Articolo metodologico

Microfluidic On-chip Capture-cicloaddizione Reazione di immobilizzare reversibilmente piccole molecole o strutture multi-componenti per applicazioni Biosensor

DOI:

10.3791/50772

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23 settembre 2013

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1Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital

In questo articolo

Sommario

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Vi presentiamo un metodo rapido, immobilizzazione reversibile di piccole molecole e gruppi di nanoparticelle funzionalizzate per Surface Plasmon Resonance (SPR) studi, utilizzando sequenziale acquisizione on-chip bioorthogonal chimica di cicloaddizione e antigene-anticorpo.

Abstract

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Metodi per l'immobilizzazione rapida superficie di piccole molecole bioattive controllanti orientamento e la densità di immobilizzazione sono altamente desiderabile per applicazioni di biosensore e microarray. In questo studio, usiamo un bioorthogonal altamente efficiente covalente [4 +2] reazione di cicloaddizione tra trans-cicloottene (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) per consentire l'immobilizzazione microfluidica di molecole TCO / Tz-derivatizzate . Controlliamo il processo in tempo reale, in condizioni di flusso continuo con risonanza plasmonica di superficie (SPR). Per attivare immobilizzazione reversibile ed estendere la gamma sperimentale della superficie del sensore, si combinano un componente della cattura non covalente antigene-anticorpo con la reazione di cicloaddizione. Alternativamente presentando TCO o Tz porzioni di superficie del sensore, più processi cattura-cicloaddizione sono ora possibile su una superficie del sensore per gli studi di assemblaggio e di interazione on-chip di una varietà di strutture multi-componente. Abbiamo illustrate questo metodo con due diversi esperimenti immobilizzazione su un chip biosensore, una piccola molecola che si lega, AP1497-FK506 binding protein 12 (FKBP12), e la stessa piccola molecola come parte di una nanoparticella situ-funzionalizzati immobilizzato e in.

Introduzione

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Le reazioni di coniugazione efficienti sono strumenti preziosi per il fissaggio molecole bioattive alle superfici per una varietà di applicazioni biotecnologiche. Recentemente, il bioorthogonal molto veloce [4 +2] reazione di cicloaddizione tra trans-cicloottene (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) è stato utilizzato per etichettare superfici cellulari, strutture subcellulari, anticorpi e nanoparticelle 1. - 7 Qui, usiamo la [4 +2] cicloaddizione reazione in combinazione con la cattura antigene / anticorpo (GST / anti-GST) per le reversibili sintesi on-chip di strutture multi-componente per Surface Plasmon Resonance (SPR) analisi dell'interazione e monitoriamo l' processo in tempo reale (Figura 1). 8,9 In particolare, la strategia cattura-cicloaddizione ha la rigenerazione superficie utilizzando un protocollo prestabilito. 8 Di conseguenza, il montaggio di superficie dei sensori stabili controllanti orientamento ligando e densità per varietà di nuovo saggio Formati è ora possibile. Utilizzoquesta strategia si dimostra l'immobilizzazione di piccole molecole TCO / Tz-derivatizzati e caratterizzare i tassi di cicloaddizione in una varietà di condizioni di buffer. Abbiamo scelto l'interazione noto tra FKBP12 e un AP1497 molecola che si lega FKBP12 10-12 come esempio per verificare che la strategia cattura-cicloaddizione conserva la capacità della piccola molecola di interagire con il proprio obiettivo quando sia direttamente collegato agli antigeni immobilizzati GST o alle nanoparticelle immobilizzati (NPS).

