Biology

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

Published: September 29, 2014 doi: 10.3791/51469

Lynne Turnbull*¹, Michael P. Strauss*¹, Andrew T. F. Liew¹, Leigh G. Monahan¹, Cynthia B. Whitchurch¹, Elizabeth J. Harry¹

¹The ithree Institute, University of Technology, Sydney

* These authors contributed equally

Abstract

הדמיה של דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי התקדמה באופן משמעותי בטכנולוגיות חדשות כדי להתגבר על מחסום הרזולוציה של דיפרקציה של אור המאפשר רזולוציה סופר של דגימות חיות. כרגע יש שלושה סוגים עיקריים של טכניקות ברזולוציה סופר - דלדול פליטה מאולץ (STED), מיקרוסקופיה מולקולה בודדת לוקליזציה (כולל טכניקות כגון PALM, STORM, וGDSIM), ומיקרוסקופיה המובנה תאורה (SIM). בעוד טכניקות לוקליזציה-מולקולה בודדת STED ולהראות העליות הגדולות ביותר ברזולוציה, הם היו איטיים יותר מה להציע מהירויות מוגברות של רכישת תמונה. SIM תלת ממדי (3D-SIM) הוא טכניקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב שמציעה מספר היתרונות על פני שתי לוקליזציה מולקולה בודדת וSTED. רזולוציה משופרת, עם רזולוציות טיפוסיות לרוחב והצירי של 110 ו280 ננומטר, בהתאמה ובעומק של דגימה של עד 30 מיקרומטר מcoverslip, המאפשרתהדמיה של תאים שלמים. הפיתוחים אחרונים (מהיר 3D-SIM) בטכנולוגיה להגדיל את שיעור הלכידה של תמונות גולמיים מאפשרים לכידה מהירה של תהליכים ביולוגיים המתרחשים בשניות, תוך צמצום צילום רעילות וphotobleaching משמעותי. כאן אנו מתארים את השימוש בשיטה אחת כזו לתמונת תאי חיידקיים מחסה חלבון fluorescently שכותרת cytokinetic FtsZ להראות כיצד תאים מנותחים והסוג של מידע ייחודי שטכניקה זו יכולה לספק.

Introduction

מספר טכנולוגיות הדמיה שונות שימש במשך השנים ללמוד חיידקים כוללים אלקטרונים שונים וטכניקות מיקרוסקופיה אופטיות. בעוד במיקרוסקופ אלקטרונים מציע רזולוציה גבוהה ביותר, עד לננומטר, את הצורך בואקום ושימוש בחומרי ניגוד מוגבל בטכניקה זו כדי דגימות קבועות ומוטבעות. יכולים גם להיות הציגו חפצים בשל הכנת מדגם ארוכה ויש צורך ברופא מיומן כדי להכין את הדגימות, וכדי לנתח ולפרש את התמונות וכתוצאה מכך. מיקרוסקופיה אופטית מציעה את היתרונות של הכנת מדגם פשוט והיישום של תוויות מרובות בקלות יחסית בהשוואה למיקרוסקופ אלקטרונים. שימוש בחלבוני ניאון וconjugates צבע, היכולת ללמוד תאי חיים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא גם אפשרי. עם שיפורים ביציבות בfluorophore וגודל / מבנה חלבון פלואורסצנטי המוביל לירידה ברעילות תאים, כמו גם התקדמות בtechn זיהוי מצלמהology, מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות שדה רחב ומערכות הדמיה confocal הרחיב באופן משמעותי את ההבנה של הדינמיקה המרחבית של תאים שלנו. שימוש בשיטות אלה, הידע שלנו על תא חיידק -20 השנים האחרונות התקדם מאוד להשקפה הרבה יותר מפורטת שמגלה רמה גבוהה של ארגון מבני וחלבונים בתוך תא חיידק ^1.

עם זאת, בשיטות מקובלות של מיקרוסקופיה אופטית הן עקיפה מוגבל, מה שאומר שהרזולוציה הטבועה היא כמחצית מאורך הגל של אור העירור משמש. כתוצאה מכך, אפילו עם מערכת מיקרוסקופיה אופטית הקונבנציונלית האופטימלית ביותר, ברזולוציה הרוחב הטובה ביותר הוא על 220-250 ננומטר והרזולוציה הצירית היא כ -500 ננומטר (לסקירה ראה Schermelleh et al. ^2). לביולוגים של תא חיידקים בפרט, זה עדיין מגביל את ההבנה של הארגון המרחבי של תאים הזעירים אלה שלנו; להיות 1-2 מיקרומטר רק בקוטרeter ו1-10 מיקרומטר באורך. יש גם צורך בטכניקות ברזולוציה גבוהה יותר שניתן לבצע על תאי חיים שבו התנהגות מרחבית דינמית של חלבון יכולה להיות מנותחת על מנת להשלים בנתונים חוץ גופית.

במהלך העשור האחרון, מספר טכניקות דימות פלואורסצנטי ברזולוציה הסופר פותחו. מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר מתארת טכניקות הדמיה שכפולות לפחות הרזולוציה לרוחב השגה עם מיקרוסקופ אור הקונבנציונלית, ובכך להתגבר על המחסום העקיפה. טכניקות אלו לתפעל את התאורה ו / או ניתוח של האור הנפלט כדי ליצור עליות ריאליות ברזולוציה הנראית לעין. כרגע יש שלושה סוגים עיקריים של טכניקות ברזולוציה סופר - i) מגורה מיקרוסקופיה דלדול פליטה ³ (STED); ii) מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת, כולל טכניקות כגון מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivation ^4,5 (PALM), מיקרוסקופיה שיקום האופטית סטוכסטיים 7 (dSTORM), והקרקע עם תשואת מולקולה בודדת ⁸ (GDSIM); וiii) מיקרוסקופיה תאורה מובנה ^9-12 (SIM). טכניקות לוקליזציה מולקולה בודדת להציע העליות הגדולות ביותר ברזולוציה לרוחב, עד שבין 10-40 ננומטר בדגימות ביולוגיות. ביישומים רבים של מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת, עומק הדגימה מוגבל לגל החולף וההטמעות הראשוניות של STED גם היו מוגבלים בעומק הדגימה. שיפורים עם זאת, ההתקדמות האחרונה כגון שימוש באופטיקה מסתגלת, ניצול של אסטיגמציה בפונקצית נקודת התפשטות במוקדים שונים, זיהוי רב מטוס ושימוש בשתי מטרות להסיק העמדה הצירית של האור הנפלט ראו בשני הצירי מעמקי רזולוציה ודגימה בשני לוקליזציה מולקולת STED ואחת ^13,14. שיעורי רכישת נתונים לSTED וטכניקות לוקליזציה מולקולה בודדתגם איטיים יחסית בשל המספר הגדול של תמונות שצריכות להיות שנרכשו עבור רזולוציה מקסימלי (עד 50,000 לטכניקות לוקליזציה). רכישת נתונים איטית זה לא להשאיל את עצמה להדמיה של דגימות חיות בלי שינויים מותאמים אישית, כי הם לעתים קרובות יקרים למדי. שתי טכניקות אלה כיום בצורה אופטימלית מתאימות לדגימות קבועות (לסקירה ראה ^2,15), לעומת זאת, הרבה עבודה נעשית כדי לטפל במגבלה זו.

