Oncology. , (2013).
- Ljubimova, J. Y., Holler, E. Biocompatible nanopolymers: the next generation of breast cancer treatment. Future Medicine, Nanomedicine. 7, 1-4 (2012).
- Lee, B. -S., Vert, M., Holler, E. Water-soluble aiphatic polyesters: poly(malic acid)s. Biopolymers 3a. Steinbüchel, A. , Wiley VCH. Weinheim (Bergstrasse). 75-103 (2002).
- Lee, B. -S., Fujita, M., et al. Polycefin, a new prototype of multifunctional nanoconjugate based on poly(beta-L-malic acid) for drug delivery. Bioconjugate Chem. 17, 317-326 (2006).
- Nag, A., Mitra, G., et al. A colorimetric assay for estimation of polyethylene glycol and polyethylene glycolated protein using ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochem. 237, 224-231 (1996).
- Ding, H., Inoue, S., et al. Inhibition of brain tumor growth by intravenous poly(beta-L-malic) acid nanobioconjugate with pH-dependent drug release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 18143-18148 (2010).
- Inoue, S., Ding, H., et al. Nanobioconjugate inhibition of HER2/neu signaling and synthesis provides efficient mouse breast cancer treatment. Cancer Research. 71, 1454-1464 (2011).
- Maeda, H., Sawa, T., Konno, T. Mechanism of tumor-targeted delivery of macromolecular drugs, including the EPR effect in solid tumor and clinical overview of the prototype polymeric drug SMANS. J. Control. Release. 74, 47-61 (2001).
- Ljubimova, J. Y., Fujita, M., Ljubimov, Y. J., et al. Poly(malic acid) nanoconjugates containing various antibodies and oligonucleotides for multitargeting drug delivery. Nanomed. 3, 247-265 (2008).
- Inoue, S., Patil, R., Portilla-Arias, J., et al. Novel nanobioconjugate inhibiting EGFR expression in triple negative breast cancer. PLoS One. 7, 1-9 (2012).
- Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(β-L-malic Acid). Int. J. Mol. Sci. 13, 11681-11693 (2012).
- Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Temozolomide delivery to tumor cells by a multifunctional nano vehicle based on poly(β-L-malic acid). Pharm. Res. 27, 2317-2329 (2010).
- Ljubimova, J. Y., Portilla-Arias, J., Patil, R., et al. Toxicity and efficacy evaluation of multiple targeted polymalic acid conjugates for triple-negative breast cancer treatment. J. Drug Target. 21, 956-967 (2013).
