Summary
Este protocolo explora os mais recentes avanços na realização de análises de Western blot. Estas novas modificações empregar um sistema de gel de Bis-Tris com uma electroforese em tempo de execução de 35 minutos, uma seco do sistema de transferência de mancha de 7 min, e a detecção da proteína fluorescente no infravermelho e de imagem que gera uma maior resolução, qualidade, sensibilidade, e precisão melhorada de dados ocidentais.
Abstract
As técnicas de Western blot que foram originalmente estabelecidas no final de 1970 ainda estão ativamente utilizado hoje. No entanto, este método tradicional de transferência Western tem vários inconvenientes que incluem a resolução de baixa qualidade, bandas espúrias, diminuição da sensibilidade, e a integridade da proteína pobre. Os avanços recentes têm melhorado drasticamente inúmeros aspectos do protocolo padrão de Western blot para a produção de dados qualitativos e quantitativos mais elevados. O sistema de gel de Bis-Tris, uma alternativa ao sistema convencional de Laemmli, gera uma melhor separação e resolução de proteínas, mantém a integridade da proteína, e diminui a electroforese para um tempo de corrida de 35 min. Além disso, o sistema de mancha seca iBlot, melhora drasticamente a eficácia e velocidade de transferência da proteína para a membrana em 7 min, o que está em contraste com os métodos de transferência de proteína tradicionais que são muitas vezes mais ineficaz com tempos de transferência longas. Em combinação com estas modificações altamente inovadores, proteínas detection usando resultados de imagem fluorescente infravermelhos em maior qualidade, mais precisos e dados consistentes em comparação com a técnica de Western blot padrão de quimiluminescência. Esta tecnologia pode detectar simultaneamente dois antigénios diferentes sobre a mesma membrana, pela utilização de duas cores de corantes de infravermelho próximo, que são visualizadas em diferentes canais fluorescentes. Além disso, a linearidade e ampla gama dinâmica de imagiologia fluorescente permite a quantificação precisa de bandas de proteínas, tanto fortes e fracos. Assim, este protocolo descreve as principais melhorias para o método de Western blot clássico, em que esses avanços aumentar significativamente a qualidade dos dados, reduzindo consideravelmente o tempo do experimento de desempenho.
Introduction
A técnica de Western blot foi desenvolvido pela primeira vez entre 1977 e 1979, a fim de criar um método melhorado para a detecção de proteínas utilizando anticorpos 1-3. Este procedimento utilizado transferência electroforética de proteínas para membranas de géis de SDS-PAGE com proteínas alvo visualizadas utilizando anticorpos secundários e detectados por auto-radiografia, a luz UV, ou um produto de reacção de peroxidase 3. Assim, estes mesmos princípios básicos são ainda largamente utilizados em protocolos actuais de Western blot. No entanto, essa técnica clássica de Western Blot não apresenta muitas desvantagens, tais como tempos lentos eletroforese funcionamento, baixa resolução e bandas de proteínas artificiais, suscetibilidade à degradação de proteínas e sensibilidade limitada, bem como má qualidade dos dados 4. Portanto, este protocolo descreve avanços significativos e melhorias para o procedimento de Western blot padrão que gera dados qualitativos e quantitativos mais precisos.
