Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Summary

Con le funzioni effettrici distinto da altri sottoinsiemi di cellule T, le cellule Th17 sono stati implicati nel centro di autoimmunità infiammatoria. Questo protocollo vitro la differenziazione in Th17 fornisce un mezzo per determinare se naïve linfociti T CD4 + in grado di differenziarsi in cellule Th17, e di esaminare ulteriormente il loro ruolo nella autoimmunità e risposta dell'ospite.

Abstract

Cellule Th17 sono un sottoinsieme distinto di cellule T che sono stati trovati per produrre interleuchina 17 (IL-17), e si differenziano in funzione degli altri sottogruppi di cellule T compreso Th1, Th2, e linfociti T regolatori. Cellule Th17 sono emersi come un colpevole centrale nelle risposte immunitarie infiammatorie troppo zelanti associati a molte malattie autoimmuni. In questo metodo purifichiamo linfociti T dalla milza e nei linfonodi di topi C57BL / 6, e stimolare le cellule T CD4 + purificati sotto controllo e ambienti Th17 inducono. L'ambiente-Th17 indurre comprende stimolazione in presenza di anti-CD3 e anti-CD28 anticorpi, IL-6 e TGF-β. Dopo incubazione per almeno 72 ore e fino a cinque giorni a 37 ° C, le cellule vengono successivamente analizzati per la capacità di produrre IL-17 mediante citometria a flusso, qPCR, ed ELISA. Th17 differenziate cellule CD4 + CD25-T possono essere utilizzati per chiarire ulteriormente il ruolo che le cellule Th17 giocano nella insorgenza e la progressione di autoimmunità e ospite defense. Inoltre, Th17 differenziazione dei CD4 + CD25-linfociti da diversi modelli knockout / malattia murini può contribuire alla nostra comprensione del destino delle cellule plasticità.

Introduction

Linfociti T CD4 + (cellule T) giocano un ruolo fondamentale nella difesa del sistema immunitario mediata contro i microrganismi infettivi. Viceversa, le cellule T sono intimamente associati con l'insorgenza e la progressione di malattie autoimmuni come il diabete di tipo 1, il lupus eritematoso sistemico e artrite reumatoide. CD4 + linfociti T si attivano attraverso una combinazione di recettore delle cellule T (TCR) interazioni con antigene cognate / complesso maggiore di istocompatibilità II (MHCII) molecole e le interazioni recettore CD28 con B7.1/B7.2 ligandi ^15. In aggiunta alla disposizione di stimolazione TCR e CD28 co-stimolazione, le cellule p....

Protocol

Tutte uso animale è stato condotto in conformità con i protocolli approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso.

1. Preparazione di miscele e media

1. Sterile PBS pH: 7,3 (1 L)
   0.23 g NaH ₂ PO ₄
   1.15 g Na ₂ HPO ₄
   9.0 g NaCl
   Raccogliere volume con acqua deionizzata. Sterilizzare con autoclave.
2. Cellulari Media Cultura (100 ml)
   89 ml RPMI
   10 ml 10% FBS
   1 ml di antibiotico antimicotico (ABAM) 100 mcg 50 mM 2-mercaptoetanolo (3,5 mg magazzino 2-mercaptoetanolo in 96,5....

Results

Questo protocollo differenziazione Th17 inizia con la rimozione della milza e ascellare, brachiale, mesenterica, cervicale, e linfonodi inguinali. Una rappresentazione delle posizioni di ciascun possono essere trovate nelle figure 2 e 3. Figure 1 e 5 entrambi forniscono una rappresentazione visiva dei metodi descritti in questo protocollo.

Questo protocollo Th17 concentra sulla differenziazione dalla popolazione linfocitaria CD4 + CD25-T. È .......

Discussion

Qui abbiamo descritto il protocollo per raggiungere la differenziazione Th17 in vitro. Lo studio di Th17 differenziazione è importante, la differenziazione dei linfociti T nel sottoinsieme Th17 è fondamentale per l'efficace eliminazione di agenti patogeni umani ^13. Al contrario, la produzione di IL17 è stato associato a progressione della malattia autoimmune ^13. Il metodo di Th17 differenziazione è applicabile a molti ambiti di ricerca in quanto può essere applicata a numerosi modelli .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted	Fisher Scientific	12-544-3	3" x 1"1 mm
5 ml 21G1 Senza lattice Siringa e ago	BD Biosciences	309632
Corning Provette da centrifuga da 15 ml	Sigma-Aldrich	CLS430791
Nylon 40 micron	Miami Aquaculture	Nylon 40/26
Microtest Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti Fondo a U	BD Biosciences	35-3077
Corning Costar Piastre per colture cellulari a 24 pozzetti	Sigma-Aldrich	CL3524
Eppendorf Provette 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Criceto NA/LE purificato Anti-Topo CD3e	BD Biosciences	553057
Criceto NA/LE purificato Anti-Topo CD28	BD Biosciences	553294
Proteina ricombinante IL-6 di topo	eBioscience	14-8061-62
TGFbeta	R& D Systems	240-B-002
Soluzione di blu di tripano 0,4 %	Sigma-Aldrich	66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	553035
PE Coniugato Anti-mouse CD25	eBioscience	E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17	BD Biosciences	560820
Kit introduttivo per la colorazione delle citochine-Topo	BD Biosciences	51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ Kit di isolamento delle cellule T regolatorie, topo	Miltenyi Biotec	130-091-221
ABAM	Cellgro	30-004-CI
RPMI	Corning, Cellgro	10-040-CM
B 2-Mercapt– thanol	MP Biomedical	194834	Pericoloso
Phorbol 12-Myristate 13-Acetato (PMA)
Ionomicina Sale di calcio	Sigma-Aldrich	13909-1ML	Pericoloso
Brefeldin A (BFA)	MP Biomedicals	159027
ELISA IL-17A Cattura mAb	BD Biosciences	555068
ELISA IL-17A Rilevamento mAb	BD Biosciences	555067
ELISA IL-17A Standard	eBioscience	14-8171-80
IL-2 ELISA Kit	BD Biosciences	555148
TMB Set di reagenti per substrati	BD Biosciences 555214
Equipment
autoMACS Pro Cell Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
Centrifuga Sorvall Legend RT+	ThermoScientific
Incubatore a CO2 serie Napco 8000 WJ	Termociclatore ThermoScientific
PTC-200 Peltier	Biorad