Questo metodo offre diversi vantaggi. In primo luogo, l'immobilizzazione reversibile di piccole molecole su chip del sensore è ora possibile. In secondo luogo, TCO / Tz immobilizzazione di piccole molecole consente anche studi di interazione label-free che invertire l'orientamento di studi SPR canoniche, e può fornire una visione complementare di un'interazione vincolante. In terzo luogo, questo metodo consente la sintesi microfluidica di nanoparticelle mirati e valutazione immediata della loro bindinag proprietà. Questo promette di migliorare l'efficienza di valutazione o di screening nanoparticelle mirati, e anche diminuire la quantità di nanoparticelle richiesti. 13-15 Quarto, questo approccio può misurare la cinetica di reazione delle reazioni di cicloaddizione bioorthogonal in tempo reale in flusso continuo. Infine, l'immobilizzazione chimica TCO / Tz è robusta in presenza di siero. Presi insieme, prevediamo che questo approccio versatile sarà ampiamente facilitare la costruzione di superfici sensori stabili per un'ampia varietà di studi microfluidici rilevante per in vitro e in vivo applicazioni cellulari.

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Protocollo

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1. Preparazione di GST e nanoparticelle (NP) coniugati

  1. GST-TCO preparazione:
    1. Aggiungere 8 ml di soluzione di TCO-NHS (50 mM in DMSO) a 100 ml di GST (1 mg / ml in PBS) e agitare la miscela a temperatura ambiente per 1 ora.
    2. Rimuovere il reagente in eccesso utilizzando una colonna di spin dissalazione Zeba. Il filtrato recuperato contenente il coniugato GST-TCO viene conservato a 4 ° C prima dell'uso.
  2. GST-Tz preparazione:
    1. Aggiungere 6 ml di soluzione Tz-NHS (25 mM in DMF) a 75 ml di GST (1 mg / ml in PBS) e agitare la miscela a temperatura ambiente per 1 ora.
    2. Diluire la miscela di reazione con 25 ml di PBS e purificare utilizzando una colonna di spin dissalazione. Il filtrato contenente coniugato GST-Tz è conservato a 4 ° C prima dell'uso.
    Nota: le analisi di massa (MALDI-TOF) ha mostrato che in media ~ 10 Tz o TCO molecole sono stati coniugati al GST.
  3. NP-TCO preparazione:
    1. Aggiungere 100 ml di soluzione TCO-NHS (50 mm in DMSO) per150 ml di nanoparticelle amminato (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml in PBS, nucleo di ferro 3 nm ~ 8.000 Fe / NP) e agitare la miscela a temperatura ambiente per 1 ora.
    2. Rimuovere l'eccesso di reagente per filtrazione su gel usando una colonna NAP-10 eluita con tampone PBS. Raccogliere la banda colorata contenente il prodotto NP-TCO.
    3. Concentrare il filtrato fino ad un volume finale di ~ 150 microlitri utilizzando un dispositivo di filtro centrifugo (100 k MWCO).
    4. Aggiungere 50 ml di anidride succinica, (0,1 M in DMSO) alla soluzione NP-TCO ed agitare a temperatura ambiente per 1 ora (anidride reagisce con i rimanenti ammine per formare acidi carbossilici terminali. Ciò impedisce interazioni non specifiche con la superficie destrano).
    5. Purificare il prodotto NP-TCO utilizzando una colonna NAP-10 eluendo con PBS. Conservare la soluzione di NP-TCO a 4 ° C prima dell'uso.

2. Preparazione della superficie

Tutti i saggi di risonanza plasmonica di superficie vengono eseguite su uno strumento Biacore T100 (GE Healthcare) a25 ° C utilizzando un chip sensore CM5 e PBS-P come tampone di corsa se non diversamente specificato. Biacore di controllo e di valutazione del software fornito con lo strumento sono impiegati per la creazione di esperimenti e analisi dei dati. Due modalità di funzionamento, maghi applicazione ed eseguire manuale saranno utilizzati per la preparazione delle superfici e monitoraggio on-chip di cattura-cicloaddizione. La modalità di metodo costruttore sarà utilizzato per la creazione di orientamento esperimenti di legame inverso e per misurare velocità di reazione di cicloaddizione. I dati sono il doppio di riferimento sottratto e analisi cinetiche vengono eseguite utilizzando un modello di Langmuir vincolante 1:1.