שלוש מיקרוסקופיה תאורה המובנה ממדית (3D-SIM) היא טכניקת שדה רחב המשפרת את שניהם ברזולוציה לרוחב וצירית וכתוצאה מכך החלטות של כ 110 ו280 ננומטר, בהתאמה. עומק של דגימה הוא עד 30 מיקרומטר מcoverslip, המאפשר הדמיה של כל תאים. הווריאציה של 3D-SIM שפותחה על ידי Sedat, Agard, וGustaffsson על הפלטפורמה אופטית מיקרוסקופ הניסיוני (OMX) כרוכה מאירה את המדגם עם דפוס רשת ידוע אשר עבר ל15 שוניםעמדות בכל מטוס z ^9-11. השוליים בדפוסי moire וכתוצאה מכך שנוצרים בחלל תדר מחוץ לאזור הנצפה נמדדים. המידע משטח התדירות הוא המחשוב משוחזר כדי ליצור תמונה ברזולוציה סופר גלויה ^10,11. המהירות היחסית שבה ניתן לרכוש התמונות גולמי באמצעות טכניקה זו מאפשרת הדמיה של תאי חיים. עם זאת, חשוב לשים לב כי לתהליכים ביולוגיים המתרחשים בזמן בקנה מידה של שניות, שיעור הרכישה של התמונות הגולמיים הוא עדיין איטי מדי כדי ללכוד שינויים דינמיים. זמן סדרה עם קצב לכידה של שניות ל, רכישה החוזרת ונשנית ללא זמן התאוששות מספיק יכולה להוביל לphototoxicity וphotobleaching, במיוחד במהלך ההדמיה חיה של תאי חיידקים קטנים.

כדי להתגבר על בעיות אלה, ההתקדמות האחרונה ל3D-SIM המהיר (f3D-SIM) פותחו. כאן אנו מתארים אחד הידוע בשם OMX Blaze ¹⁶ שהיה אניntroduced בסוף 2011. טכנולוגיה זו יוצרת תאורה בדוגמת ללא שימוש ברשת פיזית כפי שמשמש במערכות קודמות. השימוש בהתערבות קרן אור וטכנולוגיה תריס חדש מאפשר יצירה של האור בדוגמת על המדגם באופן מהיר מאוד. המהירות של רכישת תמונה הייתה עוד יותר משופרת עם ההקדמה של מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימים מדעי מצלמות (sCMOS), במיוחד בהשוואה למצלמות הקיימות EMCCD. שינויים אלה הביאו לשיעור רכישת תמונה אפשרי של מסגרת אחת לשנייה לעומק דגימה של 1 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים, 9 z-פרוסות), המאפשר ניטור של שינויים דינמיים בתוך תאים המתרחשים בתוך שניות ^16. הירידה בפעמים לכאורה חשיפה (עירור) לחיות תאי שימוש בשיטה זו מאפשרת גם סדרה מורחבת זמן להיות בשבי או עלייה בשיעור הלכידה.

כאן אנו מתארים את היישום של מיקרוסקופיה f3D-SIM לexaminדואר המבנה ותנועה דינמית של טבעת cytokinetic Z בתאים של שני מיני חיידקים: subtilis Bacillus אורגניזם מודל בצורת המוט והפתוגן האנושי coccoid Staphylococcus aureus. FtsZ הוא חלבון cytoskeletal כמו טובולין-שממלא תפקיד מרכזי בחלוקת תא בחיידקים ^17,18. זה localizes לאתר החטיבה לגייס לפחות 20 חלבוני חטיבה אחרים, ויצר מנגנון חלוקת ^17,18, והוא האמין כדי לספק הכוח לתא התכווצות ^19-23. שיטה זו מגלה כי FtsZ מופץ הטרוגני סביב טבעת Z בשני אורגניזמים בהסדר כמו חרוז; פתרון השאלה האם טבעת Z היא החגורה אחידה רציפה סביב התא, כמו דמיין ידי מיקרוסקופ הקונבנציונלי רחב בתחום הקרינה, או מבנה רציף כפי שהוצע על ידי cryo-טומוגרפיה של אלקטרון (ECT) ²⁴ הארוכה שנערך. אנו מראים כיצד היכולת של 3D-SIM בהרבה יכולה לשפר את הבחינה המרחבית של זעיר (1קוטר מיקרומטר) תאים עגולים כמו ס ' aureus שמחלק בשלושה מישורים ברציפות בניצב (x, y, z). מחקרי זמן לשגות תוך שימוש בטכניקות אלה מראים כי המבנה של טבעת Z הוא דינמי, עם ברוטו ארגון שינויים בתוך הטבעת, ולא מולקולות FtsZ נעו פנימה וחוצה של פיגום קבוע ^24.

Protocol

הכנת .1 לדוגמא

הכנת B. תאי subtilis הדמיה
1. לחסן 10 מ"ל של Penassay מרק (PAB, הידוע גם באנטיביוטיקה בינונית 3) עם מושבה אחת של B. SU570 subtilis הזן (168 ftsZ-GFP-spec :: trpC2 ftsZ) ^16. לגדול בין לילה במהירות נמוכה (100 סל"ד) שייקר ב30 מעלות צלזיוס.
2. לדלל את תרבות הלילה ל0.05 ₆₀₀ (הספיגה הנמדדת ב600 ננומטר) בPAB הטרי ב30 מעלות צלזיוס עם מהירות גבוהה (215 סל"ד) רועדת ולגדול עד שלב אמצע מעריכי ₍₆₀₀ ~ 0.4).
3. הוסף 2 גרם של agarose כיתה אלקטרופורזה ב100 מדיום גידול מ"ל 1x (PAB) בבקבוק זכוכית בורג הכתיר. ממיסים את agarose ידי מעוקר. זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים, וחמם במיקרוגל כדי להמס את agarose בעת צורך. לאפשר להגדיר בטמפרטורת חדר.
4. צרף מסגרת דבק (65 קיבולת μl; ראה טבלה של חומרים) לgla סטנדרטישקופית מיקרוסקופ ss. כדי לעשות זאת, להסיר את גיליון פוליאסטר הדק (כל מסגרת דבק ממוקמת בין שתי יריעות פוליאסטר, אחד דק ואחד עבה, ויש לו המרכז הוסר מרובע) ולהחיל את פני השטח דבק הגלוי של המסגרת אל פני השטח של שקופיות מיקרוסקופ. זה למעשה יוצר גם מרובע על גבי השקופית. השאר את פוליאסטר הגיליון העבה המחובר למסגרת זה ימנע coverslip דבק בו בשלבים הבאים.
5. ממסים את פתרון agarose במיקרוגל עד הרתיחה ופיפטה 67 μl לתוך מסגרת הדבק. מייד למקום coverslip על גבי כדי ליצור משטח שטוח ומשאיר בטמפרטורת חדר למשך 5-10 דק '. הסר את coverslip ל1-2 דק 'ואילו המדגם שנקטפו.
6. קציר aliquot 1 מ"ל של המדגם ו צנטריפוגות ב 5,900 XG למשך 30 שניות. למזוג supernatant וresuspend גלולה ב200 μl PAB הטרי.
7. קח 2.5 μl של המדגם ופיפטה המרוכז על מראש להכנהכרית agarose אדומה. מורחים את המדגם באופן שווה על פני השטח השטוח של כרית agarose. הסר את מסגרת הדבק משקופית מיקרוסקופ באמצעות פינצטה ואילו לא נוגע בכרית agarose.
8. העבר את כרית agarose משקופית מיקרוסקופ לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ עם תחתית coverslip זכוכית. הפוך את כרית agarose כך שהשעית התא וcoverslip של צלחת פטרי נמצא בקשר ישיר אחד עם השני. החלק התחתון של צלחת פטרי יש שבירה של 1.525 להדמיה ברזולוציה גבוהה.
הכנה של Live S. תאי aureus הדמיה
1. לחסן 10 מ"ל של L-מרק עם מושבה אחת של ס ' זן SA94 aureus (SH1000 מכיל מחרשה-FtsZ-GFP וpGL485; ארמ ^{r, r} ס"מ) ^25. לגדול בין לילה במהירות נמוכה (100 סל"ד) שייקר סיבובי על 37 מעלות צלזיוס.
2. לדלל את תרבות הלילה ל0.05 ₆₀₀ (הספיגה הנמדדת ב600 ננומטר) בL-מרק צח עם 0.05 מ"מ IPTG (ISOpropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) כדי לגרום לייצור של חלבון ההיתוך.
3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם מהירות גבוהה (215 סל"ד) רועדת ולגדול עד שלב אמצע מעריכי ₍₆₀₀ ~ 0.4).
4. בצע את שלבי 1.1.3 - 1.1.8 כפי שתואר עבור B. הכנת תאי חיים subtilis.
  הערה: הוסף את הריכוז המתאים של inducer לפתרון agarose בשלב 1.1.3 לזנים המבטאים חלבון היתוך ניאון בשליטה מושרה.