"> O sistema de Laemmli para separar uma grande variedade de proteínas, utilizando SDS-PAGE, é o sistema de gel mais amplamente utilizado para a transferência de Western 5. Apesar da popularidade do presente sistema de transferência de Western, este método pode resultar na distorção da banda, a perda de resolução, e bandas espúrias 4. Isto pode ser uma consequência de a desaminação e a alquilação das proteínas, devido ao elevado pH (9,5) do gel de separação, a reoxidação de redução de ligações dissulfureto, devido à variação do estado redox do gel, e a clivagem de aspartil-prolil ligações peptídicas, devido ao aquecimento da proteína em tampão Laemmli (pH 5,2) 4,6. O sistema de gel de Bis-Tris, que opera a um pH neutro (7,0), proporciona benefícios significativos sobre o sistema Lamemmli. Este sistema melhora a estabilidade da proteína, minimiza modificações de proteínas, proteínas mantém no seu estado reduzido, impede aspartil-prolil clivagem durante a electroforese, e mais importante, o tempo de electroforese é executado 35 min 4,6,7. Além disso, tsistema de gel ele Bis-Tris também produz bandas nítidas e de alta resolução e separação, e aumento da sensibilidade, resultando em dados mais confiáveis 4.Em conjunção com o sistema de gel de Bis-Tris, o sistema de mancha seca iBlot usa força de alto campo e correntes para reduzir significativamente o tempo de transferência de proteínas dos geles para membranas de dentro 8 7 min. Este sistema de transferência é baseado no método de mancha seco que gera uma transferência mais eficiente e fiável de proteínas 8. Para uma comparação detalhada da eficácia do sistema de transferência de iBlot aos sistemas convencionais de transferência, consulte o seguinte site: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Ele utiliza uma pilha ânodo e cátodo, que são compostas de uma matriz de gel que contém os buffers de transferência adequados, que funcionam como reservatórios de iões 8. Durante a transferência, a eletrólise da água ajuda a evitar a geração de oxigênio a partir do ânodo de cobre, resultando em uma transferência de proteína mais consistente, sem causar distorção banda 8. Além disso, este sistema de transferência também aumenta a velocidade de transferência através da redução da distância entre os eléctrodos 8.
Apesar de quimiluminescência é a técnica mais comum e tradicional para a detecção de proteínas de análises de Western blot, duas cores detecção fluorescente no infravermelho melhora a sensibilidade, qualidade e precisão dos dados de Western blot. Este método de detecção utiliza excitação laser infravermelho em dois comprimentos de onda ideal, 700 nme 800 nm, para gerar uma imagem clara de dados com a maior relação sinal-para-ruído mais elevada sensibilidade e 9. Assim, duas das proteínas alvo podem ser visualizadas simultaneamente na mesma membrana utilizando a 700 nm e 800 nm canais de detecção de fluorescência. Mais importante ainda, a linearidade e gama dinâmica de fluorescência no infravermelho permite a análise quantitativa precisa de bandas de proteínas, tanto fortes e fracos 9. Além disso, este protocolo proporciona enormes vantagens e melhorias sobre a técnica de Western blot clássico, diminuindo a eletroforese e tempos de transferência desta experiência, sem comprometer a eficácia desses processos e utilizando a detecção da proteína fluorescente no infravermelho para produzir maiores dados Western blot qualitativos e quantitativos.
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Protocol
1. Preparação de lisados de células inteiras a partir de Cultura de Células
- Colocar placas de cultura de células em gelo e adiciona-PBS frio, com 5 mM de EDTA (por exemplo, 5 ml de PBS com 5 EDTA/10 mM cm 2 placas). Remover células aderentes do prato usando um raspador de células e, em seguida, transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml frio.
- Agregar as suspensões de células por centrifugação a baixa velocidade a 1000 rpm (230 xg) durante 5 min a 4 ° C. Colocar os tubos cónicos em gelo e o sobrenadante cuidadosamente aspirado sem perturbar o sedimento.
- Lava-se a pelete com 1 ml de PBS com EDTA 5 mM e transferir a suspensão de células a uma solução fria de 1,5 ml tubo de centrifugação. Suspensão rotação rápida a 13.000 rpm (13.226 xg) por 10 segundos para sedimentar as células. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento e colocar os tubos no gelo.
- Ressuspender o sedimento em 25-200 ul (dependendo do tamanho da pastilha, ou seja, para 3 x 10 ~ 6 células adicionar 150 ul de tampão de RIPA) nasTampão RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, NaF 10 mM, SDS a 0,1%, desoxicolato de sódio a 0,5%, 1% de NP-40) contendo a protease adicionada de fresco e inibidores da fosfatase a uma concentração final 2x. Resumidamente vortex cada tubo e incubar a suspensão durante 20-30 minutos em gelo. Nota: existem vários tampões de lise que podem ser utilizados para extrair proteínas, que diferem na sua capacidade para solubilizar as proteínas e força do seu detergente desnaturante (SDS ou seja, Triton X-100, ou NP-40). Tampão RIPA é útil para a preparação de lisados de células inteiras e perturbar interacções proteína-proteína.
