Summary
هنا، ونحن نصف الفحص phenotypic ينطبق على شاشات عالية الإنتاجية / عالية المحتوى من الحمض النووي الريبي الاصطناعية التدخل الصغيرة (siRNA)، مركب كيميائي، والمكتبات متحولة السل الميكوباكتيريوم. تعتمد هذه الطريقة على الكشف عن السل الفطري المسمى بالفلورسنت داخل الخلية المضيفة المسماة بالفلورسنت باستخدام المجهر الكونفوكوكال الآلي.
Abstract
على الرغم من توافر العلاج واللقاح، لا يزال السل واحدا من أكثر الأمراض البكتيرية فتكا وانتشارا في العالم. منذ عدة عقود، يشكل الانفجار المفاجئ للسلالات المقاومة للأدوية المتعددة والواسعة النطاق تهديدا خطيرا لمكافحة السل. لذلك، من الضروري تحديد أهداف ومسارات جديدة حاسمة للعامل المسبب لمرض السل، والسل الميكوباكتريا (Mtb) والبحث عن مواد كيميائية جديدة يمكن أن تصبح أدوية السل. ويتمثل أحد النهج في وضع أساليب مناسبة للشاشات الجينية والكيميائية للمكتبات الكبيرة الحجم التي تمكن من البحث عن إبرة في كومة قش. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير فحص فينوتوبيكال يعتمد على الكشف عن Mtb المسمى فلوريا داخل الخلايا المضيفة المسماة بالفلورسنت باستخدام المجهر الكونفوجال الآلي. يسمح هذا الفحص المختبري بتقدير كمي قائم على الصورة لعملية استعمار Mtb في المضيف وتم تحسينه لتنسيق 384 microplate جيدا ، وهو مناسب لشاشات مكتبات المتحولة ذات المركبات الكيميائية أو Mtb. ثم تتم معالجة الصور للتحليل متعدد البارامترات ، والذي يوفر قراءة الاستدلال على الإمراض من Mtb داخل الخلايا المضيفة.
Introduction
من بين مسببات الأمراض المعدية الناشئة والناشئة التي تم الإبلاغ عنها خلال السنوات الماضية ، يحتل مرض السل الفطري(Mtb)مكانا بارزا كونه مسؤولا عن 1.4 مليون حالة وفاة و 8.7 مليون إصابة جديدة في عام 2011 (تقرير السل العالمي 2012 ، www.who.int/topics/tuberculosis/en/). على الرغم من توافر العلاجات متعددة الأدوية ، فإن عدد المصابين لا يزال في ارتفاع ومقاومة الأدوية المتعددة (MDR) وكذلك مقاومة للأدوية على نطاق واسع (XDR) Mtb تنتشر بسرعة في جميع أنحاء العالم1. وعلاوة على ذلك، عند الأخذ في الاعتبار وجود مستضدات Mtb، فمن الواضح أن ثلث سكان العالم يعتبرون مصابين بشكل كامن من قبل Mtb. إحصائيا، في حالة واحدة من أصل عشرة، هناك تطور نحو الشكل النشط للمرض مع الأعراض السريرية اللاحقة2. لذلك، هناك حاجة ماسة إلى وسائل جديدة لمحاربة Mtb. في هذا السياق، قمنا بتطوير اختبار في المختبر الظاهري الظاهري تعتمد على رصد غزو Mtb والضرب في الخلايا المضيفة عن طريق المجهر الفلوري confocal الآلي3. التكيف من المقايسة في لوحات microtiter 384 جيدا في تركيبة مع اقتناء الصور الآلي وتحليلها ، وسمح عالية المحتوى / عالية الإنتاجية فحص (HC / HTS) من المكتبات متوسطة النطاق من المركبات ، siRNAs والمسوخ البكتيرية. وهكذا مكن فحص مكتبة RNAi واسعة الجينوم على هذا الفحص الظاهري من تحديد العوامل المضيفة الرئيسية المشاركة في الاتجار Mtb والنسخ المتماثل داخل الخلايا ولكن أيضا توضيح مسارات المضيف التي تستغلها عصيات الدرنة. وكان التكيف آخر من هذا الفحص phenotypic خاصة لتحديد العوامل البكتيرية الأساسية لاستمرار Mtb داخل البلعوم. على سبيل المثال ، يعتبر اعتقال النضج البلعوم واحدة من الآليات الرئيسية التي تسهل بقاء وتكرار Mtb في الضامة. رصد توطين subcellular من المسوخ Mtb خروج المغلوب في مقصورات الفلورسنت المسمى الحمضية يسمح لتحديد الجينات البكتيرية المشاركة في عملية البقاء على قيد الحياة4. وأخيرا ، فإن التصوير عالي المحتوى من Mtb يقدم أيضا طريقة ممتازة لقياس كفاءة الدواء لتثبيط الظواهر المختلفة مثل النمو البكتيري داخل الخلايا3. بالإجمال، هذا النوع من الفحص الظاهري عالي الإنتاجية يسمح بتسريع اكتشاف الأدوية ضد السل والبيانات التي تجمعها هذه النهج المختلفة تساهم في فهم أفضل للتلاعب المضيف الذي تمارسه Mtb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عالية الإنتاجية الجينوم على نطاق فحص سيرنا
الفحص الذي تم إجراؤه في نموذج خلايا الالتهاب الرئوي من النوع الثاني البشري A549 عند العدوى مع Mtb H37Rv مع التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). ويرد هذا الإجراء في الشكل 1A.