2 הכנת מיקרוסקופ

שיטה זו משתמשת במערכת הדמיה DeltaVision OMX (מיקרוסקופים אופטיים, ניסיוני) 3D-SIM מצויד במודול בלייז. לניסויים שתוארו, רק לייזר אחד ומצלמה אחת משמשים. התאורה ונתיב אור מתוארות באיור 1. שיטה זו מבוססת על ההנחה שיש מיקרוסקופ כיול מתאים, פונקצית העברה אופטית (OTF)קבצים ותחזוקת collimation אור ביצעו.

בניסויים הדמיה תא חיים, לוודא שלב החימום מחובר לשלב הקרמיקה וצווארון מטרת החימום מחובר למטרה (60X 1.42 מטרת נפט NA).
הפעל חימום האובייקטיבי ושלב לפחות 4 שעות לפני ההדמיה וכבשת לאט את הטמפרטורה להגדרה הנדרשת בשיעור מרבי של 5 ° C / hr. מומלץ להתחיל את התהליך הזה בערב לפני ההדמיה וכבש ב3 מעלות צלזיוס / 4 שעה. בניסויים תא חיים עם B. subtilis, רוב הניסויים מבוצעים ב30 מעלות צלזיוס. לס aureus, כל הניסויים מבוצעים על 37 מעלות צלזיוס.
ביום של הניסוי, להפעיל את מערכת שעות לפחות 1 לפני ההדמיה כדי לאפשר למערכת והלייזרים לייצוב מלאה. לטעון את תוסף שלב צלחת הקטן על הבמה המחוממת למחממת.
1. הפעל את תחנת העבודה הבקר הראשי.
2. הפעל את workstat עיבוד תמונהיון.
3. הפעל קריר המצלמה ממוקם בקומה מחוץ למתחם מיקרוסקופ.
4. הפעל את כל מצלמות sCMOS (למרות שהם לא כל לשמש).
5. בתוך תא הלייזר ואלקטרוניקה, להפעיל:
  1. מארז הבקר מכשיר.
  2. מארז ננומושן.
  3. בקר Jena לpiezo Z.
  4. כל בקרי מנוע 4 galvo.
  5. מודול בקרת הלייזר הראשי.
  6. מודול בקרת לייזר המשני.
  7. כל תחנות העבודה של המצלמה.
  8. תחנת העבודה OMXIC.
6. בתחנת העבודה הבקר הראשי, לפתוח את תוכנת OMX על ידי לחיצה על הסמל. הגדר את נתיב הקובץ לשמירת נתונים לתיקיית הנתונים מתאים.
7. כדי לאתחל את החומרה, גש לתפריט החומרה, לבחור חומרה ולחצו על לחצן החומרה מחדש. חלון סגור.
8. התחל software.Turn softWoRx בלייזרים הנדרשים לניסויים (488 ננומטר).
9. הפעל את מתג המפתח לנעילת בטיחות לייזר.
10. להבטיח את מגירת מסנן dichroic הנכונה מוכנסת מתחת ליעד. לGFP, זה סטנדרטי (או קבוע) מגירה.
11. בOMX SF, ללכת לתפריט הקובץ, לבחור הגדרות ובחרו את המגירה קבועה מהתפריט הנפתח המגירה. חלון סגור.
12. בצע את הפעולות הבאות מהמסך הראשי של התוכנה, בסעיף פרמטרי אור:
  1. הפעל את המצלמה המתאימה לעירור הלייזר והמצלמה מסנן פליטה (FITC) מבחירת הערוץ.
  2. בדוק את תמונת המצב מוגדר סדרתית.
  3. בדוק את נתיב האור מוגדר SI.
  4. בדקו את המצב מוגדר 95 MHz.
  5. בדוק את הלייזר 488 נבחר בעירור.
  6. הגדר את 512 x 512 לגודל החלון ויניג ל1 x 1.
13. בכרטיסיית הניסוי, להבטיח סוג מוגדר SI מהתפריט הנפתח.
14. ודא חתך מופעל וכי מרווח הסעיף האופטי מוגדר 0.125.
15. ודא נקודת פוקוס בעת הפעלת סריקה היא אמצע.

.3 תמונת רכישה

החל ירידה של שמן לחלק העליון של היעד. ל37 מעלות צלזיוס, יש שמן מתחיל המומלץ מקדם שבירה של 1.518 כדי להתאים הטוב ביותר את מקדם השבירה של כרית ג'ל משמשת לעלות את תאי חיידקים על 37 מעלות צלזיוס (מתייחס לצעד 1.1.3).
מניחים את מדגם צלחת פטרי שמכילה את התאים מוכנים להבלעת הבמה ומכסה במכסת החימום העגולה. מנמיכים את השלב עד השמן נוגע בתחתיתמדגם צלחת פטרי.
לאפשר את המנה לחמם-לאזן במשך 15 דקות בשלב. שימוש בהגדרת חשיפה נמוכה של אלפיות שני 5 או פחות (הממוקמים בחלק פרמטרי אור), תתמקד במדגם באמצעות פקדי שלב מיצוב ננו (DZ, הממוקם בחלק Nano המיקום). להתמקד מעלה ומטה באמצעות המדגם כדי לקבוע אם האור להתפשט באופן שווה מעל ומתחת למדגם מישור המוקד. אם פונקצית נקודת ההתפשטות היא אפילו לא (סטייה כדורית), לנקות את תחתית צלחת המדגם ואובייקטיבי עם כלורופורם. לשנות את השמן ולחזור על פעולה זו עד ששידוך מתאים נמצא בין מקדם שבירת הנפט ומדגם כדי למזער את הסטייה כדורית.
באמצעות 0.5 מיקרומטר גדלי צעד DZ, לסמן את החלק העליון ותחתון של ערימת התמונה. לחזור לאמצע של המדגם. לחץ על לחצן עובי קבל בכרטיסיית הניסוי להגדרת עובי רכישת מדגם. Keeעמ 'גובה הערימה עד למינימום תוך נזהר שלא לחתוך את החלק העליון ותחתון של Z-הטבעות. עוביים אופייניים עבור B. דגימות subtilis הן 2-3 מיקרומטר.
לקבוע את הערך המרבי בעוצמה (מקס) של התמונה לדוגמא עם הגדרות החשיפה וT% הנוכחיות. ערך זה נמצא מתחת לחלון התמונה. הדמיה זמן לשגות, להתאים את T החשיפה ו% להשיג עוצמה מקסימלית של 1,100-1,400 רקע מעל לתמונה. יש צורך בעצמה מינימאלית של 1,000 רקע לעיל כדי לקבל את שחזור תמונה. לתמונה חד פעמית, להגדיל את העצמה המקסימלית ל4,000-5,000.
הפעל את סעיף הזמן לשגות בכרטיסיית הניסוי. הגדר את מסגרת השיעור הנדרש וזמן כולל. בקובץ נתונים, הזן את שם קובץ מתאים. לחץ על לחצן הפעלה כדי להתחיל את רכישת התמונה.
הערה: רכישת תמונה תושלם כאשר gבר נענעה התקדמות הוא סיים וקובץ יומן מופיע לנתונים שנקבעו בתיקיית הנתונים המתאימה.

