Produzione di RNA per l'analisi trascritomica dai corpi cellulari dei motoneuroni del midollo spinale del topo mediante microdisezione di cattura laser

Summary

L'RNA totale di alta qualità è stato preparato da corpi cellulari di motoneuroni del midollo spinale del topo mediante microdisezione di cattura laser dopo aver macchiato sezioni del midollo spinale con Azure B nel 70% di etanolo. L'RNA sufficiente (~40-60 ng) viene recuperato da 3.000-4.000 motoneuroni per consentire l'analisi dell'RNA a valle mediante RNA-seq e qRT-PCR.

Abstract

La preparazione di RNA di alta qualità da cellule di interesse è fondamentale per un'analisi precisa e significativa delle differenze trascrizionale tra i tipi di cellule o tra lo stesso tipo di cellule in salute e malattia o dopo trattamenti farmacologici. Nel midollo spinale, tale preparazione dai motoneuroni, bersaglio di interesse in molte malattie neurologiche e neurodegenerative, è complicata dal fatto che i motoneuroni rappresentano il <10% della popolazione cellulare totale. La microdisezione di cattura laser (LMD) è stata sviluppata per affrontare questo problema. Qui, descriviamo un protocollo per recuperare, congelare e seminare rapidamente il midollo spinale del topo per evitare danni all'RNA da parte di RNasi endogene ed esogene, seguito dalla colorazione con Azure B nel 70% di etanolo per identificare i motoneuroni mantenendo inibita la RNasi endogena. LMD viene quindi utilizzato per catturare i neuroni macchiati direttamente nel tampone di lisi tiocianato di guanidina, mantenendo l'integrità dell'RNA. Le tecniche standard vengono utilizzate per recuperare l'RNA totale e misurarne l'integrità. Questo materiale può quindi essere utilizzato per l'analisi a valle delle trascrizioni da RNA-seq e qRT-PCR.

Introduction

Nei tessuti di mammiferi composti da più tipi di cellule diverse, l'avvento della strumentazione di microdisezione di cattura laser (LMD) ha offerto la possibilità di selezionare un tipo di cellula specifico per l'analisi a livello di RNA o proteine. Attualmente, le tecniche di amplificazione e sequenziamento di nuova generazione consentono l'uso di un pool di RNA totale da alcune migliaia di cellule per ottenere un inventario relativamente completo del trascrittoma, compresa la valutazione dei livelli relativi di RNA e l'identificazione di varie forme spliced. Ad oggi, le analisi proteomiche di alcune migliaia di cellule raggiungeranno solo specie più abbondanti. Ad esempio, abbiamo identificato <1.000 delle proteine più abbondanti da 3.000-4.000 corpi cellulari dei motoneuroni (non mostrati), e Zhu e colleghi hanno recentemente riferito di identificare 2.665 proteine da ~ 15.000 cellule tumorali¹. Con ulteriori sviluppi della spettrometria di massa, tuttavia, è probabile che tali analisi si estenderanno a una profondità molto maggiore.

Qui, presentiamo un protocollo specifico utilizzato per l'LMD dei corpi cellulari dei motoneuroni dal midollo spinale dei topi, seguito dalla preparazione dell'RNA. Questo protocollo è stato utilizzato nel contesto del confronto degli RNA dai motoneuroni di superossido mutante transgenico presintomatico dismutasi (SOD)1 topi di sclerosi laterale amiotrofica (ALS) con RNA preparati da un ceppo transgenico SOD1 di tipo selvatico sia da RNA-seq che da qRT-PCR convalida². In particolare, i motoneuroni, nel corno anteriore della materia grigia nel midollo spinale, costituiscono il <10% della popolazione cellulare totale, circondati da un mare di astrociti e, come tali, il loro profilo trascrizionale non può essere facilmente sconvoluto dagli studi dell'intero cordone. Un approccio di cattura laser è quindi ideale per analizzare l'espressione dell'RNA in queste cellule, con la fisiologia preservata mediante rapida accisa e congelamento del cavo a seguito di una breve perfusione salina intracardiaca. I somata dei motoneuroni sono grandi e sono quindi facilmente rilevabili, qui utilizzando un colorante che ha una forte affinità per i neuroni³. Inoltre, con tali dimensioni, queste cellule forniscono una quantità relativamente grande di RNA per cellula catturata. La procedura utilizzata, come descritto di seguito, potrebbe essere facilmente regolata per ottenere altri tipi di cellule neuronali, così come potenzialmente altri tipi di cellule, specificamente identificate sia con tecniche di colorazione dei coloranti che con la colorazione degli anticorpi.