- Resuspend مكتبة siRNA المجففة التي يتم تخزينها في لوحات الأم (لوحات 96 بئر) مع العازلة 1x siRNA للوصول إلى تركيز 4 ميكرومتر، ثم نقل 10 ميكروغرام من الخليط إلى لوحة ابنة 384 جيدا (لوحة ابنة 1).
- إضافة 10 ميكرولتر من العازلة 1x siRNA في لوحة ابنة 1 لتخفيف siRNA من قبل 2 أضعاف. بعد إعادة ضغط siRNA ، يتم إغلاق اللوحات بختم الألومنيوم القابل للقشر ويمكن تخزينها عند -20 درجة مئوية على الأقل 6 أشهر وما يصل إلى 2-3 سنوات ، ولكن قد يختلف وقت التخزين اعتمادا على توصيات الشركة المصنعة لمكتبة siRNA.
- تمييع siRNAs في لوحة ابنة 1 في لوحة ابنة 2 للوصول إلى تركيز 500 nM. بعد إعادة ضغط siRNA ، يتم إغلاق اللوحات بختم الألومنيوم القابل للقشر ويمكن تخزينها عند -20 درجة مئوية على الأقل 6 أشهر وما يصل إلى 2-3 سنوات ، ولكن قد يختلف وقت التخزين اعتمادا على توصيات الشركة المصنعة لمكتبة siRNA.
- قبل الاستخدام، إذابة لوحة ابنة 2 في درجة حرارة الغرفة.
- خذ 2.5 ميكرولتر من siRNA من لوحة الابنة 2 ووضعها في لوحة فحص 384 جيدا.
- في نفس لوحة 384-well المقايسة في الخطوة 1.5، إضافة 2.5 ميكرولتر السلبية والإيجابية siRNA التحكم إلى الآبار الخاصة بهم.
- تمييع كاشف العدوى في 1x D-PBS لتحقيق حل كاف لتوفير كاشف 0.1 ميكرولتر من العدوى في كل بئر وبادئة محلول العدوى المخفف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 7.5 ميكرولتر من خليط محلول كاشف/ PBS transfection لكل بئر في لوحة المقايسة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 40 ميكرولتر من خلايا A549 (1500 خلية / بئر) معلقة في RPMI 1640 المتوسطة تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS). الحفاظ على الخلايا لمدة 3 أيام حضانة عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2. تنقسم هذه الخلايا كل 24 ساعة، وبالتالي فإن حوالي 12,000 خلية موجودة في الآبار بعد ثلاثة أيام من العدوى.
- غسل ثقافة MTB H37Rv التي تعبر عن MTB H37Rv لمدة أسبوعين مع D-PBS (خالية من MgCl2 و CaCl2)عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × غرام لمدة 5 دقائق والتخلص من الغسالات. كرر هذه الخطوة 3x. (بالنسبة للظروف الثقافيةGFP-Mtb H37Rv انظر البروتوكول 3).
- تعليق بيليه البكتيرية في 10 مل من RPMI 1640 المتوسطة تكمل مع 10٪ FBS وdecant لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح المجاميع البكتيرية إلى الرواسب.
- جمع الناسخ البكتيري وقياس OD600 (OD600 ينبغي أن يكون بين 0.6-0.8) وGFP-مضان (قيمة RFU) باستخدام قارئ لوحة صغيرة لتحديد التركيز البكتيري. حساب titer التعليق باستخدام خط انحدار مرجع عرض قيمة RFU = f (قيمة CFU) التي تم إنشاؤها قبل التجربة على ثقافة أخرى التي تم إعدادها في نفس الشروط. إعداد تعليق بكتيري يحتوي على 2.4 × 106 بكتيريا / مل ، وهو ما يتوافق مع تعدد العدوى (MOI) من 5.
- إزالة المتوسطة في لوحة 384-well المقايسة وإضافة 25 ميكرولتر من تعليق البكتيرية الطازجة.
- احتضان لوحة 384-well المقايسة في 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات في جو يحتوي على 5٪ CO2.
- إزالة المتوسطة وغسل الخلايا بلطف مع المتوسطة RPMI تستكمل مع 10٪ FBS 3x.
- لقتل البكتيريا خارج الخلية المتبقية، علاج الخلايا مع 50 ميكروغرام من الطازجة RPMI-FBS المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل من أميكاسين في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في جو يحتوي على 5٪ CO2.
- إزالة أميكاسين متوسطة تحتوي وإضافة 50 ميكرولتر من RPMI المتوسطة الطازجة تكملها مع 10٪ FBS. احتضان لوحة 384-well assay عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام في جو يحتوي على 5٪ CO2.
- قبل الحصول على الصورة، أضف 10 ميكرولتر من 30 ميكروغرام/مل من DAPI في PBS (التركيز النهائي 5 ميكروغرام/مل) واحتضن لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- تحميل لوحة في المجهر confocal الآلي.
