FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

Summary

Una descrizione di come calibrare trasferimento Förster Resonance Energy sensori biologici integrati (FIBS) per in situ profilo metabolico è presentato. Le FIBS possono essere utilizzati per misurare i livelli intracellulari di metaboliti non invasivo aiutando nello sviluppo di modelli metabolici e high throughput screening delle condizioni bioprocesso.

Abstract

Nell'era della biologia computazionale, i nuovi sistemi sperimentali ad alto rendimento sono necessarie per compilare e perfezionare i modelli in modo che possano essere convalidati a fini predittivi. Idealmente tali sistemi sarebbero basso volume, che preclude campionamento e analisi distruttive quando i dati del corso tempo si vogliono ottenere. Ciò che occorre è un strumento di monitoraggio in situ che possono comunicare le informazioni necessarie in tempo reale e in maniera non invasiva. Un'opzione interessante è l'uso di fluorescente, sensori biologici in vivo segnalanti concentrazioni intracellulari base di proteine. Una classe particolare di biosensori in vivo che ha trovato applicazioni in metabolita quantificazione si riferiscono al trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) tra due proteine ​​fluorescenti collegati da un dominio di legame al ligando. FRET sensori biologici integrati (FIBS) sono costitutivamente prodotte all'interno della linea cellulare, hanno tempi di risposta veloci e il loro cha spettralestiche variare in funzione della concentrazione del metabolita all'interno della cellula. In questo documento, il metodo per la costruzione di ovaio di criceto cinese (CHO) linee cellulari che esprimono costitutivamente un FIBS per il glucosio e glutammina e calibrare le FIBS in vivo in coltura cellulare in batch per consentire futuro quantificazione della concentrazione di metabolita intracellulare è descritto. I dati di fed-batch colture di cellule CHO dimostra che i FIBS è stato in grado in ogni caso a rilevare il conseguente cambiamento della concentrazione intracellulare. Utilizzando il segnale fluorescente dalle FIBS e la curva di taratura precedentemente costruita, la concentrazione intracellulare è stata determinata con precisione come confermato mediante saggio enzimatico indipendente.

Introduction

Monitoraggio metabolita ha varie applicazioni in bioprocessi, compreso lo sviluppo di processo, media e il design dei mangimi, e l'ingegneria metabolica. Vari metodi sono disponibili per le misure di concentrazione attraverso l'uso di ¹ enzimatica, chimico ^2, o saggi di legame ^3. Un'opzione interessante è l'uso di fluorescente, sensori biologici in vivo come reporter della concentrazione intracellulare di metaboliti principali a base di proteine. In saggi ultra-basso volume, fluorescenza è uno strumento utile come miniaturizzazione migliora anche il rapporto ^4,5 segnale-rumore e sensori a base di proteine ​​può essere geneticamente codificato senso che non reagenti esogeni sono necessari per l'analisi metabolita. Trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) biosensori costituiti da due proteine ​​fluorescenti collegati da un dominio di legame al ligando. FRET è un trasferimento nonradiative di energia da un donatore foto-eccitati per un accettore fluorescente molecola Locat Ed in prossimità (<100). Ligando clivaggio o vincolante provoca un cambiamento conformazionale nel sensore, che, a sua volta, induce un cambiamento in prossimità dei fluorofori, portando ad un cambiamento di efficienza FRET misurata dalla variazione dello spettro di emissione. Sensori biologici FRET integrati (FIBS) sono costitutivamente prodotte all'interno della linea cellulare e le loro caratteristiche spettrali variare in funzione della concentrazione del metabolita all'interno della cellula. FIBS hanno tempi di risposta veloci che li rende ideali per prendere le misure per i modelli dinamici ^6. Applicazioni precedenti includono il monitoraggio singole ^7-9 e più ^{di 10} metaboliti e fornendo dati sulla distribuzione spazio-temporale ^11. FIBS possono essere creati in due configurazioni: Apo-Max, dove legame del ligando interrompe la vicinanza dei fluorofori abbassamento trasferimento di energia e Apo-Min, dove legame ligando porta i due fluorofori in più stretto contatto (Figura 1).

_content "> In questo lavoro, un protocollo è presentato per la costruzione di ovaio di criceto cinese (CHO) linee cellulari che esprimono costitutivamente un FIBS per un metabolita, glucosio o glutammina. Una metodologia è stabilito per la calibrazione del sensore in vivo per abilitare futuro quantitativa misure di concentrazione metabolita intracellulare, come illustrato nella figura 2. Sulla base di questo, la concentrazione intracellulare di glucosio o glutammina può essere determinato in fed-batch colture di cellule CHO, a cui i due nutrienti sono stati aggiunti in alte concentrazioni in-process. I risultati dimostrano che utilizzando il segnale fluorescente dalle FIBS e la curva di taratura precedentemente costruita, accuratamente previsione della concentrazione intracellulare è possibile, come confermato mediante saggio enzimatico indipendente. Questo metodo offre notevoli vantaggi rispetto alle attuali tecnologie analitiche perché è invasiva, a basso costo e veloce, dando un segnale in tempo reale dei FIBS che possono essere monitored tutta la cultura.