Protocol

Le procedure descritte qui per anestesia, eutanasia e perfusione cardiaca dei topi sono state eseguite secondo un protocollo approvato dal Yale University Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Preparazione di strumenti e soluzioni senza RNasi

1. La RNasi è un contaminante comune di tutte le superfici di laboratorio, inclusi piani di banco, micropipette e lo sperimentatore.
   1. Cambiare spesso o regolarmente i guanti con una soluzione di decontaminazione RNAse.
   2. Gli utensili di dissezione e le vetrerie in acciaio inossidabile possono essere resi senza RNasi riscaldando a >200 °C per 1 ora o più. Nota: la sterilizzazione a vapore non distrugge la RNasi. In alternativa, pulire con una soluzione di decontaminazione RNasi, quindi con etanolo e asciugare all'aria senza RNasi al 70%.
   3. Pulire i piani di banco, altre superfici di laboratorio e micropipettori con soluzione decontaminante RNasi, quindi con etanolo 70% privo di RNasi. Designare un banco di laboratorio o un'area di lavoro specifica per il recupero e l'analisi dell'RNA. Nota: rimuovere gli espulsori di punta prima di pulire gli alberi dei pipettor e lasciarli fuori, se possibile.
   4. Utilizzare tubi, tubi a microcentrifugo, pipette e punte di micropipette certificate dal loro produttore come libere da RNasi. Si consiglia l'uso di punte di rilegatura e microtubi molto bassi. Se possibile, utilizzare scatole o sacchetti appena aperti di questi componenti e tenerli separati dalla fornitura generale di laboratorio.
   5. Ottenere soluzioni senza RNasi [PBS (PBS) privo di calcio e magnesio di Dulbecco, etanolo, etanolo 70% privo di RNasi] da fonti commerciali. Utilizzare bottiglie appena aperte per ogni esperimento.
2. La fonte del colorante Azure B è fondamentale per il successo del recupero dell'RNA intatto. Testare ogni lotto di colorante prima di impegnare campioni preziosi per la colorazione e la raccolta. Raccogli alcune migliaia di neuroni da un animale non sperimentale, prepara l'RNA e determina l'integrità dell'RNA come descritto di seguito per trovarne uno che produca costantemente numeri RIN superiori a 8,5.
   1. Sciogliere il colorante Azure B (1%, wt/vol) in etanolo senza RNasi al 70%, in genere 0,3 g in 30 ml di etanolo in un tubo di centrifuga da 50 ml. Mescolare bene su un rocker a RT durante la notte o fino a quando tutte le particelle si sono sciolte. Un tubo di questa soluzione può essere utilizzato per macchiare più diapositive senza influire sull'intensità di colorazione.
   2. Per precauzione, utilizzare un diverso tubo di macchia per ogni replica biologica.
3. Utilizzare i criomoldi e O.C.T. per incorporare sezioni di corde senza ulteriore trattamento.
4. Mantenere il criostato a -20-24 °C. Dopo la sessatura, posizionare le diapositive in un congelatore a -80 °C fino a quando non è stato preparato un numero sufficiente. Iniziare la preparazione dell'RNA il prima possibile dopo che le diapositive sono state fatte. Per la conservazione a lungo termine, mantenere i blocchi oct non sessati o parzialmente sessati, anziché le diapositive, a 80 °C.
5. Fare il tampone di tiocianato di guanidina per la preparazione dell'RNA dai motoneuroni sezionati utilizzando le soluzioni fornite dal produttore del kit di preparazione dell'RNA secondo le sue indicazioni.