  1. Utilizzare il modello wizard ammina immobilizzazione e selezionare immobilizzazione su cellule di flusso 1 (di riferimento) e 2 (rivelazione). Modifica metodo ammina per attivare gruppi carbossilici superficiali mediante iniezione di una soluzione 0,4 M 1:1 EDC: 0,1 M NHS per 480 secondi ad una portata di 10 microlitri / min. Impostare l'iniezione di etanolamina per placare rimanenti esteri attivati ​​a 420 sec il tempo di contatto auna portata di 10 microlitri / min.
  2. Input nome ligando, anti-GST (18 ug / ml in tampone acetato, pH 5,0) e impostare per iniettare per un tempo di contatto di 420 sec con una portata di 10 microlitri / min.
  3. Posizionare flaconcini soluzione necessaria in reagente rack 2 assicurandosi abbinare le posizioni con l'elenco dei contenuti. Salva e avvia l'immobilizzazione.
    Nota: Esecuzione della procedura guidata immobilizzazione in questo modo si traduce in livelli di immobilizzazione anti-GST nell'intervallo ~ 14.000 a 17.000 RU.
  4. Modificare la procedura guidata immobilizzazione di iniettare solo GST legante soluzione (20 mg / ml) per 420 secondi a 5 ml / min sopra cella di flusso di riferimento 1.

3. Monitoraggio on-chip cattura-cicloaddizione di molecole funzionalizzate

  1. Monitoraggio on-chip cattura-cicloaddizione in tempo reale (Figura 2).
    1. Posizionare GST-TCO (20 mg / ml), Tz-BnNH 2 (10 micron) e rigenerazione (glicina 10 mM, pH = 2.0) flaconi di soluzioni in reagente rack 2. Selezionare l'uomometodo run manuale, impostare la portata a 5 ml / min e la portata percorso di flusso cella 2.
    2. Iniettare la soluzione di GST-TCO per 420 sec.
    3. Iniettare la soluzione di Tz-BnNH 2 per 600 sec.
    4. Rigenerare la superficie con due iniezioni di 30 secondi di soluzione di rigenerazione.
  2. Monitoraggio montaggio su chip di strutture multi-componente in tempo reale (Figura 3):
    1. Posizionare GST-Tz (20 mg / ml), NP-TCO (100 mg Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 micron) e rigenerazione (glicina 10 mM, pH = 2.0) flaconi di soluzioni in reagente rack 2. Selezionare il metodo di esecuzione manuale dello strumento, impostare la velocità di flusso di 5 ml / min e il percorso del flusso di flusso cella 2.
    2. Iniettare una soluzione di GST-Tz per 60 sec.
    3. Iniettare una soluzione di NP-TCO per 60 sec.
    4. Iniettare una soluzione di Tz-BnNH 2 per 60 sec.
    5. Rigenerare la superficie con due iniezioni di 30 secondi di soluzione di rigenerazione.