.4 בבדיקה איכות הנתונים

בתחילת רכישת התמונה, שים לב לערך העצמה מקסימלית של התמונה בתחילת רכישת התמונה למסגרת הראשונה של סדרת הזמן. בסופו של הרכישה של המסגרת הראשונה, לבדוק שלא חלו יותר מ ירידת 10% בעוצמת אות באמצעות Z-המחסנית למסגרת ראשונה זו. אם יש כבר יותר מ זה ברמה של photobleaching בנקודת הזמן הראשון, את הנתונים באמצעות סדרת הזמן יהיו באיכות מספיקה לניתוח ורכישת סדרת פעמים אפשר לעצור.
בסופו של הרכישה של סדרת הזמן, לפתוח את קובץ תמונת גלם וכתוצאה מכך עם .dv סיומת ולברר את הירידה בעוצמת אות מקסימלי מההתחלה של סדרת הזמן לתמונה הסופית. לבטל את כל נקודות זמן שבו יש לדבורהn photobleaching יותר מ 30%.

.5 תמונות השחזור 3D-SIM

מתפריט התהליך, להפעיל את חלון SI השיקום. השתמש בהגדרות קיימות מראש לכל אחד מהפרמטרים.
הפעל את כפתור OTF ספציפי השתמש בערוץ, ולהגדיר למערכת הסינון רגילה. הפעל ספציפי השתמש בערוץ KO זוויות כפתור ולהגדיר למערכת הסינון רגילה.
גרור ושחרר את (.dv) הקובץ הגולמי למרחב קובץ קלט. לחץ תעשה את זה. קובץ הפלט יהיה שם זהה לקובץ הקלט עם _SI הוסיף בסוף.
הערה: תהליך שחזור זה ניתן להפעיל כמשימה באמצעות פונקצית המשימה Builder מתפריט התהליך אם קבצים מרובים הם להיות מעובד.

.6 יצוא נתונים וניתוח

השתמש Imaris לדמיין תמונות 3D בלעלות מצב ולשעברנתוני תמונת נמל כקבצי AVI (ללא דחיסה) ריב (300 dpi) או. מדידות גודל בImaris יכולות להתבצע באמצעות כלי המדידה במצב לעלות.
יצירת חלקות עצמת 3D של טבעת Z מנתוני תמונת 3D-SIM:
1. ניתוח ההתפלגות של FtsZ סביב טבעת Z וכדי ליצור חלקות עצמת 3D
  1. פתח קובץ תמונת 3D לצפייה בz-פרוסות בודדות. השתמש בכלי הצופה נפח הנמצא בכרטיסיית תפריט תצוגה כדי לחתוך אזור של עניין.
  2. הזן את מספר החלון לתמונת 3D זה לתוך חלון הקלט ולהזין מספר חלון חדש ושאינו בשימוש בחלון הפלט. כפתור האזור בחר יהיה זמין כדי לחתוך טבעת Z בודדת של ריבית מ40 × 40 מיקרומטר השדה המקורי של תצוגה.
  3. התאם את הציר הרצוי ומידת הסיבוב בכרטיסיית הרוטציה. לחץ על לחצן לעשות את זה. גלול בנפח כדי לקבל את נקודת המבט הרצויה של טבעת Z.
  4. השתמש בכלי מפקח נתונים ולהתאים את tהוא ממדי עמודה / שורה כדי ליצור אזור חדש של עניין סביב טבעת Z בודדת. לחץ על מרכז התמונה כדי למקם אזור חדש זה של עניין. נתוני תמונת טקסט הוא שולחן שנוצר באופן אוטומטי המציג את עוצמת הקרינה של כל פיקסל באזור של עניין.
  5. לחץ על לחצן גרף 3D בתחילה כדי להציג את העלילה בעוצמה.
  6. לחלופין ניתן לייצא את נתוני תמונת טקסט על ידי לחיצה על כפתור נתוני הטבלה לחסוך בתפריט הקובץ.
  7. העתק את נתוני תמונה מקובץ הטקסט שנשמר לגיליון התפשטות חדש. בחר את כל התאים בתוך הגיליון האלקטרוני וליצור גרף 3D-Surface חדש. לפרמט את גרף עלילת עצמת 3D לפרסום.
2. עבור חוזר נתוני זמן לשגות צעדים 6.2.1.1 - 6.2.1.7 על כל אחד מנקודתי הזמן השונות מקובץ תמונת 3D.
מעקב עוצמת הקרינה ממוצעת לאורך זמן
1. השתמש בנתוני תמונת טקסט כדי לעקוב אחר fluorescenעוצמת ce לאורך זמן באזור של עניין.
2. בחר את התאים שמתאימים לאזור של עניין.
3. לחשב את עוצמת הקרינה הממוצעת בכל נקודה באזור זה זמן של עניין.
4. השתמש בערכי עוצמת הקרינה הממוצע ליצור גרף שורה נפרד.