انقر هنا لعرض صورة أكبر. - تعيين معلمات التعرض. سجل DAPI مضان باستخدام ليزر الإثارة 405 نانومتر مع مرشح الانبعاثات 450 نانومتر وفلورسينس GFP باستخدام ليزر الإثارة 488 نانومتر مع مرشح الانبعاثات 520 نانومتر.
انقر هنا لعرض صورة أكبر.
انقر هنا لعرض صورة أكبر. - حدد الآبار والحقول في كل بئر يتم الحصول عليها، والتي يشار إليها بعد ذلك باسم معلمات التخطيط والتبليط الفرعي.
انقر هنا لعرض صورة أكبر.
انقر هنا لعرض صورة أكبر. - إنشاء ملف التجربة باستخدام المعلمات من الخطوتين 1.20 و 1.21 وتشغيل الاستحواذ التلقائي.
انقر هنا لعرض صورة أكبر.
انقر هنا لعرض صورة أكبر. - نقل الصور إلى ملقم بعيد.
انقر هنا لعرض صورة أكبر. - تقييم الصور باستخدام برامج تحليل الصور. الكشف عن نواة الخلية من قناة DAPI باستخدام خوارزمية الكشف عن النوى والمنطقة البكتيرية من قناة GFP باستخدام خوارزمية خصائص كثافة بكسل(الشكل 4A).
ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لدراسة تأثير إسكات الجينات على نمو Mtb داخل الخلايا. Mtb هي بكتيريا بطيئة النمو تنقسم كل 20 ساعة في الظروف المثلى. بعد 5 أيام بعد الإصابة ، لا تزال كمية Mtb خارج الخلية منخفضة في غياب تحلل الخلية ولم تؤثر على جودة التحليل. يجب تحسين هذا البروتوكول من حيث طول مدة العلاج بالمضادات الحيوية ووقت الحضانة ليتم تكييفها لشاشات سيرنا باستخدام البكتيريا سريعة النمو مثل Mycobacteria smegmatis وEscherichia coli التي يتم إطلاقها على نطاق واسع ويمكن أن تصيب خلايا جديدة.
2. عالية الإنتاجية فحص المركب
الفحص الذي تم إجراؤه على الخلايا المضيفة المصابة Mtb H37Rv. ويرد هذا الإجراء في الشكل 1B.
- إذابة اللوحات الأم 384 جيدا التي تحتوي على مكتبة مركب solubilized في DMSO 100٪. نقل 0.5 ميكرولتر من المركبات في 384 جيدا ابنة لوحات تحتوي على 10 ميكرولتر من RPMI 1640 المتوسطة تكملها مع 10٪ FBS.
- غسل ثقافة MTB H37Rv التي تعبر عن MTB H37Rv لمدة أسبوعين مع D-PBS (خالية من MgCl2 و CaCl2)عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × غرام لمدة 5 دقائق والتخلص من الغسالات. كرر هذه الخطوة 3x (بالنسبة للظروف الثقافيةGFP-Mtb H37Rv راجع البروتوكول 3).
- تعليق بيليه البكتيرية في 10 مل من RPMI 1640 المتوسطة تكمل مع 10٪ FBS وdecant لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح المجاميع البكتيرية إلى الرواسب.
- جمع الناسخ البكتيري وقياس OD600 (OD600 ينبغي أن يكون بين 0.6-0.8) وGFP-فلوريسين (قيمة RFU) باستخدام قارئ microplate. حساب titer التعليق باستخدام خط انحدار مرجع عرض قيمة RFU = f (قيمة CFU) التي تم إنشاؤها قبل التجربة. التركيز النموذجي هو 1 × 108 البكتيريا / مل.
- حصاد 6 أيام الضامة البشرية الأولية القديمة في 4 × 105 خلايا / مل في RPMI 1640 المتوسطة تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 50 نانوغرام / مل الإنسان المؤتلف M-CSF (لخلايا الدم الأحادي المحيطية الإنسان تنقية والتمايز الضامة انظر البروتوكول 4).
- احتضان الخلايا الأولية المخففة مع العصيات في وزارة الداخلية المختلفة، تتراوح بين 1-5، في تعليق مع اهتزاز خفيف في 90 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
- غسل الخلايا المصابة عن طريق الطرد المركزي في 350 × ز لإزالة البكتيريا خارج الخلية. بعد كل خطوة الطرد المركزي، إعادة إنفاق بيليه في RPMI 1640 المتوسطة تكملها مع 10٪ FBS. كرر هذه الخطوة 2x.
- تعليق الخلايا المصابة في RPMI 1640 المتوسطة تكملها 10٪ FBS والاميكاسين في 50 ميكروغرام / مل واحتضان تعليق مع اهتزاز خفيف لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
- إزالة الخلايا والثقافة المتوسطة التي تحتوي على أميكاسين عن طريق الطرد المركزي في 350 x ز وغسل الخلايا المصابة مع كامل RPMI 1640 المتوسطة تكملها 10٪ FBS و 50 نانوغرام / مل الإنسان المؤتلف M-CSF. كرر مرة واحدة.
