Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

Cellule satelliti muscolari sono una piccola frazione di cellule staminali miogeniche situati sotto la lamina basale delle fibre muscolari scheletriche. Essi sono caratterizzati dall'espressione di Pax7, Pax3, c-Met, M-caderina, CD34, Syndecan-3, e calcitonina ^{1 - 3.} Le cellule satelliti hanno dimostrato di essere responsabile della rigenerazione muscolare come cellule staminali muscolari. Nel muscolo adulto, cellule satelliti sono normalmente mitoticamente riposo ^4-8. A seguito di infortunio, le cellule satellite sono attivati, avviare espressione di MyoD, e entrare nel ciclo cellulare per espandere la loro progenie, chiamato cellule precursori miogeniche o mioblasti ^3. Dopo diversi cicli di divisione cellulare, mioblasti escono dal ciclo cellulare e fusibile tra loro al fine di differenziamento in miotubi multi-nucleate, seguite da fibre muscolari mature. Mioblasti isolati dal muscolo adulto possono essere facilmente espanse ex vivo. La capacità di mioblasti per diventare fibre muscolari in rigenerazione muscolare e perfibre muscolari ectopiche forma nei tessuti non muscolari è utilizzata da trapianto dei mioblasti, un potenziale approccio terapeutico per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) ^4, disfunzioni urologiche ^9, e insufficienza cardiaca ^10. Infatti, mioblasti sono stati trapiantati con successo nel muscolo di entrambe mdx (modello DMD), topi e pazienti DMD ^11-14. I mioblasti normali iniettati fondono con le fibre muscolari ospitante per migliorare l'istologia e la funzione del muscolo malato. Il lavoro precedente ha dimostrato che sottopopolazioni di mioblasti sono più Stem Cell-like e rimangono in uno stato indifferenziato più a lungo nel muscolo durante la rigenerazione muscolare ^5. Studi recenti hanno dimostrato che le cellule appena isolate satellitari di muscolo adulto contengono una popolazione di cellule simil-staminali che presenta attecchimento più efficiente e attività di auto-rinnovamento nella rigenerazione del muscolo ^5-8. Pertanto, la purificazione di una popolazione pura di cellule satelliti quiescenti da adulto mu scheletricosclerosi è essenziale per la comprensione della biologia delle cellule satelliti, mioblasti e rigenerazione muscolare, e per lo sviluppo di terapie cellulari.

Tuttavia, attuali metodi di purificazione potenziali di cellule satelliti quiescenti richiedono l'uso di un costoso fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) ^1,2,6-8 macchina. Inoltre, l'esposizione laser FACS tende ad indurre la morte cellulare durante la separazione, che causa bassa resa di cellule satelliti quiescenti ^15. Qui, presentiamo un nuovo metodo per la purificazione rapido, economico e affidabile di cellule satelliti quiescenti di topo adulto muscolo scheletrico. Questo metodo utilizza dissociazione enzimatica seguita da cellule magnetico attivato classificare (MACS). Dopo aver isolato cellule satelliti quiescenti puri, queste cellule possono essere coltivate avere un gran numero di mioblasti dopo vari passaggi. Mostriamo anche che l'iniezione intramuscolare di questi appena isolate cellule satellite quiescenti o ex vimioblasti vo espansi possono essere trapiantate in cardiotossina (CTX) indotta rigenerazione del mouse muscolo scheletrico per esaminare il contributo delle cellule derivate dal donatore alla rigenerazione delle fibre muscolari, nonché ai compartimenti cellulari satellitari per l'esame delle attività di auto-rinnovamento.

Gli animali sono stati alloggiati in un ambiente SPF e sono stati monitorati dalla Direzione Risorse ricerca su animali (RAR) dell'Università del Minnesota. . Gli animali sono stati sacrificati con mezzi adeguati (CO ₂ inalazione o iniezione KCl dopo essere stati anestetizzati con iniezione IP di Avertin (250 mg / kg) Tutti i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC, numero di codice: 1304-30.492 ) dell'Università del Minnesota.