Representative Results

במחקר זה אנו דמיינו חלבון חלוקת תא חיידק FtsZ, באו לידי ביטוי בתאי חיים כהיתוך FtsZ-GFP, כדי להמחיש את היתרונות החזקים של f3D-SIM על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי ללימוד לוקליזציה חלבון חיידקים ודינמיקה. FtsZ הוא חלבון cytoskeletal כמו טובולין-שpolymerizes לתוך מבנה טבעת דינמי סביב ההיקף של התא. יש טבעת Z תפקיד חשוב בחלוקת תאים: ההרכבה שלה מסמנת את האתר העתידי של חטיבה, הוא מגייס את כל חלבוני חלוקת התא לאתר זה, והתכווצות טבעת Z מופיעה כדי לספק את הכוח כדי לאפשר פנימה תנועה של מעטפת התא במהלך cytokinesis ^{17 , 18.}

כאשר דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום הקונבנציונלי, טבעת Z מופיעה כלהקה רוחבית יחידה של הקרינה בחיידקים בצורת מוט, כולל היצורים שנחקר הכי טובים כגון B. subtilis (איור 2 א), <em> E. coli, וג crescentus. חשוב לציין, את עוצמת הקרינה בכל להקה זה נראית פחות או יותר אחיד, ואת תבנית הלוקליזציה מציעה תובנה קטנה מאוד לארגון המבני וההפצה של פולימרים FtsZ בתוך טבעת Z. כאשר אותם התאים נבדקים על ידי שימוש בשיטת f3D-SIM שתוארה כאן (איור 2), עם זאת, היתרונות של טכניקה זו הם ברורים מייד. ראשון, סיבוב של תמונת 3D-SIM סביב ציר z מאפשר הדמיה של טבעת Z כמבנה טבעת אמיתית בשלושה ממדי מרחב (2C דמויות ו3A). יחד עם העלייה ברזולוציה, זה מגלה כי חלוקת FtsZ בטבעת Z היא למעשה הטרוגנית מאוד (איור 3). השיפור ברזולוציה גם מאפשר לנו לראות טבעות Z שהחלו בתהליך של התכווצות כדי ליצור מחיצת החלוקה (שצוינה על ידי invagination של קרום תא ב<strong> איור 2 ג ו 2 ד).

דוגמאות נוספות של B. טבעות Z subtilis דמיינו ידי טכניקה זו מוצגות באיור 3Bi - 3Biv ולהמחיש כיצד עוצמת הקרינה סביב טבעת Z היא אף פעם לא אותו הדבר. יתר על כן, אזורים של עוצמת הקרינה נמוכה מאוד הם נצפו לעתים קרובות. אנו מתייחסים לאזורים אלה כפערים (ראשי חץ לבנים). אנו צופים פערים אלה ב15% מכלל טבעות Z בדקו (n = 84) ובעיקר בטבעות Z בעל קוטר של 800-900 ננומטר (93%). כדי לכמת את התצפיות הללו, חלקות עצמת 3D נוצרו מטבעת Z ומוצגות באיור 3Ci ו3Cii באמצעות טבעות Z מוצגות איורים 3Biii ו3Biv. חלקות העצמה מראות כי בדרך כלל את כמות הקרינה בטבעת Z יכולה להשתנות עד 3 - פי 4 באזורים שונים של B. טבעת subtilis Z. יתר על כן חלקות עצמת 3D מראות כי gaps של הקרינה בתוך טבעת Z כמעט לקרוא רמות בסיס של הקרינה רקע (חץ שחור באיור 3Ci). דוגמאות לעיל אלה מתארים שחזורים טובים של טבעת Z ותלויות מספיק אור שנפלט מהמדגם ללא photobleaching משמעותי. המטרה זו מושגת באמצעות הבהירות של fluorophore GFP התמזג FtsZ והשפע שלה בתא בתנאים אלה (גבוהה יחס אות לרעש). בתאים אחרים שבם יחס האות לרעש היא נמוכה השחזור של התמונה הוא עני. כדי לדמות התרחשות זו עם FtsZ-GFP, הסכום של אות פליטה שנאסף מB. תאי subtilis הופחתו על ידי הפחתת אנרגיית העירור. כפי שניתן לראות באיור 3D הפחתה של פי 100 של תוצאות אנרגיית העירור בדמותו של Z-הטבעת שיש לו חפצים משמעותיים. זו מתרחשת כתוצאה מניגוד מקומי מספיק בין אות FtsZ-GFP והרקע שהוביל לקקישחזור r של התמונה.

מעניין, ב ' טבעות Z subtilis הראו פערים וההטרוגניות בולטים יותר באזורים העליונים ותחתונים של הטבעת אך לא בצדדים של הטבעת (איור 3 ב). הדבר מתרחש בגלל ההבדל ברזולוציה מושגת על ידי וריאציה זו של 3D-SIM במטוס לרוחב בהשוואה למטוס הצירי. כתוצאה מכך האזורים העליונים ותחתונים של טבעת Z (המטוס לרוחב) שצלם עם רזולוציה אופטימלית. הפערים בZ-הטבעת הם קטנים מדי כדי להיות מזוהים בצדדים של טבעת Z כמו דמיינו במטוס הצירי, שבו יש כמחצית מהרזולוציה של המטוס לרוחב. חיידקים שיש לי מורפולוגיה coccoid, כגון ס aureus, יש טבעות Z אשר ממוקמות בכל המטוסים. אז הדמיה טבעת Z כאשר היא נמצאת במטוס לרוחב (או קרוב לכך) מספקת את יכולת תמונה כל האזורים של הטבעת עם רזולוציה אופטימלית. מנצל את זה, בדקנו את המבנה שלטבעת Z בס החי תאי aureus, ניצול זן המכיל היתוך ftsZ-GFP-נושאות פלסמיד. ייצור של ההיתוך הזה הוא תחת שליטתו של אמרגן ועין מתנהלת _SPAC P (ראה שלב 1.2.1). כאשר צילם עם במטוס הצירי, ס ' טבעות Z aureus הופיעו זהות לB. טבעות Z subtilis אשר נמצאות באותו המישור (איור 4Ai). עם זאת, טבעות Z ההדמיה במישור הרוחבי אישרו כי כל טבעת Z הופיעה כמו חרוז-שני והטרוגנית. אודות 26% מטבעות אלה הראו גם "פער" גלוי לפחות אחד מקרינה (איור 4Aii, 4B). בדומה לB. subtilis FtsZ, חלקות עוצמת הקרינה מראות כי עוצמת הקרינה בטבעת Z משתנה ככל 4 - 6 לקפל באזורים שונים של ס ' טבעת aureus Z (איור 4C).

האורך והרוחב של חרוזים ניתן למדוד (מתייחס לסכמטי באיור 4D). זה הראה כי 80% מטבעות Z (n = 43) שנבדקו היה אורך חרוז של 200 ננומטר, הגיע אורך מרבי של 400 ננומטר. הרוחב של חרוזים, לעומת זאת, נמדד עד 200 ננומטר. היה בחרוזי FtsZ 12 ± 2 (SEM) ממוצע לטבעת Z. נתונים לוקליזציה דומים נצפו כאשר FtsZ ילידים דמיינו עם שיטות אלה באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence (IFM) מראים כי דפוס לוקליזציה הטרוגנית וכמו חרוז זה היה אמיתי ולא מלאכותי שנגרמו על ידי ביטוי של ftsZ-GFP בנוסף לFtsZ ילידים (נתונים לא מוצג). קידום זה של 3D-SIM הוא הצליח להראות כי טבעת Z מופיעה כמבנה הטרוגני ואולי רציף בטבע.