- Para criar uma fracção pós-nuclear, lisados de centrífuga a 14.000 rpm (15.339 xg) por 5 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo, sem perturbar o sedimento e colocar tubos enriquecido-nucleares em gelo. Nota: o pellet nuclear enriquecido também pode separar o tubo ao extrair o sobrenadante. Para evitar a cobrança do pellet-enriquecido nuclear, coloque a ponta da pipeta directamente into a pelota enriquecido nuclear viscoso e desenhar-se com a pipeta, a fim de eliminá-lo.
- Determinar as concentrações de proteína de cada amostra de acordo com as instruções do fabricante, utilizando tais ensaios de quantificação de proteína de BCA ou Bradford.
2. Preparação de amostras e Eletroforese
- Prepare cada amostra de acordo com o gráfico a seguir descritos abaixo. Como uma alternativa, β-mercaptoetanol também pode ser utilizado a uma concentração final de 2,5%. No entanto, o agente redutor deve ser adicionado a cada amostra até uma hora antes de carregar no gel. O total de contas de volume para variações de pipetagem com apenas 20 mL de cada amostra preparada carregado por poço.
REAGENTES Amostra reduzida Amostra Proteína X mL 4x LDS Sample Buffer 6 mL 500 nM TDT Reducing Agent 2,4 mL Água Desionizada Até 15,6 mL Volume Total 24 mL - Amostras de calor a 70 ° C durante 10 min. Enquanto as amostras são o aquecimento, preparar 1.000 ml de MES 1x ou MOPS tampão de corrida (50 ml 20x MES ou MOPS tampão de corrida, mais 950 ml de água deionizada). MOPS tampão de corrida resolve proteínas de médio porte entre 14-200 kDa, enquanto MES tampão de corrida resolve proteínas de peso molecular menores entre 2-200 kDa com um pKa inferior, que permite que os MES tampão de corrida para correr mais rápido do que os MOPS 4. Assim, estes dois buffers tenham efeitos contrastantes na migração de iões no interior do gel de empilhamento, que dá origem a diferenças na separação das bandas de proteína de 4. Ponha de lado e combinar 200 ml de MES 1x ou MOPS tampão de corrida com 500 mL de antioxidante, que serão utilizados para preencher o buffer Câmara do Min Superiorunidade de eletroforese i-Cell.
- Uma vez que as amostras são terminou de aquecimento, as amostras rápidas de rotação antes de colocá-los em gelo.
- Para a montagem dos pré-moldados géis Bis-Tris para a unidade Mini-Cell para eletroforese de seguir as instruções do fabricante. Nota: certifique-se cada gel é orientado de tal forma que a cassete mais curto (menor) de cada gel é voltado para dentro em direção ao buffer Core e os géis são de nível e firmemente pressionado contra o buffer do núcleo para evitar vazamento do buffer Câmara Alta.
- Preencher o buffer Câmara Alta com os 200 ml de MES 1x ou MOPS tampão de corrida contendo o antioxidante eo buffer Câmara da unidade Mini-Cell, com cerca de 600 ml de MES 1x ou MOPS tampão de corrida mais baixo. Os extras 200-300 ml de tampão de corrida pode ser guardado para uso posterior. No entanto, não é recomendado para reciclar o tampão utilizado durante a electroforese de execução como o pH e a qualidade do tampão pode ser alterada.
- Carregar 20 ul de cada proteína SAMPle em cada poço. Se a secção da membrana em várias tiras, a fim de investigar a vários anticorpos (isto é, mais do que 2), é altamente recomendável para carregar 2-5 ul do padrão de proteínas pré-corados nos primeiros e últimos poços de cada gel como este servirá guias de corte para separar os diferentes setores da membrana, sem afetar a imagem das bandas de proteínas.
- Géis executado em 200 V constante por 35 min com uma corrente esperada de 110-125 mA / gel no início e 70-80 mA por gel no final. A electroforese é completa quando o corante de rastreio migra para o fio de platina ao longo do tampão de núcleo.
