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Articolo metodologico

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

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DOI:

10.3791/50765

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26 settembre 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Cell Science, The University of Florida

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Con le funzioni effettrici distinto da altri sottoinsiemi di cellule T, le cellule Th17 sono stati implicati nel centro di autoimmunità infiammatoria. Questo protocollo vitro la differenziazione in Th17 fornisce un mezzo per determinare se naïve linfociti T CD4 + in grado di differenziarsi in cellule Th17, e di esaminare ulteriormente il loro ruolo nella autoimmunità e risposta dell'ospite.

Abstract

Cellule Th17 sono un sottoinsieme distinto di cellule T che sono stati trovati per produrre interleuchina 17 (IL-17), e si differenziano in funzione degli altri sottogruppi di cellule T compreso Th1, Th2, e linfociti T regolatori. Cellule Th17 sono emersi come un colpevole centrale nelle risposte immunitarie infiammatorie troppo zelanti associati a molte malattie autoimmuni. In questo metodo purifichiamo linfociti T dalla milza e nei linfonodi di topi C57BL / 6, e stimolare le cellule T CD4 + purificati sotto controllo e ambienti Th17 inducono. L'ambiente-Th17 indurre comprende stimolazione in presenza di anti-CD3 e anti-CD28 anticorpi, IL-6 e TGF-β. Dopo incubazione per almeno 72 ore e fino a cinque giorni a 37 ° C, le cellule vengono successivamente analizzati per la capacità di produrre IL-17 mediante citometria a flusso, qPCR, ed ELISA. Th17 differenziate cellule CD4 + CD25-T possono essere utilizzati per chiarire ulteriormente il ruolo che le cellule Th17 giocano nella insorgenza e la progressione di autoimmunità e ospite defense. Inoltre, Th17 differenziazione dei CD4 + CD25-linfociti da diversi modelli knockout / malattia murini può contribuire alla nostra comprensione del destino delle cellule plasticità.

Introduzione

Linfociti T CD4 + (cellule T) giocano un ruolo fondamentale nella difesa del sistema immunitario mediata contro i microrganismi infettivi. Viceversa, le cellule T sono intimamente associati con l'insorgenza e la progressione di malattie autoimmuni come il diabete di tipo 1, il lupus eritematoso sistemico e artrite reumatoide. CD4 + linfociti T si attivano attraverso una combinazione di recettore delle cellule T (TCR) interazioni con antigene cognate / complesso maggiore di istocompatibilità II (MHCII) molecole e le interazioni recettore CD28 con B7.1/B7.2 ligandi 15. In aggiunta alla disposizione di stimolazione TCR e CD28 co-stimolazione, le cellule presentanti l'antigene forniscono inoltre un ambiente di citochine, che determina lo stato di differenziazione del linfocita T, indirizzando così la risposta del linfocita T all'antigene dato. Interazioni patogeno Distinto cellulari / presentanti l'antigene creare ambienti di citochine distinte, che Skew T linfociti giù distinti percorsi incentrati sulla eliminazione del patogeno avvio. Purtroppo, T percorsi linfociti effettori, originariamente progettato per sradicare invasori patogeni, possono essere erroneamente diretti contro auto-tessuti 15. Pertanto, una migliore comprensione dello stato di differenziazione ciascun distinto di subset di cellule CD4 + T è fondamentale per la nostra comprensione di come modulare l'equilibrio tra eliminazione degli agenti patogeni e la tolleranza di sé.

Oltre al Th1, Th2, e inducibili T regolatori percorsi di differenziazione cellulare, naive linfociti T possono essere causati anche dalle citochine lungo la via Th17. Mentre le cellule Th1 combattimento patogeni intracellulari, cellule Th2 eliminano i patogeni extracellulari, e le cellule T regolatorie (Tregs) minimizzano risposte infiammatorie 1, 16; cellule Th17 svolgono un ruolo importante nella eliminazione dei batteri extracellulari e funghi. Cellule Th17 sono generalmente indicati con l'espressione del fattore di trascrizione specifico lineage RORγT e la produzione di IL-17A, che promuove l'attivazione di macrofagi e neutrofili 1, 7.