2. Preparazione delle sezioni del midollo spinale dai topi (figura 1A)

1. Pulire tutti gli strumenti di dissezione, i vetrini, le lamette da barba e la piattaforma di dissezione cuocendo o pulendo con soluzione di decontaminazione RNasi, seguita da etanolo al 70% privo di RNasi. Lasciare asciugare per 2 minuti. Mantieni tutto privo di polvere coprendo con salviette da laboratorio.
2. Le procedure di trattamento degli animali, tra cui anestesia, perfusione cardiaca ed eutanasia, dovrebbero essere eseguite secondo i requisiti del comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali (IACUC), con l'obiettivo di portare rapidamente l'animale al punto di dissezione del midollo spinale.
   1. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale (ip) di una dose letale di ketamina (450 mg/kg).
   2. Una volta raggiunto un profondo livello di anestesia e confermato dalla mancanza di una risposta con le dita dei piedi, posizionare il lato ventrale del mouse su una piattaforma di dissezione (una tavola stirolo, ad esempio), aprire la cavità toracica per esporre il cuore e inserire l'ago a farfalla da 27 G di un'infusione impostata nel ventricolo sinistro (che si trova alla destra dell'investigatore). Intasare l'atrio destro con una flesso affilata e perfondere con PBS ad una velocità di 5-7 ml/min per circa 2 minuti utilizzando una pompa peristaltica. Il liquido che scorre dall'atrio dovrebbe essere in gran parte privo di sangue a questo punto.
   3. Rimuovere l'ago perfusione, decapitare il mouse e capovolgerlo sulla scheda di dissezione. Aprire la pelle per esporre la colonna vertebrale, utilizzare piccole forbici e pini per rimuovere le vertebre e sollevare il midollo spinale mentre si tagliano le radici nervose con una pinta affilata. Velocità e pratica sono essenziali per passare dall'inizio della perfusione alla rimozione del cavo; questo non dovrebbe richiedere più di 7 minuti.
   4. Risciacquare il cavo per 10 secondi in acqua priva di RNasi per lavare via qualsiasi sangue residuo. Posare il midollo spinale su uno scivolo di vetro privo di RNasi con una forza curva molto delicatamente ma rapidamente. Dividere il midollo spinale trasversalmente usando una lama di rasoio pulita in 9-10 pezzi.
   5. Posizionare i pezzi in un criomold riempito con O.C.T. usando le stesse pinie e allinearli verticalmente usando un ago pulito. Posizionare lo stampo in un vassoio poco profondo contenente 2-metilbutano preraffreddato con azoto liquido, quindi mettere il vassoio in un bagno di azoto liquido per congelare rapidamente i pezzi del midollo spinale per evitare la degradazione dell'RNA.
   6. Conservare il blocco incorporato nello Strumento di personalizzazione di Office a -80 °C per un massimo di 6 mesi prima della sezione. Il processo dal recupero del cavo attraverso il congelamento deve essere eseguito entro 5 minuti per mantenere l'integrità dell'RNA.
3. Criosezione del blocco incorporato O.C.T. a -20 °C con un criostato per produrre fette da 20 μm, ognuna contenente 9-10 sezioni trasversali del midollo spinale, su vetrini PEN-membrane 2 μm senza RNasi tenuti inizialmente a temperatura ambiente per garantire che le sezioni aderiscano allo scivolo. Ricongelare immediatamente la sezione su una superficie di -20 °C all'interno del criostato. Mantenere le diapositive a -80 °C fino a quando non vengono utilizzate.