3. Transferência de proteína Usando o Sistema Blotting iBlot seco
- Completamente separar os mini-géis por quebrar as laterais colados da cassete (pode produzir um ruído de crepitação). Descartar o prato mais curto (menor) e transferir cuidadosamente o gel a partir do (encaixados) placa mais dentro de um recipiente com água desionizada eremover a porção de espessura de pés do gel localizado na parte inferior. Nota: em casos raros, o gel pode juntar ao prato mais curto em vez do mais, encaixados prato. Neste caso, o descarte, a placa com ranhuras mais e remover a porção de espessura de pés do gel localizado na parte inferior. Em seguida, transferir cuidadosamente o gel a partir da placa mais curta à água desionizada.
- Montar as pilhas de transferência do ânodo e do cátodo de acordo com as instruções do fabricante. Nota: as membranas de nitrocelulose ou PVDF, tanto fornecer alta qualidade e eficiência de transferência das proteínas e são compatíveis com a detecção fluorescente 8. No entanto, a membrana de PVDF tem uma capacidade de ligação mais elevada (240 mg / cm 3) de nitrocelulose (200 ug / cm 3) 8.
- Cuidadosamente remover quaisquer bolhas ou ar preso entre o gel ea membrana, pois isso vai evitar qualquer distorção das bandas de proteínas durante a transferência. Nota: não cortar a membrana ou a transfer empilhar para ajustar seu tamanho gel, pois isso fará com que o contato direto entre o anodo eo catodo stacks.
- Depois de montar corretamente as pilhas de transferência do dispositivo mancha seca, selecione o programa de tensão adequada (ou seja, Programa 3: 20 V para 7 min) e iniciar a transferência. Nota: proteínas maiores que 150 kDa tendem migrar mais lentamente e pode exigir um tempo de transferência de mais de 8-10 min. Além disso, a incubação prévia do gel em 20% de etanol, durante 5-10 min, também vai ajudar a melhorar a eficiência da transferência destas proteínas grandes. Uma vez que o programa de transferência for concluída, o dispositivo desliga-se automaticamente a corrente. É melhor remover imediatamente a membrana e prosseguir com o procedimento de bloqueio para garantir uma melhor detecção de proteínas e evitar ressecamento da membrana.
4. Infravermelho Detecção de Proteína Fluorescente
- Bloco de membrana (s) num mínimo de 0,8 ml / cm 2 de Odyssey tampão de bloqueio (não adicionar Tween-20) durante 1 hora oudurante a noite a 4 ° C. Membrana (s) podem também ser bloqueados com leite em pó desnatado, no entanto, isto pode provocar maior fundo e interferir com a detecção da proteína.
- Incubar membrana (s) no anticorpo primário para a concentração desejada em tampão de bloqueio Odyssey com 0,1% de Tween-20 durante a noite a 4 ° C. Para a detecção de duas cores, em que dois antigénios diferentes são visualizadas na mesma mancha, os dois anticorpos primários deve ser derivado de diferentes espécies hospedeiras e adicionou-se simultaneamente para a membrana (s). Nota: antes de incubação da membrana (s) de anticorpo primário, a membrana (s) pode ser seccionado em vários pedaços, de modo a sondar para vários anticorpos (isto é, mais do que 2) na mesma membrana.
- Lavar membrana (s) 3x durante 10 minutos em TBS com 0,1% de Tween-20 com agitação suave.
- Incubar membrana (s) com os anticorpos secundários marcados com fluorescência, a uma diluição de 1:20000 para o canal de 700 nm e 1:6,000-1:10,000 para o canal de 800 nm, em Odyssey tampão de bloqueio com 0,1% de Tween-20 durante 30-60 minutos (a incubação da membrana (s) por mais do que 1 hora pode aumentar fundo). Proteger membrana (s) de luz. Nota: os anticorpos secundários devem ser derivada da mesma espécie do hospedeiro uma vez que cada um dos anticorpos primários e marcados com diferentes fluoróforos.
- Lavar membrana (s) 3x durante 10 minutos em TBS com 0,1% de Tween-20 com agitação suave. Proteger membrana (s) de luz.
- Membrana (s) pode ser seco ou armazenado em TBS ou PBS sem Tween-20 a 4 ° C até ser digitalizado e fotografada com um sistema de imagem de infravermelhos. Sinal fluorescente permanecerá estável por vários meses se devidamente protegido contra a luz.
