Vi presentiamo un metodo rapido, immobilizzazione reversibile di piccole molecole e gruppi di nanoparticelle funzionalizzate per Surface Plasmon Resonance (SPR) studi, utilizzando sequenziale acquisizione on-chip bioorthogonal chimica di cicloaddizione e antigene-anticorpo.
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Articolo metodologico
Microfluidic On-chip Capture-cicloaddizione Reazione di immobilizzare reversibilmente piccole molecole o strutture multi-componenti per applicazioni Biosensor
In questo articolo
Sommario
Abstract
Metodi per l'immobilizzazione rapida superficie di piccole molecole bioattive controllanti orientamento e la densità di immobilizzazione sono altamente desiderabile per applicazioni di biosensore e microarray. In questo studio, usiamo un bioorthogonal altamente efficiente covalente [4 +2] reazione di cicloaddizione tra trans-cicloottene (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) per consentire l'immobilizzazione microfluidica di molecole TCO / Tz-derivatizzate . Controlliamo il processo in tempo reale, in condizioni di flusso continuo con risonanza plasmonica di superficie (SPR). Per attivare immobilizzazione reversibile ed estendere la gamma sperimentale della superficie del sensore, si combinano un componente della cattura non covalente antigene-anticorpo con la reazione di cicloaddizione. Alternativamente presentando TCO o Tz porzioni di superficie del sensore, più processi cattura-cicloaddizione sono ora possibile su una superficie del sensore per gli studi di assemblaggio e di interazione on-chip di una varietà di strutture multi-componente. Abbiamo illustrate questo metodo con due diversi esperimenti immobilizzazione su un chip biosensore, una piccola molecola che si lega, AP1497-FK506 binding protein 12 (FKBP12), e la stessa piccola molecola come parte di una nanoparticella situ-funzionalizzati immobilizzato e in.
Introduzione
Le reazioni di coniugazione efficienti sono strumenti preziosi per il fissaggio molecole bioattive alle superfici per una varietà di applicazioni biotecnologiche. Recentemente, il bioorthogonal molto veloce [4 +2] reazione di cicloaddizione tra trans-cicloottene (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) è stato utilizzato per etichettare superfici cellulari, strutture subcellulari, anticorpi e nanoparticelle 1. - 7 Qui, usiamo la [4 +2] cicloaddizione reazione in combinazione con la cattura antigene / anticorpo (GST / anti-GST) per le reversibili sintesi on-chip di strutture multi-componente per Surface Plasmon Resonance (SPR) analisi dell'interazione e ....
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Protocollo
1. Preparazione di GST e nanoparticelle (NP) coniugati
- GST-TCO preparazione:
- Aggiungere 8 ml di soluzione di TCO-NHS (50 mM in DMSO) a 100 ml di GST (1 mg / ml in PBS) e agitare la miscela a temperatura ambiente per 1 ora.
- Rimuovere il reagente in eccesso utilizzando una colonna di spin dissalazione Zeba. Il filtrato recuperato contenente il coniugato GST-TCO viene conservato a 4 ° C prima dell'uso.
- GST-Tz preparazione:
- Aggiungere 6 ml di soluzione Tz-NHS (25 mM in DMF) a 75 ml di GST (1 mg / ml in PBS) e agitare la miscela a temperatura ambiente per 1 ora.
- Diluire la miscela di reazione con 25 ....
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Risultati
Dati e cifre sono stati adattati da riferimento 8.
Efficiente immobilizzazione reversibile di piccole molecole bioattive con controllo su orientamento e la densità gioca un ruolo chiave nello sviluppo di nuove applicazioni biosensori. Utilizzando la reazione veloce bioorthogonal tra TCO e Tz, si descrive un metodo per l'assemblaggio graduale e rigenerazione di superfici ligando con mantenimento dell'attività biologica. Figura 2 mostra il monitoraggio in tempo reale d.......
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Discussione
Il metodo di cattura-cicloaddizione qui descritta consente una rapida, immobilizzazione reversibile di nanoparticelle modificate e piccole molecole di interazione basato su chip privo di etichetta e studi cinetici. Il protocollo immobilizzazione può essere eseguita in pochi minuti richiedono <10 pM concentrazioni di ligandi piccole molecole. Modulando la concentrazione del ligando e densità di immobilizzazione tempo di contatto può essere strettamente controllata. I nostri dati mostrano che le reazioni bioorthogonal .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Riconosciamo finanziamento dal NIH (NHLBI contratto n HHSN268201000044C a Rw, SH e SYS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Kit di accoppiamento amminico | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| Kit di acquisizione GST | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Colonne | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, liofilizzato in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R& D Sistemi | 3777-FK | |
| Tensioattivo P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glicina 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Colonna di desalinizzazione Zeba spin | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K filtro centrifugo |
| TCO-OH | Ref. 8 | Sintetizzato internamente | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Sintetizzato internamente, *Disponibile in commercio da Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Sintetizzato internamente | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Sintetizzato internamente, *Disponibile in commercio da Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Sintetizzato internamente | |
| AP1497, AP1497-Tz | Rif. 8 | Sintetizzato internamente | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Sanità | Biacore T100 |
Riferimenti
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al.
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Ristampe e permessi