4. MONITORAGGIO immobilizzazione densità e la determinazione di cicloaddizione Tariffe

  1. Caratterizzazione delle piccole velocità di reazione di cicloaddizione molecola (Figura 4).
    1. Selezionare i nuovi parametri generali di metodo e di input. Nel pannello passaggi del test creare un nuovo passo e il nome del campione. Impostare l'Scopo e Collegare le impostazioni di base per campione.
    2. Nel pannello tipi di ciclo Creare un nuovo passo ciclo ed inserire i seguenti comandi: Capture, Campione, Rigenerazione 1 e Rigenerazione 2.
    3. Selezionare il comando Capture, nome dell'ingresso ligando (GST-TCO, 20 mg / ml), tempo di contatto 120 sec a 5 ml / min e il percorso del flusso impostato su: Second. Selezionare il comando di esempio; ingresso 180 sec Tempo di contatto, 60 sec tempo dissociazione, portata 30 ml / min e il percorso del flusso impostato: Entrambi. Selezionare il comando Rigenerazione 1; rigenerazione di input nome della soluzione (10 mM glicina-HCl pH 2.0), tempo di contatto di 30 secondi a 30 ml / min e il percorso del flusso impostato su: Second. Ripetere la stessa per la rigenerazione 2 comando.
    4. Selezionare Esegui il programma di installazione e il percorso del flusso impostato: 2-1. Selezionare il prossimo e riempire la lista campione con una soluzione di analita (Tz-BnNH 2) e serie di concentrazioni (0,3-10 micron, 1:2). Seleziona accanto a rack pannello di posizione. Fiale di soluzione Luogo in reagente rack 2 e serie di diluizioni in piastra a 96 pozzetti assicurandosi abbinare le posizioni con l'elenco dei contenuti. Salvare metodo template e iniziare saggio di legame. Associazione dati e analisi cinetica sono mostrati in Figura 4.
  2. Caratterizzazione di NP velocità di reazione di cicloaddizione (Figura 4).
    1. Aprire il modello metodo salvato da sopra e modificare i seguenti parametri. Selezionare il pannello Acquisizione, cambio di nome ligando di GST-Tz, 20 mg / ml. Selezionare il pannello di esempio, il cambiamento tempo di contatto di 120 sec tempo di contatto e il tempo di dissociazione di 120 sec.
    2. Selezionare l'elenco di esempio, cambiare analita serie di concentrazioni (7-224 nM, 1:2) NP-TCO e. Fiale di soluzione Luogo in cremagliera del reagente2 e serie di diluizioni in piastra a 96 pozzetti assicurandosi abbinare le posizioni con l'elenco dei contenuti. Salvare metodo template e iniziare saggio di legame. Associazione dati e analisi cinetica sono mostrati in Figura 4.

5. Misurare il legame di FKBP12 per AP1497 Immobilizzato

Reverse orientamento studi di legame impiegano FKBP12 come l'analita e AP1497 composto come ligando immobilizzato (Figura 5). Il metodo generale per questo dosaggio è impostato come segue utilizzando lo strumento metodo costruttore:

  1. Selezionare i nuovi parametri generali di metodo e di input. Nel pannello passaggi del test creare e nome Capture, esempio e rigenerazione passi. Selezionare corrispondente Finalità e Collegare le impostazioni di base.
  2. Selezionare pannello Tipi di ciclo e di creare 3 fasi del ciclo: Capture, esempio e rigenerazione.
  3. Inserire il comando Capture due volte sotto passo ciclo Capture. Selezionare Capture 1 pannello e selezionare soluzione di acquisizione come variable, impostare il tempo di contatto di 300 sec ad una portata di 5 ml / min e il percorso di flusso impostato: Second. Selezionare il pannello Acquisizione 2 e selezionare la soluzione di acquisizione come variabile, impostare il tempo di contatto a 250 secondi a una velocità di flusso di 5 ml / min e il percorso del flusso impostato su: Second.
  4. Inserire il comando del campione sotto il passo ciclo di campionamento. Selezionare il pannello Campione; set tempo di contatto di 60 secondi, tempo dissociazione di 200 sec ad una portata di 30 microlitri / min e percorso di flusso impostato: Entrambi.
  5. Inserire il comando Rigenerazione due volte sotto il gradino ciclo di rigenerazione. Selezionare il pannello Rigenerazione 1; rigenerazione di input nome della soluzione (10 mM glicina-HCl pH 2.0), tempo di contatto di 30 secondi a 30 ml / min e il percorso del flusso impostato su: Second. Ripetere la stessa per il pannello Rigenerazione 2.
  6. Selezionare Esegui il programma di installazione e il percorso del flusso impostato: 2-1. Selezionare i nomi soluzione di acquisizione entro e ingresso (GST-TCO e AP1497-TZ), nome del campione (FKBP12), serie di concentrazioni (0,020-5 mcg / ml, 1:2) e MW (13.000). Fiale di soluzione posto in reagent rack 2 e serie di diluizioni in piastra a 96 pozzetti assicurandosi abbinare le posizioni con l'elenco dei contenuti. Salvare metodo template e iniziare saggio di legame. Dati di analisi cinetica sono mostrati in Figura 5.