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Representative Results
Duas cores de fluorescência no infravermelho detecta bandas tanto fortes e fracos sobre a mesma membrana, com o aumento da sensibilidade e a maior relação sinal-para-ruído para produzir imagens nítidas de Western blot. Os resultados típicos gerados por duas cores detecção de Western blot visualizado em ambos os 700 nm e 800 nm canais fluorescentes são exemplificados nas Figuras 1 e 2. O Western blot superior na Figura 1 mostra o concomitante (overlay) detecção do total de ERK1 / 2 no canal de 800 nm (verde) e β-actina no canal de 700 nm (vermelho) de diluições em série de duas vezes de lisados da humano derivada de linha celular de melanoma, WM793. Além disso, esta membrana também foi cortado em secções, com base nos pesos moleculares das proteínas alvo desejadas, a fim de permitir mais do que dois anticorpos a ser examinadas no mesmo blot. Por exemplo, a membrana analisados na Figura 1, foi cortada ao meio, a fim de investigar a porta menorde iões da membrana com um terceiro anticorpo, o BIM total de (700 nm-canal vermelho) sem inferir com a detecção de ambos total de ERK1 / 2 e β-actina. O primeiro painel da Figura 2 demonstra ainda a duas cores de Western blot de detecção de fluorescência de fosfo-ERK1 / 2 (800 nm-canal verde) e total de ERK1 / 2 (700 nm-canal vermelho) com sobreposição de sinais de ERK e de fosfo-ERK total de apresentado a amarelo WM793 de células de melanoma tratadas na presença e na ausência do inibidor de MEK1 / 2, PD0325901 (meki), que suprime a via de sinalização da ERK1 / 2 MAP quinase. Além disso, a 700 nm e 800 nm imagens fluorescentes podem também ser convertidos para as imagens de Western blot padrão preto e branco para cada anticorpo (Figuras 1 e 2). Em geral, a maioria das imagens de Western blot produzidos por este protocolo irá resultar em imagens de alta qualidade, como exibido nas Figuras 1 e 2. No entanto, dependendo da selectividade, especificidade,e qualidade do anticorpo primário, inferior a optimização de imagens pode resultar em uma pequena porção de borrões analisadas por este método. Por exemplo, conforme observado na parte inferior dois painéis da Figura 2, a qualidade parágrafo do anticorpo fosfo-BIM nas células de melanoma WM793 tratados com e sem inibição da MEK resultou numa imagem de Western blot, com bandas de proteínas fraco e fundo extremamente elevada da membrana.
Simultânea imagiologia fluorescente no infravermelho de dois alvos também podem proporcionar a oportunidade para a análise quantitativa das manchas de Western sobre uma vasta gama dinâmica, linear, de maneira eficiente e com precisão, tanto detectar bandas fortes e fracos sobre a mesma membrana. A quantificação das bandas de proteína são calculados como uma intensidade integrada, que é proporcional à quantidade de anticorpos fluorescentes marcado na membrana e é independente da dimensão da forma desenhada em torno da banda e resolução. Este baseia-se nos seguintes critérios: 1) sãouma forma de o, 2) o número de pixels fechados na forma, 3) intensidade média dos pixels seleccionados como o fundo e, 4.) intensidade total dos pixels e fechadas com a forma dada 10 A Figura 3A mostra a quantificação da proteína do As transferências de Western ilustrada na Figura 1. Quantificação do total da ERK1 / 2, β-actina, e exibem BIM total de uma relação linear entre o aumento da intensidade integrada de sinal fluorescente e o aumento na concentração da proteína (Figura 3A). Por outro lado, a Figura 3B é um outro exemplo de como a quantificar os níveis de proteína a partir de transferências de Western fluorescentes, o que mostra a quantificação da proteína de fosfo-ERK1 / 2 normalizadas para os níveis totais de ERK1 / 2 de proteína das células de melanoma WM793 tratados com e sem inibição da MEK a partir da Figura 2 . Deste quantificação, as fosforiladas ERK1 / 2 níveis pode ser calculada como uma percentagem dos níveis de controlo. Neste casi, os níveis de fosfo-ERK de células de melanoma tratadas com o inibidor de MEK foram de 0,6% do controlo.