Cellule Th17 sono stati implicati in diverse malattie autoimmuni, e loro modelli di roditori associati. Ad esempio, è stato dimostrato che l'IL-23 (che è necessario per sostenere il fenotipo Th17), ma non IL-12, sia il principale responsabile in encefalite autoimmune sperimentale (EAE), il modello di malattia roditore per MS. In seguito è stato dimostrato che la riduzione della produzione di IL-17 sono correlati alla prevenzione EAE 2, 6, 17. Inoltre, le cellule Th17 sono stati associati con altre malattie autoimmuni tra cui l'artrite e lupus eritematoso sistemico (SLE) 10, 16. IL-23 p19 deficienti - / - topi hanno mostrato di avere numeri molto bassi di cellule Th17, e sono resistenti allo sviluppo non solo EAE, ma anche artrite indotta da collagene, un modello per l'artrite reumatoide 10, 18. Inoltre, i topi trattati con anticorpi neutralizzanti IL-17A poppaer l'insorgenza di artrite collagene-indotta sono stati anche trovati ad avere la risoluzione del danno articolare 18. Va notato che il ruolo delle cellule Th17 nella progressione della malattia autoimmune rimane ad essere caratterizzato come recenti ricerche hanno anche dimostrato un ruolo protettivo delle cellule Th17 nel diabete di tipo 1 9, 11 e infiammazione intestinale 14. Questi studi confermano l'importanza di Th17 differenziazione in autoimmunità.

In vitro la differenziazione Th17 è un metodo necessario nella ricerca sulle cellule T, perché ci sono almeno due domande imbarazzanti che richiedono ulteriori indagini: 1) Come funziona esattamente IL-6 regolano l'equilibrio tra Treg e Th17 differenziazione, e 2) quali sono i meccanismi esatti dietro IL-17 indotta da malattie infiammatorie? Il nostro metodo impiega cellule CD4 + CD25-T dalle milze e linfonodi del topo C57BL / 6. È importante notare che, sebbene sia possibile indurre differenziazione Th17 utilizzando un impurola popolazione, l'acquisizione di almeno un puro CD4 + 80% popolazione di cellule CD25-T nega qualsiasi preoccupazione di contaminazione e garantisce risultati più efficaci differenziazione Th17. Al fine di conseguire un'adeguata differenziazione Th17, cellule CD4 + CD25-T vengono incubati in presenza di anti-CD3 e anti-CD28, che forniscono segnali di attivazione, 1 e 2, rispettivamente, e IL-6 e TGF-β. Sebbene sia stato riportato che IL-23 da sola può essere usato per raggiungere la differenziazione Th17, successivamente è stato dimostrato che l'IL-23 è necessario per la stabilità della popolazione di cellule Th17, ma IL-6 e TGF-β sono essenziali per Th17 differenziazione 3, 18, ​​19. Studi murini hanno dimostrato che il recettore di IL-23 è espresso sulle cellule T CD4 + solo dopo che sono state stimolate con IL-6 e TGF-β 13, 18. Inoltre, le cellule Th17 svilupperanno correttamente in presenza di anticorpi IL-23-bloccante finché IL-6 e TGF-β sono presenti 18, 19. Come tale, questa differenziazione Th17 protocollo provIDES le condizioni appropriate per indurre successo Th17 differenziazione. Sviluppo di una migliore comprensione dei meccanismi alla base Th17 differenziazione e IL-17 presenta l'opportunità per lo sviluppo di migliori terapie volte a disturbi autoimmuni 13.

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Protocollo

Tutte uso animale è stato condotto in conformità con i protocolli approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso.