כדי להתמודד עם השאלה כיצד מבנה Z-טבעת הטרוגנית זה עובר כיווץ ומקל על חלוקת תא, ניתוח הזמן לשגות של דינמיקת טבעת Z יכול להתבצע. אחד האתגרים העיקריים עםמחקרי הזמן לשגות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא במזעור photobleaching המדגם וphototoxicity במהלך הדמיה. 3D-SIM דורש מספר רב של תמונות גולמיים שיופק מה שאומר שphotobleaching של מדגם לאורך הזמן יגרום ליחס אות לרעש גרוע מוביל לאות מספיקה כדי לאפשר שחזורי תמונה מתאימים. היישום של הטכנולוגיה החדשה ממזער את כמות אנרגיית עירור המשמשת לכל חשיפה ומכאן ירידה באנרגיה שנכנסה לתאים חיים. הוא עושה זאת על ידי שילוב של אינטרפרומטריה קרן אור כדי ליצור את הדפוס מובנה על המדגם ושימוש במצלמות CMOS מדעיים שמגבירות את הרגישות ויעילות הקוונטית. תוצאות שילוב זה ברכישת z-ערימה של 1 מיקרומטר לשניות (512 × 512 פיקסלים x 8 z-פרוסות) בהשוואה ל1 מיקרומטר ל5-8 שניות (512 x 512 פיקסלים x 8 z-פרוסות) שהושגו עם איטרציה הקודמת שלנו של 3D-SIM (שתואר בRiglar et al. ^26).להקטין את זמן רכישת תמונה והגדרות חשיפה גם יכול לעזור למזער phototoxicity של תאי חיים שהוא רלוונטי במיוחד במחקרי הזמן לשגות. הטכנולוגיה החדשה המוצגת כאן מתייחסת גם לבעיה נוספת בתחום ההדמיה לחיות תאים שאנחנו מכנים "שטשטוש תנועה 'אשר בהקשר זה מתייחס ללוקליזציה של חלבונים משתנים במהלך רכישת תמונה. על ידי הפחתת זמן רכישת תמונת הסכום של 'טשטוש תנועה' ממוזער ובכך ליצור שחזור תמונה מדויק יותר.

המחקרים קודמים שעסקו איך FtsZ מאורגן בתוך טבעת Z לא הצליחו להראות כיצד מבנה טבעת Z משתנה על פני זמן. כדי לחקור היבט זה ביצענו זמן לשגות באמצעות f3D-SIM. רכישה אפשרה זה של תמונת 3D-SIM של טבעת Z בB. subtilis כל 5-10 שניות על פני תקופה של 50 שניות, אשר בעבר לא היו אפשרית בקנה מידת זמן זה. שמוצג באיור 5 א הוא examplדואר של השינויים מהירים בהפצת FtsZ בתוך טבעת Z לאורך זמן (בקוטר של 890 ננומטר). טבעות Z אחרות שהיו ניכרים לעין בתהליך של התכווצות הוצגו גם יש לי דינמיקה דומה שהשפיעה על חלוקת FtsZ סביב טבעת Z (לא מוצג). חלקות עצמת 3D יכולות גם להיות שנוצרו עבור כל אחת מנקודות הזמן לכמת ולהעריך את השינויים מתמידים עוצמת הקרינה ושפע כך יחסי של FtsZ באזורים שונים של טבעת Z על ציר זמן של שניות (איור 5). אזורים של עניין ניתן לזהות מחלקות עוצמה אלה כדי לעקוב אחר התנודות של עוצמת הקרינה (איור 5 ג). מעקב אחר השינויים הללו במבנה טבעת Z בתנאים אלה יהיו כמעט בלתי אפשריים בלי טכנולוגית f3D-SIM המתקדמת. בנוסף, עבודה זו עולה כי בס aureus התנועה הדינמית של FtsZ דומה לזה שנצפה בB. subtilis. ס תאי aureus RN4220 יחסי ציבורFtsZ-GFP oducing הם צילמו עבור 50 שניות ב10 מרווחי זמן שניות. שינויים בהטרוגניות של טבעת Z בס aureus עם f3D-SIM היו דומה לB. subtilis (ראה ראשי חץ וחצים באיור 6). מחקרי זמן לשגות אלה תומכים במודל של התכווצות טבעת Z (מודל צביטת איטרטיבי) שחזתה באמצעות בחינה של ג הקבוע תאי crescentus, אך לא ניתן היה הפגינו בשל הצורך לבחון דינמיקת Z-טבעת בתאים חיים ^27.

איור 1 סכמטי של התצורה האופטית של f3D-SIM ששמשה במחקר. אור לייזר זה משולחן הלייזר מכוון דרך סיבי SIM לעדשת collimating וקבועות צורם, אז למודול בקרת פאזות שיוצר הן את אורך גל מסוים o מרווח האופטימליתf ± הקורות כדי 1 ^st מהקורה המרכזי אפס סדר והצעדים השלב לאיסוף SIM. הקורות לאחר מכן להזין את מודול בקרת זווית שבי הקורות משתקפות ל3 אשכולות שונים כדי ליצור את 3 הזוויות של תאורה. הקורות ולאחר מכן להזין את המיקרוסקופ ונתיב אור כפי שמוצג (השתנה באישור פול גודווין, API).

השוואת איור 2 של הקרינה קונבנציונלית רחב בתחום וההדמיה 3D-SIM של B. תאי subtilis להביע ftsZ-GFP. () דימות פלואורסצנטי רחב בתחום הקונבנציונלי של B. תאי subtilis להביע ftsZ-GFP (SU570; ירוק) כעותק יחיד גם היו מוכתמים בצבע הקרום FM4-64 (אדום). סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. התמונה נרכשה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף.ההדמיה 3D-SIM שלו B. (B) זן subtilis להביע ftsZ-GFP, מוכתם בFM4-64. אזורים של עניין מהתמונה ניתן לבחור (תיבה מקווקו) כדי להתקרב. התמונה גם ניתן לסובב סביב ציר z כדי להציג טבעות 3D FtsZ במטוס הצירי. (C, D) הסרת out-of- מוקד אור ורזולוציית תמונה משופרת המסופקת על ידי 3D-SIM מאפשר הדמיה ברורה של טבעות Z (כולל אלה ההצרה) והקרום הפנימי התא במהלך החלוקה (המסומן בחצים לבנים). שים לב כי את טקסט הפרוטוקול מתאר את ההדמיה של fluorophore יחיד. עם זאת, ההליך יכול להיות מותאם לרכישה עד ארבעה אורכי גל שונים בו זמנית. נתון זה כבר הודפס מחדש משטראוס et al ^16.

איור 3. נציג תמונות של טבעת Z בתאים בצורת מוט חי חיידקים ('subtilis) להביע FtsZ-GFP באמצעות 3D-SIM. (Ai) טבעת Z הוא ציין כלהקה של הקרינה בניצב לציר של התא שהוא במישור XY הארוך. ("איי) התמונה מסובבת סביב z -axis באמצעות תוכנת הדמיה Imaris 3D (ראה פרוטוקול צעד 6.1), כך שאחד לא מסתכל דרך מבנה הטבעת כדי לראות איך FtsZ מופץ בתוך טבעת Z בבירור. תמונה זו, עכשיו במטוס ZX מראה כי יש לו את הטבעת הפצה הטרוגנית של FtsZ עם אזורים של אין או הקרינה קטנה מאוד (ראשי חץ לבנים). התמונה חייבת להיות מסובבת להתבונן אזורים אלה 'הפער' של הקרינה. Bi-ביב להראות דוגמאות נוספות של טבעות Z מסובבות, הנמצאות כיום במישור ZX. טבעות Z ב( Bi-iii) יש בקוטר של ~ 0.9 מיקרומטר. (ביב) מראה טבעת Z בקוטר של only 0.65 מיקרומטר התכווצות עוברת. (Ci) פרופיל עוצמה זו אופיינית 3D ממחיש את עוצמת הקרינה (כלומר הריכוז) הבדלים בFtsZ-GFP סביב טבעת Z בעל קוטר של 0.85 מיקרומטר (ראה פרוטוקול הצעדים 6.1-6.3). רמת הקרינה בפערים אלו היא נמוכה וגישות רמות רקע הקרינה (חץ שחור). (כת"ש) פרופיל עוצמת 3D דומה של טבעת Z בתהליך של התכווצות. ריכוז FtsZ-GFP הוא גם לא אחיד; קוטר, 0.65 מיקרומטר. פנלים, B, CI וכת כבר נדפסו משטראוס et al ^16.