6. Misurare il legame di FKBP12 per AP1497 Allegata alla immobilizzato NP

Il metodo generale per nanoparticelle immobilizzazione, piccola molecola derivatizzazione e FKBP12 saggio di legame è di set-up come segue utilizzando lo strumento metodo costruttore:

  1. Aprire il modello metodo salvato da sopra e modificare. Inserire un comando supplementare Capture dalla fase del ciclo di acquisizione. Selezionare il Capture 1 pannello; deselezionate soluzione di acquisizione come variabile e il nome soluzione di acquisizione 1 (GST-Tz). Set tempo di contatto di 60 secondi a una velocità di flusso di 5 ml / min e il percorso di flusso impostato secondo. Selezionare il pannello Acquisizione 2; deselezionare soluzione di acquisizione come soluzione di acquisizione variabile e il nome 2 (NP-TCO). Tempo impostato contatto per 90 secondi a una velocità di flusso di 5 ml / min epercorso di flusso impostato secondo. Selezionare il pannello Capture 3; deselezionate soluzione di acquisizione come soluzione di acquisizione variabile e 3 Nome (AP1497-Tz). Tempo impostato contatto per 180 sec ad una velocità di flusso di 5 ml / min e il percorso del flusso impostato su Second.
  2. Selezionare Esegui il programma di installazione e il percorso del flusso impostato: 2-1. Selezionare Avanti due volte. Fiale di soluzione Luogo in reagente rack 2 e serie di diluizioni in piastra a 96 pozzetti assicurandosi abbinare le posizioni con l'elenco dei contenuti. Salvare metodo template e iniziare saggio di legame. Dati di analisi cinetica sono mostrati in Figura 5.

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Risultati

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Dati e cifre sono stati adattati da riferimento 8.

Efficiente immobilizzazione reversibile di piccole molecole bioattive con controllo su orientamento e la densità gioca un ruolo chiave nello sviluppo di nuove applicazioni biosensori. Utilizzando la reazione veloce bioorthogonal tra TCO e Tz, si descrive un metodo per l'assemblaggio graduale e rigenerazione di superfici ligando con mantenimento dell'attività biologica. Figura 2 mostra il monitoraggio in tempo reale di Tz-BnN...

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Discussione

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Il metodo di cattura-cicloaddizione qui descritta consente una rapida, immobilizzazione reversibile di nanoparticelle modificate e piccole molecole di interazione basato su chip privo di etichetta e studi cinetici. Il protocollo immobilizzazione può essere eseguita in pochi minuti richiedono <10 pM concentrazioni di ligandi piccole molecole. Modulando la concentrazione del ligando e densità di immobilizzazione tempo di contatto può essere strettamente controllata. I nostri dati mostrano che le reazioni bioorthogonal ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Riconosciamo finanziamento dal NIH (NHLBI contratto n HHSN268201000044C a Rw, SH e SYS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagent
Sensor Chip CM5GE HealthcareBR-1005-30 
Kit di accoppiamento amminicoGE HealthcareBR-1000-50 
Kit di acquisizione GSTGE HealthcareBR-1002-23 
NAP-10 ColonneGE Healthcare17-0854-01 
GST, liofilizzato in 1X PBSGenscriptZ020391 mg/ml
rhFKBP12R& D Sistemi3777-FK
Tensioattivo P-20GE HealthcareBR-1000-54 
Glicina 2.0GE HealthcareBR-1003-55 
Colonna di desalinizzazione Zeba spinThermo898827 K MWCO
Amicon Ultra 4FisherUFC810096100 K filtro centrifugo
TCO-OHRef. 8Sintetizzato internamente
TCO-NHSRef. 8Sintetizzato internamente, *Disponibile in commercio da Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2Ref. 8Sintetizzato internamente
Tz-NHSRef. 8764701Sintetizzato internamente, *Disponibile in commercio da Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2Ref. 8Sintetizzato internamente
AP1497, AP1497-TzRif. 8Sintetizzato internamente
Equipment
SPR BiosensorGE SanitàBiacore T100 

Riferimenti

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