3. Colorazione delle sezioni del midollo spinale (figura 1A)

1. Su un rack pulito, disporre sei tubi conici da 50 ml. Riempirli tutti con 25-30 ml di etanolo 70% privo di RNasi, in modo che la profondità sia sufficiente per coprire tutte le sezioni su una diapositiva quando lo scivolo è immerso. Crea 30-35 ml di soluzione Azure B all'1% come descritto in precedenza e tienila sullo stesso rack per ridurre al minimo il tempo tra la modifica delle soluzioni durante il lavaggio o la colorazione. Tenere tre o quattro salviette da laboratorio davanti al rack per drenare rapidamente la soluzione extra.
2. Togliere gli scivoli dal congelatore a -80 °C sul ghiaccio secco. Scongelare una diapositiva posizionandolo su un palmo guantato. Rimuovere la maggior parte dell'umidità e della condensa sullo scivolo pulerla con una salvietta da laboratorio, facendo attenzione a non toccare le sezioni. Mettere lo scivolo su essiccante fresco in gel di silice in una piastra di Petri per 30-40 secondi per asciugare completamente. Se l'umidità di laboratorio è elevata, è possibile utilizzare un breve trattamento in un essiccatore sottovuoto per asciugare lo scivolo più rapidamente.
3. Lavaggio e colorazione.
   1. Immergere lo scivolo essiccato nel primo tubo di etanolo senza RNasi al 70%. Immergere la diapositiva per 30 secondi, quindi lavare la diapositiva per rimuovere lo Strumento di personalizzazione di Office immergendola su e giù per 45-60 secondi . Togliere lo scivolo dalla soluzione e drenare il liquido in eccesso sulle salviette da laboratorio. Ripetere lo stesso processo immergere lo scivolo nel secondo tubo del 70% di etanolo. Se lo STRUMENTO di personalizzazione di Office intorno alle sezioni del midollo spinale non è completamente sparito, ripetere il lavaggio nel terzo tubo.
   2. Dopo aver drenare il liquido in eccesso, immergere lo scivolo in soluzione Azure B all'1% in etanolo privo di RNasi al 70% per 30-45 secondi. Scolare l'Azure B in eccesso su una cancellazione di laboratorio; a questo punto, l'intera diapositiva sarà blu.
   3. Immergere lo scivolo nel tubo successivo del 70% di etanolo e immergere rapidamente su e giù 3-4 volte per rimuovere il colorante in eccesso e rendere visibile la colorazione specifica del motoneurone. Se le sezioni sembrano molto macchiate, ripetere il passaggio di destaining in un tubo fresco di 70% di etanolo. Se la colorazione sembra troppo leggera, riportare la diapositiva alla soluzione Azure B per altri 30 secondi e ripetere la colorazione. Pulire l'etanolo in eccesso e asciugare all'aria lo scivolo per ~ 40 secondi fino a quando tutto il liquido non è sparito. La materia grigia sarà azzurra, mentre i motoneuroni saranno macchiati di blu intenso, che è facilmente visibile. Avviare immediatamente la dissezione.

4. Microdisezione di cattura laser (LMD) (Figura 1B)

1. Accendere il microscopio e scaricare il portatubi per fissare il tappo di un tubo di microfugo da 0,6 ml per la raccolta del campione. Mettere 30 μl di guanidina tiocianato lysis buffer nel tappo di un tubo di microfugo da 0,6 ml. Coprire la superficie del cappuccio con liquido diffondendo la soluzione utilizzando una punta di pipetta. In questo modo, tutti i neuroni raccolti verranno sciolti in soluzione solubilizzante man mano che vengono sezionati. Allineare il tappo al foro e l'obiettivo con il software del microscopio. Mantenere il cappuccio in posizione coperta fino all'avvio della cattura laser.
2. Posizionare lo scivolo essiccato all'aria sul palco del microscopio LMD capovolto, in modo che la membrana dello scivolo PEN sia a faccia in giù. La membrana con sezioni dovrebbe affrontare il foro, sotto il quale c'è il tubo di raccolta.
3. Accendere il laser 10 minuti prima di iniziare la preparazione dello scivolo. Concentrati su una sezione del midollo spinale con l'obiettivo 5X. Passare all'obiettivo 20X per la dissezione.
   1. Contrassegnare una regione "fittizia" con la penna leggera e consentire al laser di ritagliarla senza raccoglierla. Questo rilassa la membrana PEN e consente di contrassegnare e tagliare più regioni successivamente.
   2. Rifocalizzare e identificare i motoneuroni nella regione del corno ventrale. Questi neuroni sono riconoscibili per la loro posizione, la loro morfologia piramidale, le loro grandi dimensioni e la loro colorazione blu scuro con Azure B (Figura 2).
   3. Utilizzando la penna leggera, selezionare lo strumento di disegno e contrassegnare lungo il bordo dei motoneuroni, facendo un contorno completo. Cerca di rendere il contorno il più vicino possibile al motoneurone per evitare la contaminazione da cellule diverse dal motoneurone. (Testare alcune sezioni in anticipo per vedere quanto è larga la linea di taglio laser e regolare il gioco in base alle esigenze.) Contrassegnare più celle prima del taglio; il software ricorderà le posizioni.
   4. Portare il tappo sotto la posizione di taglio cliccando sulla posizione del cappuccio. Fare clic sul pulsante start per avviare la dissezione del motoneurone con il laser. Raccogli tutti i motoneuroni da tutte le sezioni su uno scivolo nel tappo di un tubo di microfugo.
   5. Al termine della raccolta, togliere il tubo di microfugo dal supporto scaricando il vassoio e slogando delicatamente il tubo. Sciogliere completamente i motoneuroni nel tampone pipettando la soluzione su e giù. Spostare la soluzione nel corpo del tubo centrifugando a 14.000 x g per 2 min a 4 °C. Congelare immediatamente il campione nel ghiaccio secco e conservarlo a -80 °C. Questo processo, dalla colorazione dello scivolo attraverso la raccolta dei motoneuroni, deve essere eseguito entro 30 minuti per una diapositiva per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA.