Protocol

1. Cella linea Revival e manutenzione

1. Revive cellule CHO in 9 ml CD-CHO medio integrato con 8 mM L-glutammina e 10 ml / L integratore 100x ipoxantina / timidina (terreno di coltura completo).
2. Centrifugare a 100 xg per 5 min.
3. Risospendere le cellule in 10 ml di fresco mezzo di crescita integrale.
4. Rimuovere un campione di 1 ml e determinare la concentrazione di cellule vitali mediante microscopio ottico utilizzando il metodo esclusione del colorante blu tripano in un emocitometro.
5. Avviare una coltura ad una densità di semina di 3 x 10 ⁵ cellule / ml in 125 ml agitare palloni.
6. Mantenere la cultura in un incubatore a 37 ° C, atmosfera umidificata al 5% CO _2, su un agitatore orbitale rotante a 120 rpm.
7. Subcuture ogni 3-4 giorni nel mezzo di crescita completo ad una densità di semina di 2 x 10 ⁵ cellule / ml.

2. La trasfezione della linea cellulare con il plasmide Containing il biosensore Gene

1. Preparare DNA plasmidico utilizzando un kit di purificazione plasmide larga scala.
2. Mantenere celle in condizioni appropriate (37 ° C, 5% CO ₂₎ 12-24 ore prima della trasfezione per garantire le cellule sono attivamente dividono al momento della transfezione.
3. Contare le cellule utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu tripano, quindi preparare un volume utile di 20 ml di coltura cellulare in un matraccio da 125 ml agitare ad una concentrazione di 1 x 10 ⁶ cellule / ml.
4. Utilizzare un kit di transfezione adatto per la linea cellulare in uso. Il DNA plasmidico rapporto reagenti di transfezione sarà dipendente dalla linea cellulare e il vettore. Si raccomanda che questa è ottimizzato testando una serie di rapporti entro l'intervallo specificato dal fabbricante prima di effettuare le trasfezioni finali. Anche mantenere almeno una coltura di controllo negativo contenente le cellule ma non DNA.
5. Incubare per 4 giorni in modalità statica e quindi il trasferimento a un Shakipiattaforma ng rotante a 125 rpm.
6. Aggiungere l'antibiotico appropriato per la selezione plasmide ad una concentrazione adatta come determinato da una curva uccisione. In questo studio, Zeocin stato aggiunto ad una concentrazione finale di 400 mg / ml per la selezione delle cellule trasfettate.
7. Cambiare media a un intervallo di tempo adeguato per la linea cellulare, aggiungendo antibiotici ogni volta, fino a quando le cellule in pozzetto di controllo sono morti.
8. Utilizzare i pozzi più confluenti a progredire a scuotere le culture.
9. Istituire una banca di cellule congelando le cellule in fiale criogeniche contenenti 10 ⁷ cellule vitali in 1 ml di mix di congelamento. In questo lavoro, questo è costituito da 92,5% mezzo di crescita e 7,5% dimetilsolfossido.

3. Batch e fed-batch curva di crescita cellulare

1. Seguire le istruzioni per la manutenzione cella sopra stabilire colture cellulari triplicato di cellule CHO trasfettate in 250 ml agitare beute con un volume utile di 50 ml.
2. Mantenere la culres in un incubatore umidificato cella a 37 ° C, con 5% di CO _2, su un agitatore orbitale rotante a 125 rpm, e rimuovere 4,1 ml campioni di ciascuna coltura in crescita ad intervalli di 24 hr.
3. Utilizzare 100 ml di campione per determinare la fattibilità di concentrazione cellula e cellula vitale con l'azzurro metodo di esclusione Tripan.
4. Ripetere finché la concentrazione di cellule vitali è ridotto a zero.
5. Ripetere l'operazione per le colture cellulari fed-batch che completa con la giusta quantità di glucosio o di glutammina il giorno 6 a ripristinare le concentrazioni ai valori iniziali di 36 e 4 mm, rispettivamente. Si raccomanda che colture di controllo aggiuntive sono anche mantenuti, che devono essere alimentati con lo stesso volume (12 ml in questo caso) di acqua pura.

4. FRET Rapporto Misure

1. Prendere 2 ml dei campioni giornalieri rimosse al punto 3.2 sopra e centrifugare a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C.
2. Resuspterminato il pellet di cellule in 2 ml di ghiaccio freddo fosfato salino (PBS). Trasferire questa in una piastra da 6 pozzetti e aggiungere il campione in bianco che non contiene cellule ad un pozzetto.
3. Misurare i livelli di fluorescenza blu e giallo subito a una lunghezza d'onda di eccitazione di 430/435 nm e di emissione lunghezze d'onda di 465/435 nm (blu) e 520/510 nm (giallo).
4. Calcolare i rapporti FRET (rapporto di fluorescenza gialla rilevato sopra fluorescenza blu rilevato).