1. Preparazione di miscele e media

  1. Sterile PBS pH: 7,3 (1 L)
    0.23 g NaH 2 PO 4
    1.15 g Na 2 HPO 4
    9.0 g NaCl
    Raccogliere volume con acqua deionizzata. Sterilizzare con autoclave.
  2. Cellulari Media Cultura (100 ml)
    89 ml RPMI
    10 ml 10% FBS
    1 ml di antibiotico antimicotico (ABAM) 100 mcg 50 mM 2-mercaptoetanolo (3,5 mg magazzino 2-mercaptoetanolo in 96,5 mcg PBS)
  3. FACS Buffer (Fluorescent Attivazione cellulare Ordinamento) (Per essere usato durante la citometria a flusso) 2% FBS in PBS sterile
  4. iTh17 Mix (Basato sul numero di campioni, determinare il volume necessario per tutte le miscele e media)
    1,5 mg / ml di anti-CD28
    20 ng / ml di IL-6
    5 ng / mlTGF-β

2. Le cellule saranno piastrate in Triplicate sotto le seguenti condizioni di

  1. Piatto vincolato anti-CD3, anti-CD28 (è questo il mix di controllo di attivazione).
  2. iTH17: Piastra vincolato anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β.

3. Plate-bound anti-CD3 (10 mg / ml)

Si raccomanda che la preparazione di piastra piastre con associazione anti-CD3 viene fatto almeno 4 ore prima dell'ora cellule saranno aggiunti alle piastre.

  1. Aggiungere 30 microlitri anti-CD3 per pozzetti (anti-CD3 viene diluito in PBS sterile) di un nuovo 96 ben U inferiore Microtest piastra di coltura tissutale, e toccare i lati della piastra di garantire una copertura uniforme dei pozzetti. Incubare a 37 ° C per 4 ore, e poi in frigorifero fino al momento di aggiungere le miscele e le cellule alla piastra.

4. Topo Dissection

  1. Questo protocollo è basato sull'impiego di C57BL / 6 mice, 3-8 mesi di età, e acquistati dal Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
  2. Sacrifica mouse utilizzando CO 2 asfissia, e confermare la morte con conseguente dislocazione cervicale.
  3. Sterilizzare topi strumenti di dissezione e la zona di incisione con il 70% di etanolo e iniziare la dissezione.
  4. Dalla vista ventrale, afferrare la pelle che è anteriore alla apertura uretrale e iniziare il taglio con le forbici la linea mediana ventrale fino a raggiungere la zona del mento. Prendere precauzioni per non strappare o tagliare nel rivestimento della parete peritoneale.
  5. Tirare indietro la pelle e fissare per consentire un comodo accesso ai linfonodi durante la rimozione.
  6. I linfonodi e milza raccolti saranno tutti rimossi con una pinza, e collocato in una capsula di Petri sterile contenente 5 ml di autoMACS tampone di corsa acquistato da Miltenyi Biotec (fare riferimento alle figure 2 e 3 per linfonodo e diagrammi di rimozione della milza).
    1. Rimuovere i linfonodi ascellari che sonotrovato vicino al cavo ascellare (ascelle) dietro i muscoli pettorali di ogni mouse.
    2. Rimuovere i linfonodi brachiale che si trovano nei tessuti connettivi situati vicino a ciascuna ascella.
    3. Rimuovere le superficiali linfonodi cervicali presenti nel collo di ciascun topo.
    4. Rimuovere i linfonodi inguinali che si trovano nella regione dell'anca alla congiunzione dei tre vasi sanguigni.
    5. Per accedere ai linfonodi mesenterici, tagliare il rivestimento peritoneale la linea mediana ventrale. Linfonodi mesenterici si trovano nel tessuto connettivo che tiene insieme l'intestino. Essi si trovano generalmente in una serie di 4-8 nodi, e può apparire come un "filo di perle". Assicurati di tirare fuori l'intera stringa.
    6. La milza si trova nella zona addominale, dietro lo stomaco e l'intestino. Rimuoverlo tirando e staccandolo dal pancreas.
  7. Grind organi sotto una cappa sterile utilizzando due vetrini da microscopio smerigliato. Posizionare linfonodi o milza suil lato opaco di un vetrino da microscopio, e strofinare con il lato glassato della seconda slitta fino disintegrato. Ripetere l'operazione finché non sono stati a terra tutti i linfonodi e la milza.

Nota: Si consiglia di iniziare con linfonodi e finire con la milza, come il sangue renderà difficile vedere i linfonodi rimanenti nel buffer autoMACS.