Figura 1. Análise Western blot utilizando duas cores de proteína fluorescente de detecção de infravermelhos. Lisados de duas diluições em série de proteínas de melanoma humano derivado WM793 foram separados usando um gel NuPAGE Novex Bis-Tris com proteína transferida para uma membrana de PVDF, utilizando o aparelho de transferência iBlot . As membranas foram bloqueadas em Odyssey tampão de bloqueio e sondados com os seguintes anticorpos primários: de coelho anti-ERK1 total / 2, de coelho anti-total de BIM, e de ratinho anti-β-actina. Complexos antigénio-anticorpo foram detectados utilizando cabra anti-coelho fluorescente IRDye 800 (verde) ou 680 (vermelho) e anticorpo de cabra anti-rato IRDye 680 (vermelho) anticorpos secundários, respectivamente,e visualizados com o Odyssey clássico Infrared Imaging System LI-COR. O primeiro painel Western blot é a sobreposição da detecção simultânea do total de ERK1 / 2 (800 nm-canal verde) e β-actina (700 nm-canal vermelho) sinais fluorescentes. O segundo painel é o único canal de detecção de fluorescência de BIM total da mesma membrana que foi separado utilizando uma lâmina de barbear com base nos pesos moleculares destas proteínas alvo. Os três painéis inferiores Western blot são as imagens em preto e branco das imagens fluorescentes de canal único separados.
Figura 2. Um exemplo de uma imagem, tanto por transferência de Western de alta e baixa qualidade usando fluorescência de infravermelhos. WM793 células de melanoma tratadas com DMSO (CTL) ou 2 fiM de inibidor de MEK, PD0325 901 (meki), durante 18 horas, foram analisados como descrito na Figura 1. A membrana foi sondada com anticorpo de coelho anti-fosfo-ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204), de ratinho anti-total de ERK1 / 2, e de ratinho anti-fosfo-BIM (Ser69) com complexos antigénio-anticorpo detectados com anticorpos de cabra anti-coelho IRDye 800 (verde) e de cabra anti-rato IRDye 680 (vermelho). O primeiro painel Western blot é a sobreposição da detecção simultânea de ambos totais ERK1 / 2 (700 nm-canal vermelho) sinais fluorescentes fosfo-ERK1 / 2 (800 nm-canal verde) e. O segundo e terceiro painéis são as imagens em preto e branco das imagens fluorescentes de um único canal de fosfo total e ERK1 / 2. Os últimos dois painéis são as imagens fluorescentes e preto e branco de fosfo-BIM. Estas imagens representam um exemplo de um Western blot parágrafo que pode resultar, com este método devido à qualidade inferior do anticorpo primário.
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Figura 3. Exemplos de quantificação de proteínas dos infravermelhos fluorescentes Western blot. D) Quantificação do total da ERK1 / 2, β-actina, e os níveis totais de proteína BIM foi determinado através do cálculo da intensidade integrada de cada banda de proteína. A intensidade integrada é proporcional à quantidade de anticorpos secundários fluorescentes marcado na membrana. Valores de R-quadrado também foram utilizados para avaliar a regressão linear para cada um dos anticorpos analisados na Figura 1. B) Quantificação de fosfo-ERK1 / 2 normalizado ao total de ERK1 / 2 níveis de proteína da Figura 2 foi calculada utilizando a intensidade integrada da sinal fluorescente e os dados são apresentados como uma percentagem do controle de DMSO.
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Discussion
Os passos críticos na geração de alta qualidade, transferências de Western quantitativas de acordo com este protocolo, são os seguintes: 1) a medição das concentrações de proteína e 2) a preparação da amostra, 3) o bloqueio da membrana e 4) qualidade e calibre do anticorpo primário.
