Abstract
Saggi di adesione cellulare / particelle sono fondamentali per comprendere le interazioni biochimiche coinvolte nella patofisiologia della malattia e avere importanti applicazioni nella ricerca per lo sviluppo di nuove terapie. I saggi che utilizzano condizioni statiche riescono a catturare la dipendenza di adesione su taglio, limitando la loro correlazione con l'ambiente in vivo. Camere di flusso piastra paralleli che quantificano l'adesione sotto il flusso del fluido fisiologico bisogno di più esperimenti per la generazione di una mappa adesione taglio. Inoltre, essi non rappresentano la scala in vivo e morfologia e richiedono grandi volumi (~ ml) di reagenti per esperimenti. In questo studio, abbiamo dimostrato la generazione di taglio mappa adesione da un singolo esperimento utilizzando una rete microvascolare basata dispositivo microfluidica, SynVivo-SMN. Questo dispositivo ricrea il complesso sistema vascolare vivo tra cui scala geometrica, elementi morfologici, le caratteristiche dei flussi e le interazioni cellulari in unformato in vitro, fornendo in tal modo un ambiente biologicamente realistico per ricerca di base e applicata nel comportamento cellulare, la consegna della droga, e la scoperta della droga. Il saggio è stato dimostrato studiando l'interazione dei 2 micron particelle biotina-avidina rivestite con superfici rivestite del microchip. L'intera gamma di taglio osservata nel microcircolo è ottenuta in un singolo saggio consenta adesione vs shear mappa per le particelle in condizioni fisiologiche.
Introduction
Saggi attuali studiare per cellula-cellula e cellula-interazioni delle particelle tipicamente comportano statica formato pozzetti in cui le particelle o le cellule vengono incubate su matrici proteiche o cellule aderenti. Al termine del tempo di incubazione specificato, il numero di particelle aderenti o cellule vengono quantificati mediante microscopia 1. Anche se questi test forniscono informazioni significative sui processi biochimici che stanno dietro queste interazioni, una limitazione fondamentale è la mancanza di flusso del fluido fisiologico (tipico del microcircolo) e il suo impatto sulla adesione delle particelle.
Per superare questa limitazione, camere di flusso in vitro sono stati sviluppati negli ultimi anni. Un elemento comune di queste camere di flusso è un apparecchio trasparente perfusione a bassi numeri di Reynolds per abbinare i tassi di taglio della parete osservati nei vasi sanguigni in vivo 2. La parete del serbatoio è modellato da uno strato di biomolecole o crescita di cellule su una superficie del flusso cHamber 3. Particelle 4-7 o 8-16 cellule vengono poi scorreva dentro al campo desiderato di portate di quantificare il numero di aderire particelle sotto vari gradienti di velocità.
Tuttavia, l'utilizzo di camere di flusso piastra paralleli per studiare e validare i fenomeni biochimici è piuttosto costoso e richiede tempo. Ciò è dovuto principalmente al fatto che esperimenti multipli devono essere realizzati per generare una mappa della fluidico taglio rispetto al numero di particelle / cellule aderito. Inoltre, camere di flusso piastra richiedono grandi volumi di reagenti causa delle loro grandi dimensioni (altezza> 250 micron e larghezza> 1 mm). Infine, questi dispositivi non modellare accuratamente caratteristiche geometriche (ad esempio, biforcazioni) e condizioni di flusso (ad esempio, convergenti vs divergenti flussi) che sono presenti in vivo.
I recenti progressi nella litografia basata microfabbricazione 17-19 hanno accelerato il campo di lab-on-a-chipdispositivi di 20-21. Questi dispositivi hanno contribuito a sviluppare una versione miniaturizzata della camera di flusso a piatti paralleli con dimensioni in regime micrometro. La riduzione di dimensione produce anche vantaggi significativi in termini di volumi di reagenti, cellule o particelle richiesta per esperimenti. Tuttavia, una limitazione chiave dei dispositivi attualmente disponibili è l'uso di canali lineari per modellare microvasi, che non imitano il complesso microcircolo osservato in vivo.
Abbiamo recentemente sviluppato una nuova metodologia per ricreare le reti microvascolari su substrati di plastica usa e getta con conseguente rappresentazione sintetica delle condizioni in vivo. Questi dispositivi chiamati reti microvascolari SynVivo-sintetiche (SMN), sono sviluppate utilizzando PDMS basate processo soft-litografia. Dispositivi SynVivo-SMN possono essere utilizzati per ottenere shear mappa adesione di cellule / particella adesione 22, studio mirato consegna della droga 23 e have stato validato con i dati in vivo 24-25. In questo articolo, vi presentiamo un protocollo che consente la generazione della mappa di adesione al taglio da un singolo esperimento in volumi piccoli come 1-5 microlitri un conseguente notevole risparmio di risorse e di tempo.
