Un metodo è descritto con accompagnamento visivo per lo svolgimento scalabili, selezioni elevati di throughput da combinatorie librerie di anticorpi sintetici fagi-mostrato contro centinaia di antigeni contemporaneamente. Usando questo approccio parallelo, abbiamo isolato frammenti anticorpali che presentano elevata affinità e specificità per diversi antigeni che sono funzionali in immunodosaggi standard.
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Articolo metodologico
Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato
In questo articolo
Sommario
Abstract
La richiesta di anticorpi che soddisfano le esigenze di applicazioni sia di ricerca di base e clinica è alta e aumenterà notevolmente in futuro. Tuttavia, è evidente che le tecnologie tradizionali monoclonali non sono soli fino a questo compito. Questo ha portato allo sviluppo di metodi alternativi per soddisfare la domanda di alta qualità e reagenti di affinità rinnovabili a tutti gli elementi accessibili del proteoma. A questo fine, i metodi high throughput per condurre le selezioni da librerie di anticorpi sintetici fagi-visualizzati sono stati ideati per applicazioni con diversi antigeni e ottimizzato per la velocità rapida e di successo. Qui, un protocollo è descritto in dettaglio che illustra con video dimostrativo la selezione parallela di cloni Fab-fago da librerie alte diversità contro centinaia di obiettivi utilizzando sia un gestore di liquido 96 canali manuale o sistema robotico automatizzato. Usando questo protocollo, un singolo utente può generare centinaia di antigeni,selezionare anticorpi a loro in parallelo e validare vincolante entro 6-8 settimane di anticorpi. Evidenziate sono: i) un formato antigene praticabile, ii) caratterizzazione dell'antigene preselezione, iii) passaggi critici che influenzano la scelta di specifiche e di alta cloni affinità, e iv) modi di efficacia selezione monitoraggio e tempestivamente clone anticorpo caratterizzazione. Con questo approccio, abbiamo ottenuto i frammenti di anticorpi sintetici (FAB) a molte classi di destinazione, tra cui i recettori single-pass di membrana, ormoni proteici secreti, e multi-dominio proteine intracellulari. Questi frammenti sono facilmente convertiti in anticorpi full-length e sono stati convalidati per esibire elevata affinità e specificità. Inoltre, essi hanno dimostrato di essere funzionale in una varietà di immunodosaggi standard, tra cui Western blotting, ELISA, immunofluorescenza cellulari, immunoprecipitazione e saggi relativi. Questa metodologia accelerare la scoperta di anticorpi e infine ci avvicinano a realizzare l'obiettivo of generazione rinnovabili, anticorpi di alta qualità al proteoma.
Introduzione
Con l'inizio dell'età post-genomica, la disponibilità dei reagenti vincolanti alta qualità per caratterizzare e modulare proteine è essenziale per aprire nuove ricerche e vie terapeutiche. Anticorpi continuano ad essere fondamentale per entrambi i ricercatori accademici e industriali come la ricerca di base e gli strumenti diagnostici e potenziali terapie. Non sorprende, c'è stata una crescita impressionante di imprese di sviluppo di anticorpi contratto, la maggior parte dei quali si basano su tecnologie ibridomi convenzionali per generare anticorpi personalizzati. Tuttavia, la selezione in vitro utilizzando le librerie di anticorpi fagi-visual....
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Protocollo
1. Generation Antigen
NOTA: i domini Antigen può essere sintetizzato e clonato da una varietà di fornitori commerciali a un adeguato espressione costrutto IPTG-inducibile.
- Trasforma costrutti di espressione in chimicamente competente, T1-fago resistente, BL21 E. coli di miscelazione 10 ng di DNA codificante in 20 ml di 1X KCM su ghiaccio in una piastra da 96 pozzetti PCR seguita dall'aggiunta di 20 L di cellule chimicamente competenti.
- Incubare la miscela di cellule / DNA in ghiaccio per 20 minuti, a temperatura ambiente per 10 minuti e poi in ghiaccio ancora per 2 minuti prima di salvataggio con 100 ml d....