1. Isolamento di mononucleari cellule dal muscolo scheletrico mouse

1. Correttamente sacrificare 1 o 2 giovani topi adulti (3-8 settimane).
   1. Pizzicare e fessura la pelle dell'addome con forbici affilate. Staccare la pelle per mostrare completamente tricipiti e muscoli degli arti posteriori (tirare la pelle in direzioni opposte).
   2. Rimuovere tutti i muscoli delle gambe scheletriche (tibiale anteriore, gastrocnemio e quadricipite) e tricipiti lungo le ossa con le forbici. Poi il trasferimento muscoli ghiacciata, sterile PBS in un piatto 10 centimetri.
2. Lavare il sangue fuori i muscoli in PBS e muscoli trasferimento ad una nuova piastra sterile 6 centimetri: 1 piastra per 1-2 topi.
3. Rimuovere il tessuto connettivo, vasi sanguigni, fasci nervosi, e tessuto adipogenico sotto un microscopio di dissezione.
4. Utilizzando le forbici per oftalmologia, tagliare e tritare il tessuto in una pasta liscia (Figure 1A e 1B). Cercate di non lasciare pezzi di grandi dimensioni, in quanto non saranno suddivisi facilmente dalla soluzione enzimatica.
5. Trasferire i muscoli tritati in una provetta Falcon da 50 ml e aggiungere 5 ml di soluzione di collagenasi (0,2% collagenasi di tipo 2 nel 10% FBS in DMEM). Incubare a 37 ° C per 60 min.
6. Triturare (su e giù con un ago 18 G) per omogeneizzare la miscela (Figura 1C). Incubare ulteriormente la miscela a 37 ° C per 15 min.
7. Triturare nuovo per omogeneizzare la miscela a dissociarsi in sospensione singola cella. Aggiungere 2% FBS in DMEM fino a 50 ml nella sospensione di cellule singole e mescolarebene.
8. Mettere un filtro cella (70 micron) su un tubo ml Falcon 50 (Figura 1D). Trasferire il supernatante contenente le cellule dissociate su un filtro cella e pipetta la sospensione cellulare su e giù sul filtro fino ad attraversare.
9. Contare il numero di cellule da emocitometro. Centrifugare le provette a 2000 rpm a 4 ° C per 5 minuti; aspirare e scartare il surnatante.
10. Risospendere con 10 ml di 2% FBS in DMEM. Centrifugare le provette a 2000 rpm a 4 ° C per 5 minuti; aspirare e scartare il surnatante.
11. Risospendere con 200 ml di 2% FBS in DMEM e sospensione cellulare trasferimento in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Solitamente, circa 2 x 10 ⁶ cellule devono essere raccolte da muscoli di 1 mouse. Le cellule saranno diluiti ad una concentrazione di 1 x 10 ⁶ cellule in 100 microlitri di 2% FBS in DMEM.

2. Antibody colorazione e separazione con MACS

Durante il seguente procedures, mantenere condizioni di sterilità utilizzando tamponi sterili. Ogni volume di anticorpi aggiunto e mezzo di sospensione cellulare è calcolato per cellule di muscoli intere di 1 mouse. Se le cellule vengono raccolte da 2 o più topi, la quantità di reagenti dovrebbe essere ottimizzato.

