Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di differenziare le cellule TH 17 dai linfociti T positivi naive CD four. Ciò si ottiene prelevando prima i linfonodi e la milza da un topo adulto C 57 black six. Nella seconda fase, i tessuti vengono macinati per ottenere una sospensione unicellulare.

Le quattro cellule T CD 25 negative vengono quindi isolate e coltivate in condizioni di controllo induttivo o di attivazione del TH 17. In definitiva, la Q-P-C-R-E-I-S-A e la citometria a flusso possono essere utilizzate per valutare l'espressione di IL 17 A. Quindi questo metodo può fornire informazioni sulla differenziazione dei linfociti T quattro CD in T otto cellule 17 nei topi C 57 sei neri.

Può essere applicato anche ad altri modelli di topi. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale poiché i linfonodi sono molto piccoli, rendendo difficili le fasi di dissezione. Senza la visualizzazione diretta di questo metodo, almeno quattro ore prima di aggiungere le cellule ricoprono i pozzetti di una nuova piastra di coltura tissutale per micro test UBO a 96 pozzetti con 30 microlitri di anti CD tre diluiti in PBS sterile picchiettare i lati della piastra per garantire una copertura uniforme dei pozzetti e quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius dopo quattro ore, Mettete in frigo il piatto fino al momento di aggiungere le celle.

Dopo aver confermato la morte per lussazione cervicale, sterilizzare l'area dell'incisione su un topo adulto C 57 black six con etanolo al 70%. Quindi afferrare la pelle anteriormente all'apertura uretrale e tagliare dalla linea mediana ventrale alla zona del mento, facendo attenzione a non disturbare il peritoneo. Quindi fissare la pelle per consentire l'accesso ai linfonodi e alla milza per la rimozione.

Ora rimuovi i linfonodi ascellari che si trovano vicino all'ascella del topo dietro i muscoli pettorali e metti il tessuto in una capsula di Petri contenente cinque millilitri di tampone da corsa AutoMax. Quindi rimuovere i linfonodi brachiali situati nel tessuto connettivo vicino a ciascuna ascella. Successivamente, rimuovere i linfonodi cervicali superficiali che si trovano nel collo dell'animale, che fiancheggiano la trachea, quindi rimuovere i linfonodi inguinali situati nella regione dell'anca alla congiunzione dei tre vasi sanguigni.

Per accedere ai linfonodi mesenterici, prima tagliare la linea mediana ventrale attraverso il rivestimento peritoneale. I linfonodi mesenterici si trovano in profondità all'interno del mesentere del topo, generalmente in una stringa da quattro a otto nodi che può apparire come un filo di perle. Rimuovere la milza tirandola e staccandola dal pancreas.

Quindi metterlo nella capsula di Petri con i linfonodi per macinare gli organi. Posizionare i linfonodi sul lato smerigliato di un vetrino da microscopio e quindi strofinare i tessuti con il lato smerigliato di un secondo vetrino. Per filtrare gli organi di terra in una sospensione a singola cellula, piegare più volte un pezzo di nylon da 40 micron di circa tre pollici per tre pollici e posizionarlo nella parte superiore di una provetta da centrifuga da 15 millilitri.

Utilizzare una siringa da cinque millilitri dotata di un ago calibro 21 per aspirare le cellule e il tampone, quindi erogare lentamente la soluzione cellulare nel nylon piegato. Facendo attenzione a non forare il materiale con l'ago. Una volta ottenuta una sospensione a singola cellula, la soluzione dovrebbe apparire coerente senza pezzi visibili di tessuto solido.

Metti questa soluzione sul ghiaccio. Dopo aver ordinato le cellule mediante separazione AutoMax fino a una purezza cellulare almeno dell'80% CD, quattro CD positivi e 25 negativi. Contare le cellule per esclusione trian blue e quindi diluire la sospensione cellulare a una volta 10-6 cellule per millilitro nei terreni di coltura cellulare.

Ora sciacquare tutti i pozzetti della piastra anti CD a tre rivestimenti con 200 microlitri di PBS. Ognuno getta il bucato in un contenitore per rifiuti. Quindi aggiungere 100 microlitri del cocktail induttore TH 17 o delle miscele di controllo dell'attivazione nei pozzetti appropriati in triplicato.

Infine, aggiungere 100 microlitri di cellule a ciascun pozzetto e incubare le cellule per almeno 72 ore o fino a cinque giorni per ottenere la differenziazione cellulare TH 17 per Eli SA e QPCR. Dopo il periodo di incubazione, il pool triplica ogni campione in singole provette einor. Dopo aver centrifugato le cellule, trasferire il surnatante in provette einor separate e conservarlo a meno 20 gradi Celsius per misurare successivamente la produzione di IL 17 A da parte di ELI.