  1. Per filtrare organi terra in una sospensione di cellule singole, iniziare piegando un pezzo di 40 micron nylon materiale più volte, e ponendo in cima ad una provetta da centrifuga da 15 ml. Il materiale di nylon dovrebbe essere di circa 3 x 3 pollici
  2. Utilizzare una siringa da 5 ml e 21 G ago per aspirare il 5 ml di autoMACS tampone di corsa e di terra organi. Versare lentamente nel materiale di nylon ripiegato. Fare attenzione a non bucare il materiale con l'ago.

Nota: Una volta che la sospensione singola cella è raggiunto, la soluzione deve apparire come una soluzione coerente pallido senza visibLe parti di tessuto solido. Se rimangono solidi, ri-aspirare e dispensare attraverso un nuovo pezzo piegato di nylon collocato in un nuovo tubo da centrifuga da 15 ml.

  1. Tenere sempre cellule in ghiaccio quando non in uso.

5. Separazione cellulare

  1. Per ottenere risultati ottimali, ottenere almeno un puro CD4 + 80% della popolazione CD25-cellulare attraverso autoMACS separatore cellulare Pro utilizzando il MACS CD4 + CD25 + T regolatorie isolamento delle cellule kit, mouse. Il protocollo per la conservazione negativa della popolazione CD25 delle cellule CD4 + è ottenuta attraverso Miltenyi Biotec.

6. Th17 Differenziazione

  1. Raccogliere la popolazione CD25 delle cellule CD4 + dopo la separazione con il separatore cellulare autoMACS Pro.
  2. Contare le cellule diluite in un rapporto 1:1000 con trypan blu con un emocitometro.
  3. Una concentrazione è stata determinata dalla conta delle cellule, diluire sospensione cellulare a 1 x 10 6 cellule / ml in cellule di coltura.
  4. Estrarre piastre da 96 pozzetti con piastra vincolato anti-CD3 dopo 4 ore.
  5. Lavare i pozzetti anti-CD3-rivestiti con 200 ml di PBS. Ripetere 2 volte.
    1. Per lavare aggiungere 200 ml di PBS sterile per pozzi anti-CD3-rivestite e rimuovere PBS in un contenitore per rifiuti.
  6. Aggiungere 100 ml di mix iTh17 o mix comando di attivazione (vedi punto # 2) per i pozzi in triplice copia.
  7. Aggiungere 100 ml di cellule in ciascun pozzetto in cui sia il mix Th17 o il mix di controllo di attivazione sia stato inserito.
  8. Incubare le cellule per almeno 72 ore o fino a 5 giorni (differenziazione Th17 può essere ottenuta dopo 72 ore o dopo 5 giorni.)
  9. Differenziazione Th17 può essere valutata intracellulare di colorazione e analisi di citometria a flusso, ELISA, o qPCR

7. L'attivazione delle cellule (necessario solo per la colorazione intracellulare)

  1. Rimuovere piastre da 96 pozzetti da incubatrice alla fine di una delle 72 ore o 5 giorni
    1. Ricordiamo che Th17 differentiation può essere raggiunto dopo due 72 ore o 5 giorni.
  2. Per ciascuna condizione (ad esempio controlli di attivazione o iTh17), trasferire le cellule che sono in triplice copia in un pozzetto di una piastra 24 ben coltura cellulare. Le celle di una condizione ora sono stati raggruppati in un unico pozzetto della piastra da 24 cultura e, invece di essere in triplicato in piastra di coltura ben U inferiore 96.
  3. Il volume totale di ciascun pozzetto nella piastra di coltura cellulare da 24 pozzetti è ora 600 microlitri. Aumentare il volume di ciascun pozzetto a 1 ml con mezzo di coltura cellulare.
  4. Aggiungere PMA (forbolo miristato acetato) (50 ng / ml), ionomicina (1 mM), e BFA (brefeldina-A) (10 mg / ml) a ciascun pozzetto della piastra 24 e coltura cellulare alle concentrazioni elencate.
  5. Incubare a 37 ° C per 4 ore.