1. Aggiungere 1 ml ciascuna di CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, e integrina anticorpo α7 in 200 microlitri della sospensione cellulare. Incubare in ghiaccio per 30 min.
2. Lavare le cellule: Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di 2% FBS in DMEM nella sospensione cellulare nella provetta da 1,5 ml e centrifugare a 2000 rpm a 4 ° C per 3 min. Ripetere questa operazione due volte.
3. Aspirare e scartare il surnatante.
4. Risospendere le cellule con 200 ml di 2% FBS in DMEM, e aggiungere 10 ml di Anti-PE sfere magnetiche. Incubare in ghiaccio per 30 min.
5. Lavare le cellule: Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di tampone MACS alla sospensione cellulare nella provetta da 1,5 ml microcentrifuga, e quindi si centrifuga a 2000 rpm a 4 ° C per 3 min. Ripetere questo passaggio twghiaccio. Si noti che le celle devono essere lavati a tampone MACS prima di essere separati da una colonna magnetica.
6. Aspirare e scartare il surnatante. Risospendere le cellule con 1,0 ml di tampone MACS.
7. Impostare colonna LD su una tavola magnetica, e sciacquare la colonna con 2.0 ml di tampone MACS (Figura 1E).
8. Trasferire la sospensione cellulare in colonna LD, e raccogliere la frazione di flusso passante in una provetta da 1,5 ml. Questa frazione contiene cellule PE-negativo.
9. Centrifugare a 2000 rpm a 4 ° C per 3 minuti, aspirare e scartare il surnatante.
10. Risospendere le cellule con 200 ml di 2% FBS in DMEM, e aggiungere 10 ml di IgG anti-topo sfere magnetiche. Incubare in ghiaccio per 30 min.
11. Lavare le cellule: Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di tampone MACS in sospensione di cellule in provetta da 1,5 ml, quindi si centrifuga a 2000 rpm a 4 ° C per 3 min. Aspirare e scartare il surnatante. Ripetere questa operazione due volte. Risospendere le cellule con 500 microlitri di tampone MACS.
12. Impostare colonna MS su una tavola magnetica, e sciacquare la colonna con 500 microlitri di tampone MACS (Figura 1F).
13. Trasferimento sospeso soluzione di cellule nella colonna MS, e scartare la frazione flow-through (integrina α7-negativi cellule).
14. Sciacquare con 1 ml di tampone MACS, e ripetere questo passaggio due volte.
15. Dopo il risciacquo, rimuovere colonna dal campo magnetico del separatore. Applicare 1,0 ml di tampone MACS sulla colonna, ed eluire le cellule marcate magneticamente (cellule positive α7-integrina) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga spingendo lo stantuffo della siringa dalla parte superiore della colonna. Raccogliere il flusso continuo in una provetta da 1,5 ml. Ripetere l'eluizione con 1,5 ml di tampone MACS e raccogliere il flow-through.
16. Centrifugare a 2000 rpm a 4 ° C per 3 minuti, aspirare e scartare il surnatante.
17. Risospendere le cellule purificate con 1 ml di Myoblast medio (20% FBS conteneva Hams F-10 con bFGF), e cellule piastra su Matrigel rivestite 10 centimetripiastra con 8 ml di Myoblast Piano (5 ml a 6 centimetri piastra) (Figura 1G). Si noti che 1-2 x 10 ⁵ cellule possono potenzialmente essere isolate dal 1 muscolo intatto il mouse.

3. Manutenzione

1. Concime cellule ogni altro giorno con mezzo Myoblast. La comparsa di mioblasti crescita è di un piccolo e rotondo esprimere MyoD (Figura 2) e Pax7 (dati non mostrati) nel loro nucleo.
2. Mioblasti dovrebbero essere diversi passaggi prima che il 50% di confluenza o quando si inizia la fusione cellulare. Dopo il risciacquo una volta con PBS, incubare le cellule con soluzione di tripsina 0,25% a 37 ° C per 3 minuti in un incubatore CO ₂ e raccogliere le cellule dissociate con mezzo Myoblast. Dopo cellule centrifuga (1000 rpm per 5 min), la sospensione con il mezzo Myoblast e replate cellule su nuove piastre Matrigel rivestite. Piastre di collagene rivestite possono essere utilizzati dopo il passaggio 3. Un piatto di solito può essere suddiviso in 3-5 piatti.

4. Differentiation

1. Inserire di nuovo con Differenziazione medio ogni altro giorno.
2. Di giorno 1 nella differenziazione Medium, mioblasti escono dal ciclo cellulare e subiscono differenziazione in catena pesante della miosina (MHC)-positivo miociti. Questi myoctyes iniziano fusione cellulare con l'altro per generare miotubi multinucleate. In genere, la maggior parte dei mioblasti diventano MHC-positivi di differenziazione miociti mononucleate o miotubi (Figura 2) di giorno 3-5 in Differenziazione Medium.

5. Myoblast trapianto in mouse per la rigenerazione muscolare scheletrica

1. Anestetizzare il mouse con Avertin (250 mg / kg) per via intraperitoneale (IP) iniezione.
2. Radersi i capelli pelle intorno sul tibiale anteriore (TA) muscolare. Ventiquattro ore prima del trapianto di mioblasti, 10 pM CTX (50 microlitri) viene iniettato per via intramuscolare nel Nod / Scid topo TA muscolare per indurre la rigenerazione muscolare attraverso una siringa da 31 G insulina attraverso la pelle rasata (Figura60, 3).
3. Mioblasti proliferanti sono dissociate con 0,25% di soluzione di tripsina, e centrifugate a 1000 rpm per 5 min. Aspirare e scartare il surnatante. Risospendere 1 x 10 ⁶ cellule con 50 ml di 2% FBS in DMEM. Trasferire le cellule in sospensione in una siringa da insulina 31 G.
4. Topi riceventi saranno anestetizzati con Avertin (250 mg / kg) per iniezione IP, e 1 x 10 ⁶ mioblasti (Figura 2) vengono iniettati per via intramuscolare nel muscolo rigenerante TA.
5. Harvest TA muscolare 1-4 settimane dopo l'iniezione delle cellule per l'analisi istologica (figura 3).