A.To preparare per la QPCR dopo aver rimosso il surnatante, risospendere, i pellet rimanenti in 175 microlitri, tampone di lisi dell'RNA per l'estrazione immediata dell'RNA o conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento di iniziare la procedura dopo il periodo di incubazione. In preparazione all'attivazione cellulare prima dell'IL 17, un pool di colorazione intracellulare ciascuna delle cellule di controllo che inducono o attivano il TH 17 triplica in singoli pozzetti di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti. Aggiungere 400 microlitri di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto.

Per portare il volume totale fino a un millilitro, aggiungere lo ione PMA micina e il feldene A a ciascun pozzetto e incubare le cellule per quattro ore a 37 gradi Celsius per rilevare la presenza di IL 17 A mediante colorazione intracellulare e citometria a flusso. Innanzitutto, trasferire le cellule da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti in una provetta einor separata. Quindi centrifugare i tubi.

Rimuovere i surnatanti e risospendere i pellet cellulari in 200 microlitri di tampone fax. Trasferire le cellule risospese in una piastra per citometria a flusso a 96 pozzetti e centrifugare nuovamente le cellule dopo aver lavato i pellet in 200 microlitri di tampone fax, risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone fax e aggiungere 100 microlitri della miscela di colorazione extracellulare degli anticorpi. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.

Dopo aver lavato le cellule due volte, incubare i pellet in 100 microlitri di BD cyto. Fissare il tampone cyto perm coperto con un foglio per 20 minuti a temperatura ambiente. Ora lavare le cellule due volte in 100 microlitri di un tampone di lavaggio X BD perm, quindi incubare le cellule in 50 microlitri di miscela di anticorpi intracellulari coperta da un foglio per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver lavato nuovamente le cellule, sospenderle in 200 microlitri di tampone di colorazione BD, quindi trasferire le cellule in provette per citometria a flusso contenenti 200 microlitri di tampone di colorazione. Conservare le provette a quattro gradi Celsius fino a quando non sono pronte per essere lette per l'analisi citofluorimetrica del primo cancello dei campioni sulla popolazione di cellule vive. Quindi, utilizzare la popolazione di cellule vive per eseguire il gate della popolazione CD quattro CD positivi otto negativi.

Infine, dalla popolazione CD quattro positivi CD otto negativi sulla popolazione IL 17 A per differenziare le cellule TH 17, le cellule linfonodali e milza raggruppate non frazionate devono essere arricchite per la popolazione di cellule T CD 25 negative CD quattro positive. In questa figura, sono mostrate le cellule linfonodali raggruppate non frazionate, i citi SP e le frazioni di cellule TT separate AutoMax colorate con anti CD quattro e anti CD 25. Questo primo grafico a dispersione mostra un profilo rappresentativo della percentuale di linfociti CD quattro positivi, CD 25 positivi e CD quattro positivi CD 25 negativi presenti nei linfonodi aggregati non frazionati e nelle cellule della milza.

La procedura di isolamento fornisce anche una popolazione arricchita di treg CD quattro positivi CD 25 che può essere utilizzata in ulteriori esperimenti. In questo grafico a dispersione finale, viene mostrato l'arricchimento cellulare desiderato con una popolazione composta per l'84% da CD, quattro cellule T CD, 25 negative CD. Questa popolazione arricchita di cellule T CD 25 negative CD 25 arricchita aiuta a garantire una differenziazione più efficace di TH 17, come illustrato in questa figura.

Mentre l'incubazione di linfociti T CD, quattro positivi CD, 25 negativi con anti CD tre e anti CD 28 per cinque giorni produce linfociti T positivi CD 25, l'incubazione in condizioni che inducono TH 17 produce un sottogruppo di linfociti IL 17 che producono CD, quattro linfociti CD 25 positivi. Lo stato di differenziazione del TH 17 può essere ulteriormente valutato attraverso la PCR quantitativa ed Elis A, qui i dati provenienti da CD arricchiti, quattro linfociti T positivi CD, 25 negativi incubati sotto controllo o condizioni che inducono TH 17 sono mostrati CD, quattro positivi. I linfociti T negativi CD 25 incubati in condizioni di TH 17 sovraregolano IL 17 A, che può essere accertato attraverso QPCR ed ELI SA. Il fattore di trascrizione specifico TH 17 ROAR gamma T è anche sovraregolato da CD, quattro cellule T CD25 negative CD, incubate in condizioni di induzione di TH 17, come può essere misurato mediante QPCR.

Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di raggiungere almeno una purezza cellulare dell'80% CD quattro positivi CD 25 negativi prima di incubare le cellule in condizioni di induzione del TH 17. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare i linfonodi e la milza da topi C 57 black six, come incubare le cellule in condizioni di controllo T otto 17 o attivazione e come valutare la differenziazione di linfociti T quattro T naive in T otto 17 cellule Sud.