8. Colorazione intracellulare

  1. Cellule macchia con i marcatori extracellulari e intracellulari desiderate per l'analisi di citometria di flusso. Per rilevare la presenza of IL-17, la colorazione intracellulare è fatto con anticorpi anti-IL-17A. Marcatori consigliati superficie extracellulari includono CD4, CD8 e CD25.
    1. Utilizzare il intracellulare di citochine colorazione Starter Kit-Mouse da BD Bioscience per IL-17 intracellulare colorazione.
    2. Per ciascun campione, cellule pellet, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri tampone FACS (2% FBS in PBS).
    3. Trasferire le cellule in sospensione al 96 citometria di flusso cella piatto.
    4. Spin celle in basso per 5 min a 1200 rpm e scartare il surnatante.
    5. Aggiungere 200 microlitri tampone FACS PBS, centrifugare per 5 minuti a 1200 rpm, e scartare il surnatante.
    6. Risospendere le cellule in 100 ml di FACS buffer e valgono 100 ml di anticorpi extracellulare (Ab) miscela (miscela extracellulare Ab è realizzato in tampone FACS). Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, coperto con pellicola.
    7. Ripetere passo 8.1.4.
    8. Ripetere il punto 8.1.5 2x.
    9. Risospendere le cellule in 100 ml di BD Cytofix / Cytoperm Buffer. Incubmangiato per 20 minuti a temperatura ambiente, coperto con pellicola.
    10. Aggiungere 100 ml di 1x tampone BD Perm / Wash, centrifugare per 5 min a 1.200 giri al minuto, e scartare il surnatante. Ripeti.
    11. Aggiungere 50 ml di miscela intracellulare Ab. (Miscela intracellulare Ab è fatta in 1x BD Perm / Wash) Incubare per 15 minuti a RT, coperto con un foglio.
    12. Ripetere passo 8.1.10.
    13. Risospendere le cellule in 200 ml di BD colorazione Buffer.
    14. Posizionare cellule risospese in citometria a flusso provette contenenti 200 microlitri BD colorazione Buffer (volume finale è di 400 ml).
    15. Conservare a 4 ° C fino a quando i campioni sono pronti per essere letti.

9. Analisi citofluorimetrica

  1. Porta popolazione cellulare dal vivo.
  2. Dalla popolazione delle cellule vive, cancello CD4 + CD8-popolazione.
  3. Dal CD8 popolazione CD4 +, cancello IL-17A + popolazione.
    1. Sulla base dei nostri risultati sperimentali precedenti, il 100% della IL-17A + popolazione sarà CD25 +.

* Totale conta delle cellule assoluti sono stati ottenuti dopo la messa in comune delle triplicati campione
** Numero assoluto di + IL-17A + CD4 + CD25 è stato determinato moltiplicando il numero totale di cellule per la percentuale cancello vivo e la percentuale di cellule totali recanti i marcatori specifici lignaggio, CD4, CD25, e IL-17A, come determinata mediante citometria di flusso.

10. qPCR ed ELISA

  1. Cellule posto non utilizzati per l'analisi di citometria di flusso in una provetta da 1,5 ml Eppendorf e centrifugare a 13.000 rpm per 5-10 min. Le cellule trovate nel pellet cellulare dopo centrifugazione saranno utilizzati per l'analisi qPCR. analisi qPCR è stata effettuata utilizzando PTC-200 Peltier Thermal cycler (Biorad).
  2. Raccogliere il surnatante dai tubi centrifugati per ELISA. IL-17A ELISA sono state eseguite usando la coppia di anticorpi TC11-18H10 (cattura, numero di catalogo 555068) e TC11-8H4 biotina (rilevamento, numero di catalogo 555067) acquistato da BD Biosciences. IL-17A ELISA standards sono stati ottenuti da eBioscience (numero di catalogo 14-8171-80).
  3. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere le cellule rimanenti da utilizzare per qPCR in 175 microlitri di buffer RNA lisi (utilizzare immediatamente per l'estrazione di RNA, sintesi di cDNA, e qPCR, o conservare a -80 ° C per un uso successivo).
    1. Fare riferimento alla Tabella II per le sequenze di primer per IL-17A e actina (house-keeping gene)

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Risultati

Questo protocollo differenziazione Th17 inizia con la rimozione della milza e ascellare, brachiale, mesenterica, cervicale, e linfonodi inguinali. Una rappresentazione delle posizioni di ciascun possono essere trovate nelle figure 2 e 3. Figure 1 e 5 entrambi forniscono una rappresentazione visiva dei metodi descritti in questo protocollo.