Cellule satelliti quiescenti appena isolate mostrano un piccolo, forma rotonda (Figura 1G), e Pax7 espresso come marcatore definitivo per le cellule satellite quiescenti. Più del 90% delle cellule appena isolate esprimono Pax7 (Figura 1H e 1I). Maggior parte delle cellule contaminate sono da cellule del sangue che non crescono in modo efficiente in vitro seguente condizioni di coltura mioblasti. Così, mioblasti derivati ​​dalle cellule satelliti dominano nella cultura. Opzionalmente, possiamo ripetere i passaggi per MS depurazione colonna (passi 2,11-2,14) per aumentare la purezza delle cellule satelliti isolate. Queste cellule satelliti quiescenti entreranno nel ciclo cellulare entro 24 ore dopo l'isolamento di sottoporsi a cellule precursori miogeniche o mioblasti. Queste cellule possono essere diversi passaggi per tripsinizzazione ogni 4 giorni fino al tasso di proliferazione cellulare è ridotta. In genere, queste cellule possono essere mantenute fino al passaggio 10. Questi mioblasti proliferanti esprimono MyoD ( (Figura 2). Questi vivo mioblasti ex espansi possono essere utilizzati per esperimenti di iniezione intramuscolare di cellule per l'esame del contributo mioblasti per rigenerare le fibre muscolari e cellule satelliti auto-rinnovo. Ventiquattro ore prima iniezione di cellule, CTX viene iniettato nel TA muscoli di due mesi di età topi immunodeficienti NOD / SCID. Mioblasti dissociate sono iniettati CTX indotta rigenerazione muscolare (Figura 3). Il muscolo iniettato può essere raccolto pochi giorni a diversi mesi dopo l'iniezione. Cellule del donatore sono tipicamente geneticamente etichettati con proteina fluorescente verde (GFP) gene 6, β-galattosidasi gene 16 fosfatasi alcalina gene 18 da plasmide trasfezione, infezione vettore virale, o preparazione di topi transgenici portatori di un transgene. Le cellule satelliti da Myf5 eterozigote + / nLacZ topi 19, in cui le cellule miogeniche possono essere rilevati dopo X-gal colorazione, sono stati isolati. I topi Myf5 + / nLacZ portano la β nucleare -. Gene galattosidasi inserito nel locus genico Myf5, in cui l'espressione del gene β-galattosidasi ricapitola l'espressione endogena Myf5 in entrambe le cellule satelliti e cellule precursori miogenici o mioblasti 20 La Figura 3 mostra tutta TA colorazione muscolare per il rilevamento di β-galattosidasi positivi cellule nucleari derivate dal donatore, che comprendono mioblasti proliferanti, cellule satelliti autorinnovanti e fibre muscolari di nuova formazione. Se necessario, questi muscoli TA colorati possono essere usate per istologica séZIONI per ulteriori metodi immunorivelazione.

Figura 1. Preparazione delle cellule satelliti muscolari di topo muscoli scheletrici. A:. Mincing tricipiti sezionati e muscoli dell'arto posteriore da forbici B:. Visualizzazione ingrandita della pannello A C: tritacompattatrice pezzi di muscolo tritati collagenasi-trattati con ago 18 G D:. Filtrante dissociato preparazione muscolare da filtro cella E:. MACS separazione delle dissociata cellule muscolari di colonna LD F:. MACS separazione delle cellule muscolari dissociate dalla colonna MS G:.. cellule satelliti appena isolate H:. cellule satelliti appena isolate Pax7-positivo I: colorazione DAPI per il pannello G.

Figura 3. Iniezione intramuscolare di mioblasti espansi nel topo muscolo scheletrico. A: X-gal colorazione dei mioblasti isolati da topi Myf5 + / nLacZ B, C:. Iniezione intramuscolare di Myf5 + / nLacZ mioblasti in TA muscolare. Myf5 + / nLacZ nella rigenerazione delle fibre muscolari. X-gal colorazione è stata eseguita su TA muscolo iniettato con mioblasti di 1 mese.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.