איור 4 תמונות הנציג 3D-SIM של ס ' תאי aureus הפקת FtsZ-GFP. מאחר ותאים אלה הם עגולים (Cocci), טבעת Z תהיה havדואר אוריינטציות שונות. תאים שמראים להקה של הקרינה בכיוון הצפייה הרגילה (כלומר, במישור XY) כפי שמוצג ב( Ai), נראים דומים מאוד לאלה בתאים בצורת מוט כשהסתובבו סביב ציר Z כלאיור 1Ai. ב( "איי) טבעת Z כבר היא במישור XY; התמצאות ורזולוציה לרוחב היא מקסימאלי על פני כל הטבעת שעכשיו נותנת מבנה כמו חרוז-(B). עלילת עצמת 3D של השפע היחסי של FtsZ-GFP בטבעת Z (C). ייצוג סכמטי של S (D) . טבעת aureus Z. חיצים אדומים מציינים אורך חרוז וממדים רוחב (ראה צעד פרוטוקול 6.1). נתון זה שונה משטראוס et al ^16.

<strong> איור 5 f3D-SIM מאפשר ניתוח מהיר של לוקליזציה FtsZ לאורך הזמן ב3D-SIM. (א) שינויים בחלוקת FtsZ-GFP בתוך טבעת Z בB. בצורת המוט יכולים להיות דמיינו תאי subtilis כדי לציין את הדינמיקה של הטבעת. זמן (שניות) מצויינים בפינה השמאלית העליונה של כל תמונה. חלקות עוצמת הקרינה 3D (B) מראות לא אחידה והפצה דינאמית של FtsZ בטבעת Z. (C) דינמיקת FtsZ (FtsZ-GFP שינויי הקרינה ב טבעת) גם ניתן לבחון ביתר פירוט על ידי כימות עוצמת הקרינה לאורך הזמן בשני אזורים של עניין. נתון זה כבר הודפס מחדש משטראוס et al ^16.

איור 6 זמן לשגות תמונות f3D-SIM להראות שינויים בלוקליזציה FtsZ בתוך הטבעת לאורך הזמן בסureus. ראש חץ לבן מצביע על פער כאשר הוא בתחילה זוהה בזירת Z. ההופעה וההיעלמות של פערים באותה התנוחה (כפי שמסומן על ידי ראש החץ הלבן) לאורך הזמן מדגים כיצד FtsZ הוא מחדש סביב Z-הטבעת. חצים לבנים מצביעים על היווצרותם של פערים בטבעת Z בנקודות זמן מאוחר יותר. זמן (שניות) מוצג בצד השמאלי העליון של התמונות. נתון זה שונה משטראוס et al ^16.

Discussion

הדמיה לחיות תאי ניאון היא כלי רב עוצמה המאפשר תצפית של שינויים דינמיים בתוך תאים לאורך זמן. ההדמיה חיה של ביולוגיה של תא חיידקים הייתה מאתגרת בגלל גודל התא הקטן ומקטינה את היכולת של תאי חיידקיים לעמוד חשיפה חוזרת ונשנית לאור העירור. f3D-SIM הרחיב את הכלים העומדים לרשות לחקור את כל הביולוגיה של התא, אך יש צורך לבצע בזהירות בטכניקה זו כפי שניתן הציגו ממצאים אם ייושמו בצורה גרועה. ישנם מספר שיקולים החשובים לשימוש המוצלח של טכניקה זו. כפי שהוא שיטת דימות פלואורסצנטי רחב בתחום שמסתמכת על השימוש בפונקצית נקודת ההתפשטות של אור הנפלט, חוסר התאמת מקדם שבירה וסטייה כדורית של האור הנפלט יש להימנע כדי לאפשר שחזור תמונה מדויק. השימוש בcoverslips של 0.17 מ"מ עובי של באיכות גבוהה, כדי למנוע וריאציה של עוצמת אות בשל השתנות עובי זכוכית בכיסוייםשפה מומלצת מאוד. זה חשוב באופן קריטי על מנת להעריך בזהירות את האברציה הכדורית של האור הנפלט בשלבים הראשונים של כל הניסויים ולהתאים את מקדם שבירת שמן טבילה לפי צורך. זה עשוי להשתנות מיום ליום כפי שהוא תלוי בשני הטמפרטורה ומדיה / מצע ההרכבה של המדגם. השימוש בשמן לא נכון יגרום לשחזור נחותים של התמונות עם חפצים כגון הילות ואותות הד.

בסופו של תהליך שחזור התמונה, לכל שלב ניתן לקבל מדד לאיכות של השיקום על ידי "ההתאמה הטובה ביותר עבור זווית Ko" לכל שלב / זווית של התאורה. אם ערך זה הוא מתחת ל -1 לכל זווית, ולאחר מכן את האיכות של משוחזר תהיה ככל הנראה להיות גבוהה. אם ערך זה הוא מעל 6, שזה סביר להניח כי התמונה המשוחזרת תכיל חפצים. חפצים נפוצים כוללים אני) את המראה של פסים בתמונה שמתאימהלאחד מהזוויות של הרשת. זה יכול לנבוע מאות נמוכה יותר מזווית הרשת ש; ii) אפף סביב מבנים. זה יכול לנבוע מרמות מאוד לא אחידות של אות ממבנים בהירים בהשוואה למבנים שמסביב, חוסר התאמה של מקדם שבירה של הנפט והמדגם או יכול להיות בגלל המבנים בתמונה להיות אמורפי מדי ולא מכיל "מבנה" מספיק כדי להיות מוכר על ידי האלגוריתם; iii) "כוורות" שנובעת מאות נמוכה יחס רעש בתמונה, בדרך כלל עקב אות רקע גבוהה; iv) מבנים שנמתחים / מוארכים בXY שיכולים להיות בגלל חוסר ההתאמה מקדם שבירה של שמן ומדגם. חפץ זה קשה להבחין למשתמש לא מנוסה. מומלץ כי משתמשים חדשים להתייעץ חוקר SIM מנוסה לקבלת ייעוץ על פרשנות תמונה וניתוח כאשר מתחילים להשתמש בטכניקה זו.

כמו בכל ניסויי ההדמיה לחיות תאי הניאון, זה יבואנמלה לאזן בזהירות את קלט אנרגיית עירור על מנת למזער את מידת photobleaching וphototoxicity של התאים עם אות פליטה מספיק צריכה לשחזר תמונות עם חפץ מינימאלי. photobleaching מוגזם (יותר מ 30% על פני רכישת z-ערימה אחת) יוביל לדפוס פיזור בתמונה המשוחזרת. עם השימוש במצלמות sCMOS, תמונות ברזולוציה סופר ניתן לשחזר בהצלחה מתמונות גולמית עם אות פליטה נמוכה כמו 1,000 ספירות מעל רקע. זה יכול לאפשר לזמני חשיפה קצרים מאוד ובכך להפחית photobleaching ומאפשרים לכידה מהירה לכל מסגרת. זה גם מגדיל את כמות הזמן בין מסגרות לתאים להתאושש מהשקעת אנרגית עירור. בנוסף, ככל שזמן הלכידה לכל מסגרת בודדת יכול להיות קצר מאוד, התואר של חפץ שהוצג על ידי 'תנועה לטשטש' במהלך לכידת פרט מצטמצם עם השימוש בשיטה זו.