5. Metabolita Saggi

1. Prendere 2 ml dei campioni giornalieri rimosse al punto 3.2 sopra e centrifugare a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
2. Risospendere il pellet di cellule in 3 ml di PBS freddo ghiaccio e centrifugare di nuovo a 100 xg per 5 min.
3. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di PBS freddo ghiaccio come sopra. Sonicare il 5x campione per 3 minuti ciascuno in un impulso di 15 secondi su e 15 sec off. A questo punto, la cella supplementarects possono essere congelati se lo si desidera.
4. Utilizzare un kit di analisi glucosio appropriato secondo le istruzioni del fabbricante su campioni di estratti cellulari per determinare la concentrazione di glucosio intracellulare (vedi tabella dei materiali).
   Nota: utilizzare norme adeguate per costruire una curva standard. In questo lavoro, la concentrazione degli standard varia tra 0-100 mm.
5. Usando le letture per gli standard, costruire la curva standard e trovare l'equazione lineare di best fit (in questo caso: y = 1310.51x - 723,43 dove y è la lettura di assorbanza e x è la concentrazione di glucosio).
6. Calcolare le concentrazioni di glucosio utilizzando la curva standard e prendendo la diluizione in considerazione. La concentrazione di glucosio intracellulare può quindi essere calcolato usando questa equazione:
   
   Per le cellule CHO, il volume singola cella è stato calcolato utilizzando una cella diametro di 12 pM ¹²
7. Utilizzare un kit di analisi glutammina appropriato secondo le istruzioni del fabbricante su campioni di estratti cellulari per determinare la concentrazione intracellulare glutammina (vedi tabella dei materiali).
   Nota: utilizzare norme adeguate per costruire una curva standard. In questo lavoro, la concentrazione degli standard variava tra 0,2 mm.
8. Come in 5.5 sopra, la curva di calibrazione (in questo caso y = 203.1x + 17.1 dove y è la lettura dell'assorbanza e x è la concentrazione di glucosio)
9. Usando la curva standard, calcolare la concentrazione glutammina dei campioni, tenendo conto della diluizione. La concentrazione intracellulare glutamina può essere calcolato utilizzando l'Equazione 1 di cui sopra.

Results

Una panoramica della metodologia è presentato in Figura 2. Nel lavoro qui presentato, cellule CHO sono state transfettate con il vettore FIBS e linee cellulari stabili sono stati selezionati con una pressione antibiotico di 400 mcg / ml Zeocin. Due linee separate cellulari stabili esprimenti costitutivamente i sensori di glucosio e glutammina sono stati quindi creati. Figura 1 illustra le configurazioni delle due biosensori utilizzati in questo studio. Il sensore di glucosio si basa sul...

Discussion

Le FIBS permettono in vivo e in situ quantificazione di molecole chiave, in questo caso nutrienti crescita limitativo, eliminando incertezze derivanti da tempra e metodi di estrazione. I risultati suggeriscono che vi è una buona correlazione tra il segnale FIBS e le concentrazioni intracellulari nell'intervallo 1-5 mM di glucosio e 0,3-2 mM di glutammina. Nel lotto coltura cellulare CHO, queste concentrazioni si incontrano nelle fasi di declino esponenziale, stazionarie, e le prime. Le fasi esponen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	varierà a seconda degli obiettivi dello studio
vettore pCDNA4/TO	Life Tecnologies
TransIT-PRO Reagente per trasfezione	Mirus Bio	MIR 5700	Le trasfezioni possono essere effettuate utilizzando qualsiasi metodo adatto alla linea cellulare in studio
Zeocin	Invivogen
CD-CHO medium	Life Technologies	10743-011	Il mezzo di crescita cellulare dipende dalle cellule in studio
100x HT Supplement	Life Tecnologie	11067-030
L-Glutammina 200 mM (100x), Liquid	Life Technologies	25030032
Lettore di piastre InfinitePRO 200	Tecan	FLx800TBI	Qualsiasi lettore di piastre a fluorescenza a 96 pozzetti in grado di accedere alle lunghezze d'onda richieste può essere sostituito
Filtri per lettore di piastre
Maxiprep	Qiagen	12163	Qualsiasi kit adatto può essere sostituito Amplex
Kit per il dosaggio del glucosio/glucosio ossidasi rosso	Invitrogen	A22189	Qualsiasi kit adatto può essere sostituito
EnzyChrom  Kit per il dosaggio della glutammina	Sistemi di analisi biologica	EOAC-100	Qualsiasi kit adatto può essere sostituito
Emocitometro Neubauer migliorato	Fisher Scientific	MNK-420-010N
Incubatore	Nuaire	NU-5510E