- إضافة 40 ميكرولتر من تعليق الضامة المصابة في نفس لوحة المقايسة في الخطوة 2.1، والذي يحتوي بالفعل على 10 ميكروغرام من التخفيفات المركبة. وقد وصل التركيز النهائي ل DMSO في كل بئر الآن إلى 1٪.
- احتضان لوحات المقايسة لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2.
- وصمة عار الخلايا الحية مع صبغة الفلورسنت الفلورسنت خلية permeant أحمر بعيد.
- تحميل لوحة في المجهر confocal الآلي.
انقر هنا لعرض صورة أكبر. - تعيين معلمات التعرض. سجل مضان أحمر بعيد باستخدام ليزر الإثارة 640 نانومتر مع فلتر الانبعاثات 690 نانومتر وفلورسينس GFP باستخدام ليزر الإثارة 488 نانومتر مع فلتر الانبعاثات 520 نانومتر.
انقر هنا لعرض صورة أكبر.
انقر هنا لعرض صورة أكبر. - حدد الآبار والحقول في كل بئر يتم الحصول عليها، والتي يشار إليها بعد ذلك باسم معلمات التخطيط والتبليط الفرعي.
انقر هنا لعرض صورة أكبر.
انقر هنا لعرض صورة أكبر. - إنشاء ملف التجربة باستخدام المعلمات من الخطوتين 2.14 و 2.15 وتشغيل اقتناء التلقائي.
انقر هنا لعرض صورة أكبر.
انقر هنا لعرض صورة أكبر. - نقل الصور إلى ملقم بعيد.
انقر هنا لعرض صورة أكبر. - تقييم الصور باستخدام برامج تحليل الصور. الكشف عن منطقة الخلية من قناة حمراء بعيدة باستخدام خوارزمية خصائص كثافة بكسل والمنطقة البكتيرية من قناة GFP باستخدام خوارزمية خصائص كثافة بكسل(الشكل 4B).
ملاحظة: يمكن تكييف هذا البروتوكول لفحص مكتبة Mtb متحولة عن طريق استبدال المركبات من قبل المسوخ التعبير عن بروتين الفلورسنت (واحد جيدا / واحد متحولة) (الشكل 1C, انظر أيضا برودين وآخرون. 4). يتم أولا المصنف المسوخ الفلورسنت في الآبار (20 ميكرولتر من تعليق البكتيرية لكل بئر). ثم يتم استرداد البكتيريا من قبل 30 ميكروغرام من تعليق الخلية. بعد الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 1 دقيقة، يتم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2. وقت الحضانة و MOI تعتمد على المقايسة. على سبيل المثال ، لتصور الأحداث الخلوية المبكرة مثل تحمض الفسغوسوم ، يمكن إصابة الخلايا لمدة ساعتين مع MOI تتراوح بين 1-20. الليسوسومات ملطخة باستخدام صبغة Lysotracker عند 2 ميكرومتر لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 ثم يتم تثبيتها إما مع 10٪ الفورمالين أو 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). يتم الحصول على الصور Confocal وتحليلها أخيرا باستخدام برامج نصية لتحليل الصور تتميز خوارزميات مناسبة للكشف عن الليسوسومات وتوطين دونالخلوية 4.
3. بروتين الفلورسنت الأخضر التعبير عن الظروف الثقافية للسل البكتريا H37Rv (GFP-H37Rv)
للتخزين على المدى الطويل، تم تجميد GFP-H37Rv في برنامج تلفزيوني D (حوالي 1 × 108 البكتيريا الفطرية لكل قارورة).
- Resuspend قارورة واحدة من المخزون المجمد من GFP-H37Rv في قارورة إرلينماير تحتوي على 50 مل من 7H9 مرق المتوسطة تكملها ميدلبروك الزراعة العضوية إثراء 10٪، غليسيرول 0.5٪، توين-80 0.05٪، وهيغروميسين B (50 ميكروغرام /مل).
- حضانة 8 أيام عند 37 درجة مئوية.
- قياس OD600 من الثقافة GFP-H37Rv.
- تمييع الثقافة GFP-H37Rv للحصول على OD600 = 0.1 في مرق 7H9 الطازجة المتوسطة تكملها ميدلبروك الزراعة العضوية إثراء 10٪، غليسيرول 0.5٪، توين-80 0.05٪ وهيغروميسين B (50 ميكروغرام / مل).
- احتضان GFP-H37Rv في 37 درجة مئوية لمدة 8 أيام أخرى قبل استخدامها للمقايسة.
4. الإنسان الطرفية خلايا الدم الأحادي تنقية من الدم كله أو بافي معطف إعداد
- تمييع الحقيبة الدم 2x في 1X D-PBS (خالية من MgCl2 وCaCl2)تحتوي على 1٪ FBS.
- عزل monocytes بواسطة فيكول كثافة التدرج الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 20 دقيقة.
- جمع monocytes معزولة.
- غسل monocytes 3x مع 1x D-PBS (خالية من MgCl2 وCaCl2)التي تحتوي على 1٪ FBS عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تركيز الخلايا تصل إلى 1 × 107 خلية / مل.
- تنقية الخلايا الأحادية باستخدام الخرز المضغوط 14 المغناطيسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر المواد).