Questo protocollo Th17 concentra sulla differenziazione dalla popolazione linfocitaria CD4 + CD25-T. È ...

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Discussione

Qui abbiamo descritto il protocollo per raggiungere la differenziazione Th17 in vitro. Lo studio di Th17 differenziazione è importante, la differenziazione dei linfociti T nel sottoinsieme Th17 è fondamentale per l'efficace eliminazione di agenti patogeni umani 13. Al contrario, la produzione di IL17 è stato associato a progressione della malattia autoimmune 13. Il metodo di Th17 differenziazione è applicabile a molti ambiti di ricerca in quanto può essere applicata a numerosi modelli ...

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Dichiarazioni

Nessun informativa di dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è supportato in parte dal NIH / NCATS Science Awards clinica e traslazionale alla University of Florida TL1 TR000066 e UL1 TR000064, un supplemento diversità dal padre di Grant R01AI056152 dal National Institute of Health, una borsa di reagente BD Biosciences, e l'Università della Florida.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri DishFisher Scientific0875713A60 mm x 15 mm
autoMACS Running BufferMiltenyi Biotec130-091-221
Premium Microscope Slides, FrostedFisher Scientific12-544-33" x 1"1 mm
5 ml 21G1 Senza lattice Siringa e agoBD Biosciences309632
Corning Provette da centrifuga da 15 mlSigma-AldrichCLS430791
Nylon 40 micronMiami AquacultureNylon 40/26
Microtest Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti Fondo a U BD Biosciences35-3077
Corning Costar Piastre per colture cellulari a 24 pozzettiSigma-AldrichCL3524
Eppendorf Provette 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Criceto NA/LE purificato Anti-Topo CD3eBD Biosciences553057
Criceto NA/LE purificato Anti-Topo CD28BD Biosciences553294
Proteina ricombinante IL-6 di topoeBioscience14-8061-62
TGFbetaR& D Systems240-B-002
Soluzione di blu di tripano 0,4 %Sigma-Aldrich66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences558107
APC Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences553035
PE Coniugato Anti-mouse CD25eBioscienceE01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17BD Biosciences560820
Kit introduttivo per la colorazione delle citochine-TopoBD Biosciences51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ Kit di isolamento delle cellule T regolatorie, topoMiltenyi Biotec130-091-221
ABAM Cellgro30-004-CI
RPMICorning, Cellgro10-040-CM
B 2-Mercapt– thanolMP Biomedical194834Pericoloso
Phorbol 12-Myristate 13-Acetato (PMA)
Ionomicina Sale di calcioSigma-Aldrich13909-1MLPericoloso
Brefeldin A (BFA)MP Biomedicals159027
ELISA IL-17A Cattura mAb BD Biosciences555068
ELISA IL-17A Rilevamento mAb BD Biosciences555067
ELISA IL-17A StandardeBioscience14-8171-80
IL-2 ELISA KitBD Biosciences555148
TMB Set di reagenti per substrati BD Biosciences 555214
Equipment
autoMACS Pro Cell SeparatorMiltenyi Biotec130-092-545
Centrifuga Sorvall Legend RT+ThermoScientific
Incubatore a CO2 serie Napco 8000 WJTermociclatore ThermoScientific
PTC-200 PeltierBiorad

Riferimenti

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Ristampe e permessi

Tag

Isolamento dei linfonodidissezione della milzaseparazione AutoMaxcitometria a flussoanalisi qPCRrilevamento ELISAcondizioni induttive Th17espressione di IL-17
Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4
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