5. Preparazione dell'RNA dai motoneuroni

Scongelare tutti i neuroni raccolti da un animale e metterli insieme per estrarre l'RNA. I campioni possono apparire blu pallido a seconda del numero di motoneuroni (macchiati con Azure B) in essi. Estrarre l'RNA utilizzando un kit adatto secondo il protocollo previsto per il tessuto LMD, eluendo nel volume minimo possibile. Prendere 1 μl per verificare la quantità e l'integrità del campione. Congelare rapidamente l'RNA rimanente sul ghiaccio secco e conservare a -80 °C.

6. Determinazione della qualità e della quantità dell'RNA

Determinare la qualità dell'RNA con il campione da 1 μl su un chip microfluidica di elettroforesi capillare secondo il protocollo del produttore. I preparati totali di RNA con un numero di integrità dell'RNA (RIN) superiore a 8,5 possono essere utilizzati per RNA-seq e qRT-PCR. L'output dei dati include anche in genere la concentrazione approssimativa del campione.

Results

Il protocollo sopra descritto e nella figura 1 dovrebbe produrre 50 ng o più di RNA totale con un RIN di >8,5 da 3.000-4.000 corpi cellulari del motoneurone del midollo spinale sezionati dalle fette da 9-10 20 μm su circa 20 diapositive PEN. Poiché questo numero di diapositive rappresenta meno del 10% di un blocco incorporato o.C.T. di un midollo spinale del mouse, è possibile tornare al blocco, che è stato memorizzato a -80 °C, e tagliare più fette per passare attraverso un altro ciclo di preparazione dell'RNA. Se sono necessarie maggiori quantità di RNA per un'analisi, è meglio fare solo il numero di diapositive (ad esempio 20)contemporaneamente che possono essere elaborate attraverso la dissezione e la preparazione dell'RNA in pochi giorni, quindi fare più diapositive per un secondo round e combinare i prodotti. Assicurati prima di controllare il RIN di ogni preparazione per evitare di combinarne uno buono con un cattivo. I metodi RNA-seq stanno diventando più sensibili e le nuove tecnologie PCR promettono una sensibilità maggiore rispetto a quelle attuali. Pertanto, sarà richiesto meno RNA da meno corpi cellulari neuronali, consentendo una maggiore profondità di sequenziamento e una convalida più completa di colpi interessanti. D'altra parte, la piena aderenza alle raccomandazioni MIQE per l'analisi e la convalida qRT-PCR^{4 può} richiedere quantità maggiori per consentire le reazioni di controllo necessarie per gli RNA a bassa abbondanza.