A precisão da medição das concentrações de proteína total podem ter um impacto importante na quantificação bandas de proteínas uma vez que a sensibilidade excepcional de detecção fluorescente no infravermelho vai amplificar quaisquer ligeiras diferenças encontradas na concentração de proteína das amostras. Para evitar discrepâncias na determinação da concentração de proteína, gerando uma curva padrão com uma linha de regressão linear ou valor de R-quadrado de cerca de 1 quanto possível (R2 ≥ 0,99 ou melhor) é importante para o cálculo exacto da concentração de proteína de cada amostra . Por exemplo, se o valor de R 2 cai abaixo de 0,99, a preparação de padrões de BSA com água ultrapura fresca e cuidadosamente repetindo oensaio de quantificação de proteínas pode ajudar a aumentar o valor de R 2. Também é melhor evitar o uso de uma pipeta multicanal, pois isso irá gerar inconsistências na pipetagem que podem contribuir para reduzir valores de R 2 e imprecisões nas concentrações de proteína das amostras.
A preparação das amostras desempenha um papel importante na determinação da qualidade das bandas de proteínas, que também pode ter um efeito directo sobre a quantificação destas bandas. Ao utilizar o sistema de gel Bis-Tris, é altamente recomendável que as amostras são preparadas com amostra LDS buffer porque o pH levemente alcalino (8,5) desse buffer fornece a condição ideal para a redução de pontes dissulfeto e desnaturação 4. Este tampão de amostra também contém um corante rastreamento Coomassie G250 que produz uma frente de corante afiada que migra com a frente de íons em movimento, o que ajuda a garantir que os pequenos peptídeos não correr o gel 4. Mais importante ainda, a Amostra LDSTampão minimiza a clivagem de ligações peptídicas aspartil-prolil quando as amostras são aquecidas a 70 ° C, devido ao pH do tampão de mudança 8,5-8,0 4. Isso resulta em um ambiente ideal para a redução e a alquilação das proteínas, ao mesmo tempo preservando a integridade da proteína. No entanto, se um tampão de amostra Tris-Glicina SDS é usado em vez da amostra LDS tampão, isto levará à clivagem das ligações aspartil-prolilo, uma diminuição em a nitidez das bandas de proteína e um aumento de fragmentação de proteína 4. Também é pertinente para adicionar o antioxidante para o buffer de Câmara da unidade de eletroforese Mini-Cell Superior. Uma vez que o antioxidante é capaz de comigrate com as amostras a pH neutro no sistema de gel de Bis-Tris, este pode ajudar a manter as proteínas num estado reduzido e proteger ligações dissulfureto, bem como ácidos aminados sensíveis à oxidação, ao passo que a ausência do antioxidante pode levar a bandas de proteína difusa 4. Por último, é altamenterecomendado o uso de qualquer MES ou MOPS tampão de corrida com gel Bis-Tris em vez de usar Tris-glicina SDS tampão de corrida com estes tipos de géis. A combinação de Tris-glicina SDS tampão de corrida e Bis-Tris geles resultados na migração lenta de iões de glicina causando um aumento drástico no tempo de electroforese executado com bandas que aparecem mais comprimido e 4 em forma de taça.
A etapa de bloqueio é também crucial para a produção de imagens de Western blot de alta qualidade utilizando detecção de fluorescência, como muitos dos diferentes agentes bloqueadores pode gerar fundo elevado membrana. Para a detecção de fluorescência no infravermelho, é melhor usar o Odyssey tampão de bloqueio, porque este agente bloqueador específico aumenta a sensibilidade de detecção da proteína, mantendo baixo o fundo. Embora o leite desnatado seco, caseína, ou BSA também poderiam ser utilizados como agentes de bloqueio alternativos, esses tipos de soluções pode causar o fundo da membrana superior e em alguns casos uma diminuição na bindiafinidade ng do anticorpo primário 10. Além disso, os bloqueadores à base de leite pode conter IgG que podem reagir de forma cruzada com fosfo-epitopos e anticorpos anti-cabra, o que poderia interferir com a precisão de detecção da proteína e do anticorpo de ligação adequada 9,11. No entanto, se uma imagem de Western Blot é atormentado por alta fundo, bandas inespecíficas, ou fraco / sem sinal, em seguida, utilizando um destes agentes bloqueadores alternativos podem ajudar a melhorar a qualidade da imagem. Além disso, também é recomendado para evitar a adição de detergente para a etapa de bloqueio e as incubações de bloqueio desde que isto pode levar a um aumento no fundo e / ou a perda da proteína alvo a partir da membrana de 9,12.