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Protocol
1. Adescamento del dispositivo Microfluidic SynVivo-SMN
- Ogni porta (ingresso / uscita) del dispositivo comprende due porte parallele - una per fluire in frazioni rivestimento superficiale (molecole di adesione, matrici di crescita, ecc) e / o cellule di semina e l'altro per eseguire il test (Figura 1A ).
- Immergere completamente il dispositivo microfluidica SynVivo-SMN (Figura 1B) in una capsula di Petri contenente deionizzata sterile (DI) e posizionare il piatto in un essiccatore a vuoto. Lasciare l'essiccatore di eseguire fino a quando tutta l'aria viene rimosso dai canali del dispositivo. Questo dovrebbe durare circa 15 min.
- Prima di rimuovere il dispositivo dal acqua, mettere il tubo Tygon (diametro di 0,06 "e ID di 0,02") innescato con acqua in ogni porta del dispositivo con una pinza a punta fine. Il tubo deve essere di circa 1 pollice. Il dispositivo può essere rimosso dall'acqua. Figura 1C mostra immagine della devicoE Con il tubo.
2. Rivestimento del dispositivo Microfluidic con la proteina desiderata (ad esempio, Avidin)
- Usando una pipetta, una goccia di acqua (circa 100 ml) intorno alla base del tubo una porta di ingresso. Rimuovere con cautela il tubo utilizzato per innescare il dispositivo. La goccia d'acqua impedisce all'aria di entrare dispositivo.
- Preparare una siringa da 1 ml caricato con avidina ad una concentrazione di 20 ug / ml. Collegare la siringa un ago in acciaio inossidabile 24 G e tubi. Inserire il tubo ad una delle porte di ingresso del dispositivo. Bloccare la porta di ingresso non essere utilizzato con un morsetto mascella.
- Iniettare avidina ad un flusso di 1 ml / min per 10 min per permettere la completa perfusione del dispositivo. Alla fine del tempo di flusso, bloccare il tubo con il morsetto mascella e posizionare il dispositivo a 4 ° C per una notte.
3. Scorrere la Particelle Biotinylated per gli esperimenti di adesione
- Lasciare il dispositivoa temperatura ambiente. Posizionare il dispositivo su un microscopio invertito a fluorescenza equipaggiato con un tavolino motorizzato e una telecamera ad alte prestazioni.
- Preparare una soluzione di 2 micron particelle biotinilati ad una concentrazione di 5 x 10 6 particelle / ml in tampone fosfato salino (PBS). Caricare le particelle in una siringa da 1 ml. Preparare una seconda siringa da 1 ml di PBS solo. Caricare ogni siringa su una pompa a siringa e connettersi ago e tubo.
- Usando una pipetta, una goccia di acqua (circa 100 ml) intorno alla base del tubo di entrata. Rimuovere con cautela il tubo utilizzato per rivestire il dispositivo. La goccia d'acqua impedisce all'aria di entrare dispositivo.
- Inserire con cautela il tubo di particelle biotinilati e PBS dal punto 3.2 in ciascuna delle porte di ingresso. Figura 2A mostra l'immagine del set-up.
- Inizia iniettando particelle biotinilati ad una portata di 2,5 ml / min. Monitorare la porta di ingresso sul microscopio. Al primo segnodi particelle, avviare il timer e continuare flusso per 3 min.
- Alla fine del 3 min, fermare il flusso di particelle biotinilati contemporaneamente fissando il flusso di PBS ad una portata di 2,5 ml / min. Lasciare PBS di fluire nel dispositivo per 3 minuti per lavare via le particelle non legate.
4. Acquisizione di immagini e Fare area di interesse (AOI) Misure Utilizzo del software di imaging (NIKON Elements)
- Utilizzare la funzione "immagine di scansione grande" nel software di imaging per acquisire l'immagine dell'intero dispositivo.
- Numero sequenziale le biforcazioni nel dispositivo e creare una AOI circolare con due volte il diametro dei canali. In questo caso, impostare il diametro AOI a 200 micron in quanto il diametro del canale è di 100 micron.