La figura 2 mostra una serie tipica di immagini di una porzione di sezione del corno ventrale del midollo spinale dopo la colorazione e la dissezione di Azure B. Nel pannello A, i corpi cellulari grandi e macchiati di scuro sono motoneuroni, confermati dalla colorazione²degli anticorpi anti-Chat , e sono facilmente differenziabili dalle cellule vicine più piccole. Il pannello B mostra la stessa regione con i singoli corpi cellulari delineati con la penna luminosa e numerati dal software del microscopio. I contorni seguono da vicino i margini dei corpi cellulari, con una piccola tolleranza per la larghezza di taglio del laser. Questa spaziatura deve essere determinata per ogni impostazione di potenza laser per ridurre al minimo l'inclusione di materiale estraneo evitando la perdita di citosolo del motoneurone. I pannelli C e D mostrano la sezione dopo che il laser ha tagliato e i singoli corpi cellulari sono caduti nel cappuccio di raccolta. Si noti che il margine di taglio non segue esattamente il contorno della penna leggera nel pannello C, ma rimane in gran parte al di fuori di esso. Questa irregolarità è evidente nel pannello D, così come l'area oscurata intorno ad ogni taglio, che riflette il danno termico al tessuto causato dal laser. Per questo motivo, se due corpi cellulari sono molto vicini l'uno all'altro, è meglio delinearli per un singolo taglio, piuttosto che cercare di tagliarli separatamente e perdere un po 'di RNA per danneggiare il calore nella loro regione di contatto ravvicinato.

La figura 3 mostra i risultati tipici di un'analisi elettroforetica dell'integrità dell'RNA di un campione di RNA preparato da ~4.000 corpi cellulari del motoneurone del topo raccolti dall'LMD. Il pannello superiore è l'elettroferogramma prodotto da 1 μl dell'RNA totale; l'inserto a destra è un'immagine del gel. In entrambi, si notano i picchi di RNA ribosomiale prominente. Il pannello inferiore è l'elettroferogramma della corsia contenente gli standard di dimensione dell'RNA. Il software di analisi ha calcolato un RIN di 9,8 per questo campione, con una concentrazione di 4,9 ng/μl. Un totale di 13 μl di questa soluzione era disponibile dopo l'analisi, fornendo 64 ng di RNA per la convalida qRT-PCR a valle degli importi di trascrizione. Per una tipica analisi qRT-PCR di trascrizioni moderatamente abbondanti, 0,15-0,20 ng di RNA totale è sufficiente per produrre una quantificazione accurata², quindi la quantità di RNA disponibile da questa preparazione è sufficiente per convalidare un certo numero di trascrizioni con più set di primer, come^{raccomandato 4}. Naturalmente, grandi quantità di RNA di input possono essere utilizzate per consentire la convalida di trascrizioni rare. Questa quantità è anche più che sufficiente per consentire la preparazione della libreria e l'RNA-seq di nuova generazione.

Figura 1. Panoramica della produzione di fette del midollo spinale e della microdissezione di cattura laser dei corpi cellulari dei motoneuroni del midollo spinale. A)Principali fasi di produzione e colorazione delle fette. B)Vista cartoon della sezione del midollo spinale e dissezione laser. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande. 

Figura 2. Immagini prima e dopo di una dissezione laser dei corpi cellulari dei motoneuroni macchiati di Azure B. A) Una porzione del corno ventrale di una sezione macchiata. Si notano le quattro grandi celle macchiate di scuro. Ci sono anche alcune cellule leggermente macchiate e un po ' più piccole, che non sono motoneuroni (confermati dalla colorazione degli anticorpi anti-Chat; non mostrati, ma vedi Bandyopadhyay²) e che non saranno selezionati per la dissezione. Le molte piccole macchie scure sono probabilmente processi neuronali (dendriti e assoni), ma questo non è stato confermato. B) I quattro corpi cellulari delineati con la penna leggera. Si noti che i contorni seguono da vicino i margini delle celle, con una distanza minima tra di esse. Questa spaziatura dovrebbe essere stabilita empiricamente per ogni microscopio e laser. Il software conta i singoli neuroni, il che semplifica la tenuta traccia di quanti sono stati raccolti. C e D) Dopo che il laser ha tagliato e i pezzi contenenti i corpi cellulari sono caduti nel cappuccio di raccolta. Si noti che il foro lasciato dietro è un po 'più grande del contorno ed è irregolare. Ciò riflette la larghezza del raggio laser e la sua efficienza di taglio leggermente variabile a seconda della composizione locale del tessuto. È evidente anche il bordo del tessuto oscurato che circonda ogni foro a causa dei danni al riscaldamento locale causati dal laser. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figura 3. Analisi elettroforetica dell'integrità dell'RNA preparata da campioni LMD. A) Un'aliquota di 1 μl dell'RNA preparata da ~4.000 corpi cellulari dei motoneuroni dal protocollo precedente è stata analizzata mediante elettroforesi microcapillare su un chip microfluidica. L'elettroferogramma è mostrato, con picchi di RNA ribosomiale prominenti. A destra c'è un'immagine del gel stesso. B)Viene mostrato l'elettroferogramma degli standard di dimensione, con la corrispondente corsia di gel a destra. Il software dello strumento ha calcolato un RIN di 9,8 per questo campione e una concentrazione di 4,9 ng/μl. Fare clic qui per visualizzare un'immagine più grande.