- بعد تنقية CD14-monocytes، البذور الخلايا في 1.5 × 106 الخلية / مل في RPMI 1640 تكملها مع 10٪ FBS و 40 نانوغرام / مل من الإنسان الضامة مستعمرة عامل تحفيز (hM-CSF) واحتضان لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2.
- بعد 4 أيام استبدال المتوسطة مع RPMI 1640 الطازجة تكملها 10٪ FBS و 40 نانوغرام / مل من hM-CSF واحتضان لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2.
- بعد 6 أيام، يمكن استخدام الخلايا للمقاهية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فحص سيرنا عالي الإنتاجية على نطاق الجينوم
Mtb قادرة على استعمار الخلايا المناعية في المختبر، فضلا عن العديد من الخلايا الظهارية الرئة الأخرى. على سبيل المثال، Mtbقادرة على إصابة وتلف الخلايا الظهارية A549 التي تستخدم عادة كنموذج للخلايا الرئوية من النوع الثاني البشري5-7. تم الإبلاغ عن Dectin-1 كم مستقبلات الخلايا المضيفة المشاركة في امتصاص Mtb ، والاستجابة proinflammatory وتأثير مضاد للبكتيريا على النمو العضلي العضلي داخل الخلية في خلايا A5498. أدت حالة siRNA الموصوفة في البروتوكول 1 إلى 85٪ من كفاءة إسكات (البيانات غير مبينة). إسكات التعبير Dectin-1 مع سيرنا أدى إلى انخفاض كمية البكتيريا الفطرية داخل الخلايا في خلايا A549. في الواقع، بعد 3 أيام من إسكات و 5 أيام من العدوى، يتم تقليل النسبة المئوية للخلايا المصابة مرتين في خلايا ديكتين-1 إسكات A549 مقارنة مع الخلايا المصابة مع التدافع غير المستهدف siRNA (الشكلين 2A و 2B). طبقنا تطبيع عينة على أساس siRNA المستهدفة Dectin-1 بالمقارنة مع التدافع لتحديد Z-score. كما هو مبين في الشكل 2C، حصلنا على متوسط نقاط Z حول -15 ل siRNA المستهدف Dectin-1. Dectin-1 يمكن استخدامها كتحكم إيجابي لشاشة siRNA لاكتشاف عامل مضيف الرواية الأخرى المشاركة في الاستعمار Mtb في pneumocytes التي يمكن أن يكون لها نفس النمط الظاهري كما هو الحال مع siRNA ديكتين. استخدام سيرنا تؤثر على النمط الظاهري كعنصر تحكم على كل لوحة صغيرة أثناء الشاشة يسمح تطبيع كل لوحة، وهو أمر مفيد عندما يريد المرء أن يؤدي تحليل شاشة الجينوم كله. وكانت المعلمة الإحصائية Z '0.1 باستخدام التطبيع القائم على التحكم على التدافع وsiRNA استهدفت Dectin1، وهي قيمة مقبولة للتحقق من صحة بيانات الفحص siRNA.
فحص مركب عالي المحتوى
يتم تقييم الكفاءة المركبة على نمو البكتيريا داخل الخلايا من خلال إنشاء منحنى استجابة الجرعة (DRC) وتطبيعها إلى مركبات إيجابية مرجعية وضوابط المذيبات المركبة السلبية. ممثل جمهورية الكونغو الديمقراطية من مركبين مرجعيين، isoniazid (INH) وrifampicin (RIF)، نشطة ضد نمو MTB تظهر في الشكل 3. يتم الحصول على هذه المنحنيات في الضامة الأولية البشرية المصابة بسلالة MTB H37Rv المعبرة عن GFP ، مع قراءات بعد 5 أيام بعد العدوى. وعادة ما تستخدم DMSO و INH بتركيز نهائي بنسبة 1٪ و0.1 ميكروغرام/مل على التوالي كضوابط سلبية وإيجابية، مما يوفر مستويات أساسية من الكفاءة (0 و100٪) (الشكل 3A). بعد عملية تحليل الصور المفصلة في الشكل 4B، يتم استخراج البيانات متعددة البارامترية من صور الفلورية الكونفوكوكال لل الضامة البشرية المصابة التي التقطها المجهر الكونفوكوكال الآلي. أدت المركبات النشطة التي تؤثر على النسخ المتماثل داخل الخلايا ل Mtb في الخلايا المضيفة إلى انخفاض الحمل البكتيري العضلي ، والذي يتوافق مع مساحة إشارة GFP في الخلايا على الصور(الشكل 3B). يتم رسم النسبة بين المنطقة البكتيرية داخل الخلايا ومنطقة الخلية الكلية ، محسوبة باستخدام برنامج التحليل القائم على الصورة ، في وظيفة تركيز المركب ، الذي يولد جمهورية الكونغو الديمقراطية(الشكل 3B). تسمح هذه المنحنيات بتحديد كل من التركيز المطلوب لتقليل الحمل البكتيري بنسبة 50٪ (IC50)والتركيز الأدنى المطلوب لمنع 99٪ من النسخ المتماثل البكتيري (MIC99) (الشكل 3C). Z' استنادا إلى DMSO التحكم 1٪ والتحكم INH 0.1 ميكروغرام/مل كان 0.49. هذا Z'، قريبة حقا من 0.5، هو مقبول للتحقق من صحة هذا المقايسة.