- Utilizzare la funzione di conteggio automatico del software di imaging per esportare il numero di particelle in ogni AOI ad un foglio di MS Excel.
- Analogamente, utilizzare la funzione di conteggio automatico di esportare il numero di particelle nell'interadispositivo.
5. Particelle Flux Analisi Uso Computational Fluid Dynamics (CFD) Modelli
- Simulazioni CFD vengono eseguiti utilizzando il software disponibile in commercio (CFD-ACE +, ESI Inc.) per la topologia dispositivo SynVivo-SMN. I risultati sono memorizzati in un database per analizzare osservazioni sperimentali. I risultati della simulazione memorizzare le informazioni sui tassi di parete di taglio, velocità, flusso di particelle, e l'adesione nel dispositivo.
- I risultati della simulazione vengono utilizzati per determinare il numero di particelle che entrano ogni AOI basato su una determinata concentrazione di particelle in ingresso.
6. Generazione Shear adesione Map
- Calcolo della% di aderenza dividendo le particelle attaccate nella biforcazione dalle particelle che fluiscono nella biforcazione come mostrato nell'equazione 6.1.
dove il numero di particelle e le particelle aderiscono scorre sono ottenuti da protocol i punti 4.3 e 5.2, rispettivamente. - Tracciare la mappa adesione shear utilizzando il gradiente di velocità ad ogni biforcazione delle reti ottenuti dal database nella fase (5.1) ed i valori di adesione% ottenuti dall'equazione 6.1.
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Representative Results
La figura 1A mostra una immagine schematica campo chiaro e di dispositivo SynVivo-SMN. Figura 1B mostra il dispositivo SynVivo-SMN montato su un vetrino. Figura 1C mostra il dispositivo con la tubazione seguente priming con acqua in un essiccatore sotto vuoto.
Figura 2A mostra un'immagine della sperimentale-impostato. Figura 2B mostra un tipico dispositivo SynVivo-SMN avidina rivestite conseguente al legame 2 micron particelle biotinilati. Si noti che le particelle aderiscono preferenzialmente in prossimità delle biforcazioni della rete.
La figura 3A mostra le biforcazioni numerati nella rete SynVivo-SMN. Figura 3B mostra muro campione mappa di taglio generate dal modello CFD del dispositivo. Il gradiente di velocità varia nel dispositivo da 250 sec-1 a 15 sec -1 come osservato nel microcircolo in vivo. Si noti che queste variabilishear rate non possono essere ottenuti simultaneamente in canali microfluidici lineari quanto forniscono una velocità di taglio costante per ciascuna portata. Figura 3C mostra un grafico dei valori del gradiente di velocità in ciascuna delle biforcazioni della rete. I dati mostrano che i modelli shear rate sono complessi e non possono essere ottenuti con una semplice relazione analitica differenza canali di flusso lineari. Inoltre, biforcazioni multiple (AOI) sono presenti nella rete che rientra nello stesso scomparto taglio, aggiungendo alla confidenza statistica dei dati.
Figura 4A mostra i risultati dei campioni di analisi CFD per flussi di particelle nella rete che vengono utilizzati per calcolare i flussi di particelle nei rami e biforcazioni della rete sperimentale. Figura 4B mostra la mappa adesione taglio calcolato dal singolo esperimento SynVivo-SMN. Il mappe shear adesione segue la relazione inversa osservata da taglio mappa adesione ottenuto dallaEsperimenti canali lineari. Tuttavia, in contrasto con un saggio SynVivo, un singolo esperimento permette la generazione di questo taglio mappa differenza multipli prove sperimentali richiesti dai canali lineari con conseguente notevole risparmio di tempo e risorse. Si noti che gli esperimenti vengono eseguiti in triplicato per l'analisi statistica massima.
Figura 1. Dispositivi SynVivo-SMN. Pannello sinistro (Figura 1A) mostra una schematica del dispositivo. Pannello di destra (Figura 1A) mostra immagine luminosa campo del dispositivo. Figura 1B mostra il dispositivo SynVivo-SMN montato su vetrino da microscopio. Figura 1C mostra il dispositivo con tubo Tygon ™ fissato alle porte di ingresso / uscita seguenti adescamento con acqua.
Figura 2. Saggi di adesione Tipica in SynVivo-SMN. Figura 2A mostra un'immagine della sperimentale-impostato. Figura 2B mostra particelle biotinilati conseguente al legame nel dispositivo. Si noti che l'adesione delle particelle è risultato essere localizzata vicino biforcazione rispetto ai rami della rete.