Discussion

La misura più significativa di successo di questo protocollo per la produzione di RNA totale mediante microdisezione laser delle fette del midollo spinale è il valore RIN⁵. Per i campioni di RNA provenienti da eucarioti più elevati, valori superiori a 8,5 producono regolarmente sequenziamento di alta qualità e dati qRT-PCR. Se la resa è bassa ma la qualità è alta, ripetere la preparazione. Se l'integrità è inferiore (anche 7,5-8), tuttavia, è meglio trovare la fonte del problema e riprovare. Ci sono molti passaggi in cui qualcosa può andare storto, ma in realtà solo due fonti del problema: la contaminazione endogena della RNasi o la contaminazione esogena della RNasi. Il primo può essere affrontato dalla pratica, in modo che il tempo dal sacrificio del mouse al congelamento del suo cavo incorporato O.C.T sia ridotto al minimo. L'altro punto del protocollo in cui la RNasi endogena può contribuire a un risultato scadente è durante la preparazione delle fette. Ogni fetta dovrebbe aderire rapidamente a una diapositiva PEN a temperatura ambiente, ma si scioglierà (l'O.C.T diventa chiaro). Più velocemente la fetta può essere rifozen, meglio è. Il criostato che usiamo ha superfici piane all'interno della camera che sono a -20 °C, che usiamo per ricongelare rapidamente la fetta. Trova un punto simile nel criostato utilizzato e assicurati che la fetta diventi di nuovo opaca rapidamente.

Rintracciare le fonti di RNasi esogena può essere difficile, perché ci sono così tante possibilità. Gli unici reagenti utilizzati che non sono espressamente liberi da RNasi sono O.C.T. e Azure B. Se Azure B ha funzionato in modo soddisfacente in precedenza, provare una bottiglia fresca di O.C.T., anche se questo reagente non è mai stato un problema. Anche i reagenti senza RNasi possono essere sostituiti, anche da un fornitore diverso. Una fonte molto più probabile è l'investigatore. Oltre a una pulizia accurata dell'area di lavoro, è spesso utile che un altro membro del laboratorio segua e osservi tutti i passaggi della procedura. Anche se si tratta di una persona che non esegue regolarmente questa procedura, un nuovo set di occhi può raccogliere una fonte di contaminazione altrimenti inosservata.

L'estensione di questo protocollo al recupero dell'RNA da altre cellule del midollo spinale, dalle cellule del midollo spinale di altre specie o da tipi di cellule specifiche in altri organi richiederà modifiche in diverse aree volte a ottenere una chiara identificazione delle cellule di interesse evitando, o almeno minimizzando, l'impatto della RNasi endogena. Nel protocollo qui, la rapida rimozione e congelamento del cavo, insieme alla colorazione Azure B in etanolo al 70%, ha permesso sia la minimizzazione della degradazione dell'RNA che la facile identificazione dei corpi cellulari dei motoneuroni. Azure B è una macchia istochimica ben consolidata per i neuroni che sembra legarsi all'RNA³ ed è stata utilizzata per valutare il contenuto di RNA dei neuroni nei campioni di autopsia del tessuto cerebrale da pazienti con malattia neurodegenerativa⁶. In particolare, la colorazione di Azure B non ha influito né sull'integrità dell'RNA purificato né sulla sua capacità di essere trascritta e analizzata inversamente. Altri coloranti, come il cresyl violet⁷ e il toluidina blue⁸ sono stati utilizzati in protocolli LMD simili. La raccolta dei corpi cellulari direttamente nella soluzione di tiocianato di guanidina mentre venivano sezionati ha fornito il passaggio finale che ha portato al recupero di routine dell'RNA intatto.