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 نهج فحص المحتوى العالي المرئي. التمثيل التخطيطي لنظام نموذج العدوى MTB المستخدمة لشاشات siRNA (A) والمركبات الكيميائية (B) و Mtb المسوخ (C). (أ) شاشة مكتبة سيرنا: تم تحويل الخلايا مع سيرنا لمدة 3 أيام في لوحات 384-جيدا باستخدام طريقة العدوى العكسية. أصيبت الخلايا المتحولة سيرنا مع GFP-Mtb واحتضان لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية في الغلاف الجوي الذي يحتوي على 5٪ CO2. ثم لطخت الخلايا وتم جمع الصور باستخدام المجهر الكونفوجال الآلي. (ب) شاشة مكتبة المركبات: تم توزيع المركبات في لوحات 384 بئرا. تم احتضان تعليق الخلايا وGFP-Mtb معا لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. تم زرع الخلايا المصابة في الصفائح واحتضانها لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. ثم لطخت الخلايا وتم جمع الصور باستخدام المجهر الكونفوجال الآلي. (ج) مكتبة فلورية -Mtb متحولة: تم بذر المسوخ Mtb الفلورسنت في لوحات 384 بئرا وتم توزيع تعليق الخلية المضيفة. اختلف وقت الحضانة اعتمادا على المقايسة. كانت الخلايا أو الحويصلات الخلوية ملطخة قبل الحصول الآلي على الصورة. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم Dectin-1 إسكات الآثار على الاستعمار Mtb في خلايا A549. (أ) صور كونفوجال ممثل (عدسة الهواء 10X) من الخلايا A549 المصابة مع غير المستهدفة siRNA (التدافع) أو مع سيرنا محددة لDetin-1 والمصابين GFP-MTB H37Rv (MOI5) لمدة 5 أيام. يمثل شريط المقياس 200 ميكرومتر (A) GFP-Mtb H37Rv تم تصوره باللون الأخضر والخلايا باللون الأحمر. تم تحديد عدد الخلايا(A. الكشف عن الخلايا) وتحميل GFP-Mtb H37Rv داخل الخلية(A. Bacterial area) باستخدام برنامج تحليل قائم على الصور. (ب) تمثيل بياني للنسبة المئوية للخلايا A549 المصابة في 5 تكرارات (w1 إلى w5) من التدافع siRNA (الدوائر الزرقاء) وDetin-1 siRNA (دوائر حمراء). (ج) تمثيل الرسم من متوسط درجة Z من التدافع siRNA و Dectin-1 siRNA. (*** قيمة p < 0.0001). انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن منحنى استجابة الجرعة من المركبات المرجعية النشطة ضد Mtb في الضامة البشرية. (A و B) صور كونفوجكال تمثيلية (عدسة مياه 20X) من الضامة البشرية (أحمر، خلية تحمل صبغة فلورية حمراء) مصابة ب GFP-Mtb H37Rv (أخضر) مع MOI1 لمدة 5 أيام. يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر. (أ) صور الخلايا المصابة المحتضنة مع DMSO 1٪ تستخدم كسيطرة سلبية في المقايسة. (ب) صور الخلايا المصابة المحتضنة بتركيز متزايد من مركبين مرجعيين إيسونازيد (INH) والريفامبيسين (RIF). (ج) منحنيات الجرعة والاستجابة (جمهورية الكونغو الديمقراطية) من INH وRIF. وسمح التحليل القائم على الصور بتحديد جمهورية الكونغو الديمقراطية لكل مركب تم اختباره. تمثل جمهورية الكونغو الديمقراطية النسبة بين المنطقة البكتيرية GFP داخل الخلية ومنطقة الخلية الإجمالية (محور Y)، في وظيفة تركيز المركب (مقياس السجل، المحور س). في كل رسم بياني، تم تطبيع جمهورية الكونغو الديمقراطية من مركب إلى أن من السيطرة السلبية DMSO 1٪ (0٪ تثبيط) والسيطرة الإيجابية INH بتركيز 0.1 ميكروغرام / مل (100٪ تثبيط). لكل مركب، تم حساب التركيز المطلوب لمنع 50٪ من الاستعمار البكتيري (IC50)والتركيز المثبط الأدنى (MIC99)من جمهورية الكونغو الديمقراطية. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال تحليل قياسي قائم على الصورة لتحديد البكتيريا الفطرية الفلورية داخل الخلايا. تم الحصول على صور من لوحات 384 بئرا باستخدام مجهر كونفوج آلي. في هذه الحالة، تم تسجيل 4 صور مختلفة لنفس البئر (الحقول). ثم تم تحليل كل حقل باستخدام برنامج التحليل القائم على الصورة أكابيلا 2.6 (بيركين إلمر). (أ)كل حقل يحتوي على قناتين (لونين)، واحدة للبكتيريا (الأخضر) وواحدة لنوى الخلية (القناة الزرقاء)، التي تم تقسيمها باستخدام الخوارزمية التالية: i) الكشف عن النوى باستخدام إجراء أكابيلا المدمج، ii)الكشف السيتوبلازم، استنادا إلى السكان النوى، وذلك باستخدام المدمج في إجراء أكابيلا، 3) الكشف عن البكتيريا عن طريق الحفاظ على بكسل فقط التي كثافة أعلى من عتبة محددة يدويا، رابعا) دمج موقف الخلايا مع موقف البكتيريا لتحديد الخلايا المصابة. النتائج النهائية، التي أعرب عنها كمتوسط للحقول الأربعة، هي المساحة البكتيرية الإجمالية، والعدد الإجمالي للخلية، والنسبة المئوية للخلايا المصابة والمنطقة البكتيرية لكل خلية (متوسط جميع الخلايا المصابة). (ب)كل حقل يحتوي على قناتين، واحدة للبكتيريا (القناة الخضراء) وواحدة لنوى الخلية والسيتوبلازم (قناة حمراء بعيدة)، التي تم تقسيمها باستخدام الخوارزمية التالية: i)تصفية القناة الأصلية باستخدام مرشح مضاد للوسيط، ii)الحفاظ على بكسل فقط التي كثافة أعلى من عتبة محددة يدويا (كل قناة لها عتبة خاصة بها)، 3)عد العدد المتبقي من بكسل لكل قناة، رابعا) دمج القنوات وحساب عدد بكسل المشتركة من قبل كل من البكتيريا والنوى لتحديد البكتيريا داخل الخلايا. النتائج النهائية، التي أعرب عنها كمتوسط للحقول الأربعة، هي المساحة البكتيرية الإجمالية، والمنطقة الخلوية الإجمالية، والمساحة الإجمالية للبكتيريا داخل الخلايا والنسبة بين المنطقة البكتيرية داخل الخلايا والمنطقة الإجمالية للخلايا. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن نصف هنا الطرق المطلوبة لإجراء فحص فينوتبيك باستخدام سلالة MTB H37Rv المعبرة عن GFP لإصابة الخلايا المضيفة المسماة بالفلورسنت ، مما يجعلها مناسبة للشاشات عالية المحتوى / عالية الإنتاجية. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على مجموعة واسعة من المركبات، والتحقيقات الفلورية والمسوخ Mtb. لكل بروتوكول موضح أعلاه، يمكن تنفيذ خطوات التثبيت ووضع ال تسميتها المناعية قبل الحصول على الصورة. نحن نستخدم المجهر الفلورسنت المؤتمتة مجهزة عدسة المياه 20X (NA 0.70) أو 60X (NA 1.2) للحصول على الصور. تم تجهيز المجهر confocal مع 405، 488، 561، و 640 نانومتر ليزر الإثارة. يتم التقاط الفلورسينس المنبعث باستخدام 3 كاميرات مرتبطة بمجموعة من المرشحات التي تغطي طول موجة كشف يتراوح بين 450-690 نانومتر. من المهم ملاحظة أن ضبط إعدادات الإثارة والانبعاثات بالمجهر يعتمد على نوع الأصباغ أو الفلوروشروم المستخدمة في كل تجربة. بالنسبة للمقاايسات الظاهرية ، تستخدم DAPI أو Hoechst عادة عند 5 ميكروغرام / مل لمدة 10 دقائق لتلطخ النوى. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تكون ملطخة الخلايا مع الأصباغ الفلورية المختلفة محددة للكشف عن السيتوبلازم، غشاء أو الهيكل الخلوي. بعد الحصول على الصورة، يجب تحليل الصور باستخدام برنامج تحليل قائم على الصور. وينبغي استخدام خوارزميات تجزئة الخلايا على أساس كثافة كل بكسل للتأكد على التوالي من عدد الخلايا أو المنطقة البكتيرية داخل الخلايا (انظر الشكل 4). وينبغي الموازنة بين البيانات التي تم إنشاؤها ومعايير القبول القائمة على أساس إحصائي للتحقق من قوة ودقة المقايسة.