Simultaneamente detecção de dois antigénios diferentes na mesma mancha, utilizando anticorpos marcados com um infravermelhos 700 nm e corante canal 800 nm requer selecção prudente de ambos os anticorpos primários e secundários. Os dois anticorpos primários deve ser derivado de diferentes hosespécies t. Por exemplo, se um anticorpo primário é derivada de coelho, em seguida, o segundo anticorpo primário tem de ser derivados a partir de um coelho de diferentes outras espécies, tais como rato. Do mesmo modo, os anticorpos secundários infravermelhos também necessita de ser derivado da mesma espécie hospedeira como cada um dos anticorpos primários e marcados com diferentes fluoróforos. Por exemplo, um anticorpo de cabra anti-coelho no canal de 800 nm, pode ser combinado com um anticorpo de cabra anti-rato, no canal de 700 nm, a fim de observar com precisão o sinal de proteínas a partir de dois diferentes anticorpos primários que são derivados de coelho e rato.
Os anticorpos primários variam consideravelmente na sua qualidade, de afinidade, e a sensibilidade para o seu antigénio. Isto pode resultar numa redução significativa no sinal ou um aumento na ligação não específica de proteínas para a membrana criando, assim, dificuldades na visualização exacta da proteína alvo. Assim, usando uma solução de bloqueio alternativo, tal como o leite em pó desnatado oucaseína dissolvida em PBS, pode ajudar a melhorar a detecção de proteínas com anticorpos primários de baixa qualidade 10. Além disso, a concentração de detergente também pode afectar a ligação do anticorpo primário para o antigénio alvo e precaução devem ser considerados quando se determina a concentração de detergente a fim de evitar a lavagem para retirar o anticorpo. Uma baixa concentração de SDS (0,01-0,02%) pode reduzir o fundo e a ligação não específica quando adicionado ao anticorpo secundário diluído, especialmente quando utilizando membrana de PVDF 10. No entanto, a SDS também pode atrapalhar antígeno-anticorpo de ligação que leva a uma severa redução na força do sinal.
Além disso, as novas modificações descritas neste protocolo exemplifica uma abordagem moderna para a técnica de blotting tradicional ocidental. Estes avanços de ponta melhorar drasticamente a eficácia, consistência e sensibilidade dos dados ocidentais e permite a quantificação precisa de múltiplas proteínas-alvona mesma membrana, independentemente da intensidade do sinal. Mais importante, estas alterações também valiosos reduzir significativamente o tempo de observação de realizar uma transferência de Western, enquanto a produção de dados qualitativos e quantitativos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório McMahon por sua assistência e apoio. Esta pesquisa foi apoiada por doações de um R01 CA176839-01 NIH / NCI (a MM) e um Prêmio de Pesquisa Institucional e Acadêmico de Desenvolvimento de Carreira (IRACDA para JS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific/Pierce | 23225 | |
| 4x NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | |
| 10x NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen/Life Technologies | NP0004 | |
| 20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0002 | |
| 20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0001 | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen/Life Technologies | NP0005 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well | Invitrogen/Life Technologies | NP0335BOX | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well | Invitrogen/Life Technologies | NP0336BOX | |
| SeeBlue Plus2 Prestained Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5925 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen/Life Technologies | EI0001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-01 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-02 | |
| iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-01 | |
| iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-02 | |
| iBlot Gel Transfer Device | Invitrogen/Life Technologies | IB1001 | |
| β-Actin | Sigma | A2228 | |
| Phospho-BIM (S69) | BD Biosciences | N/A | |
| Total BIM | Epitomics | 1036-1 | |
| Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Total ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 9107 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-68020 | |
| Western Incubation Box, Medium | LI-COR Biosciences | 929-97205 | |
| Odyssey Classic Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Odyssey Application Software V3.0.30 | LI-COR Biosciences | N/A |
References
- Burnette, W. N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kubo, K. Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling. Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).
- Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support. J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).
- Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030. LI-COR Biosciences. , (2007).
- Hambaeus, L.
- DenHollander, N., Befus, D. Loss of antigens from immunoblotting membranes. J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).