Approcci simili possono essere previsti per altre cellule e organi, riconoscendo che identificare le cellule di interesse riducendo al minimo o, preferibilmente, prevenendo la degradazione dell'RNA da parte delle RNasi endogene è il requisito fondamentale per un'analisi di successo. Nei tessuti che hanno alti livelli di RNasi, come il pancreas, la manipolazione rapida e la bassa temperatura sono stati combinati per consentire il recupero dell'RNA da β-cellule, sfruttando la loro autofluorescenza naturale per la visualizzazione⁹. Anche le procedure che utilizzano la colorazione degli anticorpi per^{l'identificazione sono state riportate 10}, ma non hanno avuto pieno successo nelle nostre mani. Infine, sono disponibili molti modelli ditopi che esprimono proteine di fusione fluorescenti (ad esempio GFP, YFP, RFP) in cellule di interesse, che potrebbero essere utilizzate per identificarle in sezioni tissutali al microscopio LMD. Infatti, i ceppi di topi che abbiamo analizzato con questo protocollo esprimono una proteina di fusione tra SOD1 e YFP¹¹e i loro motoneuroni del midollo spinale sono altamente fluorescenti. Non siamo stati in grado, tuttavia, di trovare una serie di lavaggi di etanolo e / o condizioni di disidratazione che rimuovevano simultaneamente l'O.C.T., inibiscono l'attività della RNasi e mantenevano costantemente una fluorescenza YFP sufficiente per consentire la visualizzazione dei motoneuroni e il loro recupero da parte dell'LMD. Forse una nuova proteina fluorescente o una variante di quelle disponibili che mantiene la fluorescenza nei solventi organici possono essere trovate per superare questa limitazione.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamina	Webster Veterinary	26637041101	Qualsiasi fonte approvata dal servizio veterinario istituzionale
Strumenti di dissezione (forbici, pinze,  ecc.)			Qualsiasi fonte conveniente di strumenti di dissezione di alta qualità
Criostato	Leica Microsystem	CM3050S	Altri criostati dovrebbero essere adatti
LMD6000 B	Leica Microsystem		Altri sistemi LMD non sono stati testati
Membrana PEN priva di RNasi 2 μ m diapositive	Leica Microsystem	11505189	Altri tipi di vetrini sono stati testati e non funzionano bene
RNeasy Micro kit (50)	Qiagen	74004	Qualsiasi kit che utilizza il tampone di lisi del tiocianato di guanidina ed è stato testato per il recupero di piccole quantità di RNA può essere utilizzato
Agilent 2100 BioAnalyzer	Agilent Technologies	G2939A
Azure B Certified	MP Biomedicals	190520	Critico! Il prodotto proveniente da qualsiasi fonte deve essere testato prima dell'uso per la sua capacità di mantenere l'integrità dell'RNA
PBS	Sigma Life Science	D8537	Qualsiasi fonte affidabile di RNA PBS privo di RNasi
Etanolo 70% (prodotto con acqua trattata con DEPC)	American Bioanalytical	AB04010-00500	Qualsiasi fonte affidabile, può essere prodotta in laboratorio
Acqua, senza RNasi, Endotossina testata (trattata con DEPC per eliminare l'RNasi)	American Bioanalytical	AB02128-00500	Qualsiasi fonte affidabile, può essere prodotta in laboratorio
RNasi AWAY	Invitrogen Life Technologies	10328-011	Altri reagenti simili per la rimozione della RNasi, come RNaseZAP (anche da Invitrogen) possono essere utilizzati
2-metilbutano	Microscopia elettronica Sciences	78-78-4	Qualsiasi fonte
Maxymum Recovery provette per microfugo (0,6 e 1,5 ml) e puntali per pipette	Axygen	311-03-051 & 311-09-051	Provette e puntali a bassissima ritenzione, privi di RNasi; testare i prodotti di altri produttori prima di utilizzare
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Cryomold Intermediate Size	Tissue-Tek	4566
Salviette da laboratorio (Kimwipes)	KIMTECH	34155