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Risultati
Il protocollo qui descritto è stato usato per isolare frammenti anticorpali ad una varietà di entrambi i domini antigene strutturalmente e funzionalmente correlati da combinatori fago visualizzato librerie Fab in parallelo. Questioni relative alla disponibilità di antigene possono essere aggirate, in molti casi, per l'identificazione in silico di domini antigene esprimibili che sono adatti per la selezione di anticorpi 23. Accoppiando espressione dell'antigene alla selezione anticorpo nello stesso lab.......
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Discussione
Nel condurre nelle selezioni di anticorpi in vitro, i due fattori determinanti principali di successo di selezione sono: 1) l'isolamento di obiettivi antigeniche ben piegati, per la selezione su e 2) la disponibilità di una libreria di anticorpi diversità funzionale. In molti casi, la disponibilità di quantità sufficienti di ben piegata, proteina intera può essere limitante. Un approccio per superare questa limitazione è quello di utilizzare i domini individuati dall'analisi bioinformatica
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere il Fondo comune NIH - proteine reagenti acquisire il programma per finanziare lo sviluppo della selezione e caratterizzazione di anticorpi ricombinanti gasdotto anticorpo Network e la Fondazione canadese per l'innovazione per l'acquisto il finanziamento della piattaforma di selezione robotica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MATERIALI | |||
| Agitatore per incubatore impilabile New Brunswick Innova44 | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidatore Sistema di pipettaggio manuale da banco a 96 canali | Anachem Ltd Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Agitatore per micropiastre | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Centrifuga da banco Sorvall ST-40 | Prodotto | termico | |
| ELx405 Select Lavatrici per micropiastre a pozzetti profondi | Biotek | ELX405USD | |
| Robot per la selezione automatizzata dei fagi ad alta produttività personalizzata | S & P Robotics | ||
| Provetta Falcon conica in plastica: 50 ml | VWR | 21008-178 | |
| Provetta Falcon conica in plastica: 15 ml | VWR | 89039-668 | |
| Provette per microcentrifuga Axygen da 1,7 ml | Corning | MCT-175-L-C | |
| Piastra Maxisorp a 96 pozzetti/384 pozzetti | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning Blocco a pozzetti profondi con fondo a V a 96 pozzetti | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-provetta Micropiastra sterile a 96 pozzetti scatola blu | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Pellicola sigillante per piastre adesive traspirante | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTI | |||
| Nome | Azienda | Numero | |
| polietilenglicole | Bioshop | PEG800.1 | |
| estratto di lievito | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-triptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| Ammina N-Z | Sigma | C7290 | |
| glucosio | Sigma | G8270-1KG | |
| lattosio | Bioshop | LAC234 | |
| glicerolo | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillina | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamicina | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetraciclina | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 Bioshop | TWN510.500 | ||
| fosfato di potassio monobasico | Bioshop | PPM302.1 | |
| fosfato di sodio bibasico | Anachemia | 84486-440 | |
| cloruro di sodio | Bioshop | SOD001.10 | |
| cloruro di potassio | Bioshop | POC308.1 | |
| cloruro di calcio | Bioshop | CCL302.500 | |
| solfato di magnesio | EMD | MX0070-1 | |
| cloruro di magnesio | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel colorante | Invitrogen | S33102 | |
| acido fosforico | Acros Organics | 201140010 | |
| lisozima | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonasi | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| cocktail di inibitori della proteasi compresse | Roche | 11 836 170 001 | |
| resina Ni-NTA | Qiagen | 1018240 | |
| 1.000x fago helper (M13K07) stock (1013 fago per ml) | NEB | N0315S | |
| HRP coniugato anticorpo M13-specifico (anti-M13-HRP). | Substrato TMB GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| miscelare volumi uguali di TMB e substrato di perossidasi H2O2 | KPL | 50-76-00 | |
| dNTP | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polimerasi | Genscript | E00007 | |
| Esonucleasi | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Fosfatasi alcalina per gamberetti | GE Healthcare | E70092Z-EZ |
Riferimenti
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al.
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Ristampe e permessi