זה Variני של 3D-SIM מציע מספר יתרונות אחרים על פני טכנולוגיות סופר זמין והדמיה ברזולוציה גבוהה אחרות הדמיה חיה על ידי ביולוגים תא חיידק. העלייה של 2 הקיפול ברזולוציה בכל 3 הממדים ויכולת תמונה עד 30 מיקרומטר למדגם מאפשרים הדמיה של תאי חיידקים (ויונקים) שלמים במהלך ניסוי. טכניקות כגון לוקליזציה מולקולה בודדת המבוצעות בדרך כלל בגל החולף לא יכולות להשיג את עומק החדירה לתוך מדגם ולא מציעות מידע על כל תאים. התקדמות שחל באחרונה, המאפשרות עומקי דגימה גבוהים יותר לטכניקה זו עלולה לגרום לרזולוציה צירית טובה יותר של תאים שלמים. בנוסף, טכניקות לוקליזציה מולקולה בודדת שדורשות אלפי תמונות גולמיים שתירכשנה גם הם מוגבלים במסגרת השיעור שניתן ללכוד ועשויה לדרוש פשרה בין מסגרת שיעור לכידה והרזולוציה מרחבית השיגה האולטימטיבית, כרזולוציה מרחבית תלויה ב מספר ערבNTS נרשם בתוך מרחב מוגדר. הפחתת מספר המסגרות שנתפסו תגרום לרזולוציה מרחבית נמוכה יותר אבל עשוי להיות מספיק כדי להשיג את הרזולוציה של הזמן דרוש לתהליך הביולוגי של עניין. זמן התאוששות בין המסגרות עשוי גם צריך להיות מוגבר על מנת למזער phototoxicity בתאים חיים וכך להגביל את המשך ותדירות שבה ניתן להשיג בזמן סדרה. טכניקות ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) או אלקטרונים cryotomography (ECT) הצעה עלו ברזולוציה מעל 3D-SIM (ושיטות מיקרוסקופיה אחרות ברזולוציה הסופר אופטיות) אך חייבת להתבצע על דגימות קבועות. התיקון והעיבוד עשוי להציג את הממצאים וחוסר התיוג עלול להפוך פרשנות קשה. יש ECT ללא תווית ניגוד עני ויכול להשיג מעמקי חדירת מדגם של כ 500-200 ננומטר ^24, כך שגם אם החלבון של עניין ניתן לזהות, את המבנה של החלבון בתא חיידק שלם לא יכול להיות שנצפה.גם כאשר תיוג יכול לשמש בEM, כגון עם immunogold, ההדמיה מתבצעת רק ב2D. 3D הוא בר השגה רק עם חתך דק ושחזור ממוחשב של החתכים. חתך הדק דורש טכנאי מנוסה אבל יכול להיות בעייתי ולגרום לחפץ. עם תאי חיים או קבועים, 3D-SIM אינו צריך להיות מוטבע באופן ספציפי ותאים יכולים להיות מוכנים במהירות להדמיה במצב טבעי קרוב.

שיטה זו היא קלה יחסית ליישום על ידי חוקרים בעלי ניסיון מינימאלי במיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניתן לבצע ניסויים בתקשורת שתומכות בתפקוד תא בריא, כל עוד זה לא לזרוח או ליצור אות רקע שלא לצורך. לתאי חיידקים, זה יכול לאפשר את השימוש בסוגים רבים של מורכבות ותקשורת מינימאלית או השימוש בתקשורת מוצקה או חצי מוצק לשלוט תנועתיות תא חיידק. ביולוגים רבים שכבר מהונדס חלבון פלואורסצנטי (FP) איחודים ובדק את הפונקציונליות שלשילובים אלה יכולים לקחת עד טכנולוגיה זו במהירות ללא הנדסה ואימות עם שילובי FP photoactivatable חדשים נוספות. מצאנו, כהתבוננות כללית, שס aureus היה רגיש יותר לphotobleaching במהלך הדמיה עם שילובי FP מאשר ב ' subtilis. תוך שימוש בשיטות שלנו המקוריות 3D-SIM, שבו דפוס הרשת נוצר על ידי צורם פיזי, לא הצליחו לבצע הדמיה תא חי עם מספר של ס ' שילובי aureus FP. עם זאת, עם שיטת f3D-SIM מתקדם זה, היינו יכול תמונת איחודי FP אלה ולבצע סדרת זמן קצרה כדי ללכוד את הדינמיקה של חלבונים המתויגים אלה. זוהי ככל הנראה בשל זמני חשיפה המופחתת דרושים להדמיה והגדילו זמן בין מסגרות להתאוששות תא.

OMX Blaze 3D-SIM הוא טכנולוגיה זמינה מסחרי שיכול להיות יחסית קלה ליישום במעבדה בודדת או מתקן הדמיה ליבה. יש להקפיד לבצע את הטכניקה כדי למנוע Artiעובדות בשל הכנת מדגם עניה או לכידת תמונה ירודה. ברגע שהטכניקה היא שולטת, מחקרים של מבנה חלבון ודינמיקה באורגניזמים קטנים כגון חיידקים יכולים להתבצע בקרינה בודדת או מרובי צבעים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose I (Biotecnology grade)	AMRESCO	0710-500G	Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media.
N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64)	Life Technologies	T-13320	Lipophylic dye used for staining cell membranes.
1.5 ml microtube, graduated Natural	Scientific specialties Inc.	1210-00	Made from Homopolymer polypropylene, used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization.
Luria broth base, Miller	BD	241420	Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2% agarose after autoclaving.
BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3	BD	210932	Prepared according to manufacturer's instructions.
Adhesive frame	Thermo-Fisher Scientific	ABGAB-0577	Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15 x 16 mm).
Microscope cover glass	Thermo-Fisher Scientific	111512-9	22 x 22 No. 1 Thickness
35 mm diameter Petri dish with a glass coverslip bottom	World precision instruments	FD35-100	Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35 mm, Glass: Ø 23 mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378-25G	Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol.
Lincomycin hydrochloride	Sigma	L6004-5MU	Make a 25 mg/ml stock in 50% ethanol.
Erythromycin	Boehringer Mannheim GmbH	12390120-14	Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol.
Combined orbital/linear shaking waterbath	Grant scientific Instruments	OLS-200	Shaking speed used for cultures: 215 rpm
UV visible spectrophotometer	Shimadzu	UV-1601	600 nm wavelength was used for measuring optical density of bacterial cultures.
Centrifuge	Eppendorf	5415R	Pellets of bacterial culture were obtained by spinning down mid exponentially growing cultures at 8,000 rpm for 30 sec.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma	15502-10G	Prepare 1 M stock and filter sterilize prior to use.
softWoRx software	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company	version 5.0
Imaris data analysis software	Bitplane Scientific Software, Bitplane AG	version 7.0.0	Matlab XTensions included
DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company		Blaze module fitted on OMX V3
Upright fluorescence microscope	Zeiss Axioplan 2