Figura 3. Analisi Shear in SynVivo-SMN. Figura 3A mostra tutte le biforcazioni numerati in rete e una vista ingrandita di biforcazioni dagli esperimenti. Figura 3B mostra la qualitativa tangenziale alla parete cartina in biforcazioni della rete. Figura3C mostra le informazioni quantitative sul taglio dei rami della rete. Si noti che i modelli di taglio nella rete sono complesse e coprono gli intervalli fisiologici dei tassi di taglio (0-240 sec -1) in vivo.
Figura 4. Generazione di taglio mappa adesione. Figura 4A evidenzia le traiettorie delle particelle (in bianco) nelle reti ottenuti dalla simulazione CFD. Queste traiettorie sono post-elaborati per ottenere flussi di particelle nei diversi rami e biforcazioni. Figura 4B mostra la mappa di adesione al taglio ottenuto da un singolo esperimento SynVivo-SMN.
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Discussion
Camere di flusso piastra paralleli, fornendo spunti significativi in interazioni cellula-cellula e cellula-particelle, soffrono di alcune limitazioni quali elevato consumo di reagenti e la necessità di molteplici prove sperimentali di generare una mappa adesione taglio. L'uso delle reti microvascolari SynVivo-sintetiche (SynVivo-SMNs) consente la generazione di una mappa di adesione al taglio da un singolo esperimento in condizioni che mimano le condizioni in vivo. Inoltre, si ottiene anche un risparmio significativo (> 95%) in reagenti.
Il passo più importante nella gestione di esperimenti di adesione di particelle con SynVivo-SMN è quello di garantire condizioni di libero bolla nel chip prima della sperimentazione. Introduzione di bolle porterebbe a fluire instabilità e la mancanza di accesso a "aria bloccata" regioni del chip. Quindi, grande cura deve essere presa durante inserimenti ed estrazioni dei tubi dai porti del dispositivo. In caso di una bolla trovato the dispositivo durante la fase di adescamento, si può ripetere la fase di caricamento, per rimuovere le bolle. In alternativa, si può scorrere in media / reagenti a basso portate (0,1 ml / min o meno) per assicurare la bolla libera priming del dispositivo.
La limitazione principale del protocollo è il chip essere resa inutilizzabile in seguito alla presenza di una bolla che non può essere rimosso. Tuttavia, con un'attenta pratica si possono effettuare esperimenti con i vicini di successo del 100%. Inoltre, la generazione di cesoie mappa adesione richiede informazioni da modelli CFD. Tuttavia, un database pre-calcolate dei risultati CFD per condizioni di flusso differenti in grado di superare facilmente la necessità di eseguire le simulazioni CFD.
Sebbene, la metodologia presentata qui utilizzato il sistema avidina-biotina per facilità di dimostrazione, qualsiasi combinazione ligando-recettore sulle particelle o cellule può essere usato per essere studio particella superficie o interazioni cellula-superficie in tempo reale nel dispositivo. Inoltre, le cellule possono essere cultured nel dispositivo per studiare le interazioni particella-cellula e cellula-cellula. Coltura di cellule richiederà rivestimento dei canali del dispositivo con matrice adatta per tipi cellulari desiderati. Per esempio, le cellule endoteliali possono essere coltivate su canali fibronectina rivestite. Seguendo confluenza, le cellule endoteliali possono essere attivati utilizzando TNF-α o altre citochine pertinenti. Globuli bianchi (WBC) possono essere iniettati e le loro interazioni sulle cellule endoteliali attivate possono essere studiate in tempo reale. Simile al protocollo dimostrato in questo studio, una mappa taglio adesione delle cellule bianche del sangue possono essere facilmente generati da un singolo esperimento.
Il protocollo menzionato nel presente documento può essere usato per studiare l'effetto della morfologia rete su adesione delle particelle / cellula come modello di condizioni in vivo. Inoltre, l'effetto del flusso sull'adesione particelle / cellula e comportamento cellulare per modellare condizioni fisiologiche può anche essere prontamente valutata. Infine, il protocollo può essere noied a studiare la consegna della droga e l'efficacia per la somministrazione mirata di popolazioni cellulari desiderati.
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Disclosures
Tassa di pubblicazione per questo articolo sponsorizzato da CFD Research Corporation.
Acknowledgments
La tecnologia SynVivo è stato sviluppato sotto concessione # 2R44HL076034 dal NHLBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
References
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