الشاشات عالية الإنتاجية على نطاق واسع هي تجارب تستغرق وقتا طويلا وتستغرق موارد. ولذلك، من الأهمية بمكان أن نقيم مسبقا مدى ملاءمة المقايسة. تم تصور البيانات التي تم جمعها من الشاشات الظاهرية باستخدام برامج جداول البيانات مثل Excel وتم تطبيعها بشكل عام لكل لوحة. مقاييس الجودة الأكثر شيوعا المستخدمة لكل من شاشات siRNA والجزيئات الصغيرة هي Z. يتم تعريف Z مع متوسط والانحراف المعياري لكل من عناصر التحكم الإيجابية والسلبية9. وZ كميا ما إذا كانت استجابة الفحص كبيرة بما يكفي للتحقق من صحة تطبيقها لشاشة كاملة النطاق من العينات. نطاق Z هو ما لا نهاية سلبي إلى 1، مع >0.5 كمقايسة جيدة جدا، >0 المقايسة المقبولة <0 م المقايسة غير مقبول. بالمقارنة مع شاشات جزيء صغير لقوة الضوابط التي تسمح للتحقق من صحة المقايسة مع Z > 0.5، وتقلب شاشات سيرنا يؤثر على Z التي تميل إلى أن تكون أقل (في كثير من الأحيان بين 0.0-0.5)10. في الواقع ، فإن نجاح شاشات siRNA يعتمد على التحسين من i) كفاءة تسليم siRNA إلى الخلايا ، 2) السمية الخلوية الناجمة عن العدوى و iii)شرط الفحص لكفاءة إسكات الجينات. يمكن بسهولة أن تكون مصابة في خطوط الخلية المختلفة، مثل هيلا، بعد بروتوكول العدوى الشركة المصنعة، ولكن كفاءة سيرنا transfection في بعض خطوط الخلايا بما في ذلك الضامة لا يزال يشكل تحديا. ومع ذلك، يمكن أن يمثل التعبير الفيروسي بوساطة ناقلات من الحمض النووي الريبي دبوس الشعر القصير (shRNA) بديلا جيدا11. للهروب من صعوبة التفسير ، يتم تطبيع البيانات التي تم جمعها من شاشات siRNA في كثير من الأحيان بالنسبة للتوزيع القياسي العادي لتحديد نقاط Z (وتسمى أيضا قيمة Z) لكل نقطة10،12. ثم، تم تصنيف عينات الضرب وفقا لدرجة Z التي تنتمي عادة إلى أقل من -2 أو أكثر من +2. وأخيرا، تم إعادة اختبار الزيارات المحددة في الشاشة الأساسية في شاشة ثانوية بما في ذلك المزيد من النسخ المتماثلة من أجل تأكيد النمط الظاهري الملاحظ في الشاشة الأساسية.
يمكن تطبيق بروتوكولنا بسهولة على شاشات صغيرة الحجم مزودة بمعدات. ولتحقيق ذلك، هناك حاجة إلى تصغير المقايسة في لوحات التيتر الدقيق والتلاعب بمكتبة الجزيئات لتحسين عملية الحفظ والاستغناء والاختلاط13. وعلاوة على ذلك، يوصى باستخدام منصة آلية آلية، بما في ذلك الموزعات، من أجل التحكم بدقة وبصورة مستنسخة في ظروف المقايسة في لوحات التيتر الدقيق. وينبغي أيضا إدارة الكم الهائل من البيانات التي ينتجها فحص الإنتاجية العالية (HTS) من خلال قاعدة بيانات وخطوط أنابيب مكيفة لتحليل صورة الصورة الكونفوجكال وتخزين البيانات ونقلها. وقد أجريت المقايسات الواردة في هذا التقرير في مرفق السلامة الأحيائية من المستوى 3. الالتزام الصارم بالسلامة في BSL3 يزيد من صعوبة الشاشات. في الواقع، يجب أن تكون العديد من المعدات اللازمة للشاشات متوفرة في BSL3 ومعزولة لحماية العامل والبيئة من التلوث. لذلك، يتطلب تركيب خط أنابيب تكييفها في BSL3 الكثير من الفضاء. لهذا السبب، تم تطوير بروتوكول لدينا أن يكون الحد الأقصى من الخطوات التي أجريت بها BSL3 مثل انتقال سيرنا ونقل المركب إلى لوحات. تم تنفيذ عدوى الخلية من خلال خطوات اكتساب الصورة في ظروف BSL3. ثم تم نقل الصور في خادم مخصص وتحليلها من BSL3.
استندت المقايسة الظاهرية الموصوفة هنا إلى طريقتين لتحليل الصور(الشكل 4). تم تصميم الطريقة الأولى ، المستخدمة لفحص الحمض النووي الريبي ، لإعطاء عدد من الخلايا المصابة. تم العثور على هذه المعلمة لمقارنة كفاءة تأثير إسكات الجينات على النسخ المتماثل Mtb داخل الخلايا. ومع ذلك، عندما كانت مركبات الفحص، كانت القراءة الأساسية على أساس المساحة الإجمالية للخلايا كافية لتحديد المركبات النشطة بوضوح. وبما أن هذه الطريقة الثانية أسرع وأسهل في التنفيذ، فقد فضلت تحليل الصور الناشئة عن فحص المركبات. وللذهاب إلى أبعد من ذلك، يمكن إضافة المزيد من الأصباغ الفلورية و / أو مسابير وضع العلامات ويمكن تحسين نصوص تحليل الصور لتوليد بيانات متعددة البارامترية مثل الكولوكالينج والنوى ومورفولوجيا الخلايا، وموت الخلايا، والتجميع البكتيري، فضلا عن الاتجار داخل الخلايا من البكتيريا. ومن المهم ملاحظة أنه بالنسبة للاتجار داخل الخلايا أو المقايسات العملاقة، من الضروري الحصول على مداخن Z من أجل تطبيق تقييم تراكمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد قدمت الجماعة الأوروبية الدعم المالي لهذا العمل (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901، وMM4TB Grant n° 260872)، والوكالة الوطنية للإعادة إلى الخلايا، والفيدر (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed)، والمنطقة نورد باس دي كاليه. ونحن نعترف بامتنان بالمساعدة التقنية التي يقدمها غاسبار ديلويسون، وإليزابيث فيركمايستر، وأنطونينو بونجيوفاني، وفرانك لافون من منصة BICeL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
