Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato

Sommario

Un metodo è descritto con accompagnamento visivo per lo svolgimento scalabili, selezioni elevati di throughput da combinatorie librerie di anticorpi sintetici fagi-mostrato contro centinaia di antigeni contemporaneamente. Usando questo approccio parallelo, abbiamo isolato frammenti anticorpali che presentano elevata affinità e specificità per diversi antigeni che sono funzionali in immunodosaggi standard.

Abstract

La richiesta di anticorpi che soddisfano le esigenze di applicazioni sia di ricerca di base e clinica è alta e aumenterà notevolmente in futuro. Tuttavia, è evidente che le tecnologie tradizionali monoclonali non sono soli fino a questo compito. Questo ha portato allo sviluppo di metodi alternativi per soddisfare la domanda di alta qualità e reagenti di affinità rinnovabili a tutti gli elementi accessibili del proteoma. A questo fine, i metodi high throughput per condurre le selezioni da librerie di anticorpi sintetici fagi-visualizzati sono stati ideati per applicazioni con diversi antigeni e ottimizzato per la velocità rapida e di successo. Qui, un protocollo è descritto in dettaglio che illustra con video dimostrativo la selezione parallela di cloni Fab-fago da librerie alte diversità contro centinaia di obiettivi utilizzando sia un gestore di liquido 96 canali manuale o sistema robotico automatizzato. Usando questo protocollo, un singolo utente può generare centinaia di antigeni,selezionare anticorpi a loro in parallelo e validare vincolante entro 6-8 settimane di anticorpi. Evidenziate sono: i) un formato antigene praticabile, ii) caratterizzazione dell'antigene preselezione, iii) passaggi critici che influenzano la scelta di specifiche e di alta cloni affinità, e iv) modi di efficacia selezione monitoraggio e tempestivamente clone anticorpo caratterizzazione. Con questo approccio, abbiamo ottenuto i frammenti di anticorpi sintetici (FAB) a molte classi di destinazione, tra cui i recettori single-pass di membrana, ormoni proteici secreti, e multi-dominio proteine ​​intracellulari. Questi frammenti sono facilmente convertiti in anticorpi full-length e sono stati convalidati per esibire elevata affinità e specificità. Inoltre, essi hanno dimostrato di essere funzionale in una varietà di immunodosaggi standard, tra cui Western blotting, ELISA, immunofluorescenza cellulari, immunoprecipitazione e saggi relativi. Questa metodologia accelerare la scoperta di anticorpi e infine ci avvicinano a realizzare l'obiettivo of generazione rinnovabili, anticorpi di alta qualità al proteoma.

Introduzione

Con l'inizio dell'età post-genomica, la disponibilità dei reagenti vincolanti alta qualità per caratterizzare e modulare proteine ​​è essenziale per aprire nuove ricerche e vie terapeutiche. Anticorpi continuano ad essere fondamentale per entrambi i ricercatori accademici e industriali come la ricerca di base e gli strumenti diagnostici e potenziali terapie. Non sorprende, c'è stata una crescita impressionante di imprese di sviluppo di anticorpi contratto, la maggior parte dei quali si basano su tecnologie ibridomi convenzionali per generare anticorpi personalizzati. Tuttavia, la selezione in vitro utilizzando le librerie di anticorpi fagi-visualizzato sta diventando una potente tecnologia alternativa in grado di offrire vantaggi unici e di successo in cui le tecnologie convenzionali possono affrontare limitazioni ^{1, 2.}

Alla luce della forte domanda per gli anticorpi di alta qualità come strumenti di ricerca, due sfide principali per la generazione di anticorpi rinnovabili sono: 1) la velocità di selezione e 2) av antigenevata disponibilità. Un certo numero di gruppi hanno ora descritto in gasdotti di selezione in vitro volti ad aumentare la produttività e il tasso di individuazione di anticorpi. Queste descrizioni particolare una varietà di approcci vitali che includono la selezione su o full-length obiettivi ^3,4, o strutturalmente domini ^5,6,7 correlato, utilizzando ^6,8 o piatto a base di ^3,4 schemi antigene immobilizzazione basati bead-. Inoltre, la crescente adozione di tecnologie di sintesi del gene ⁹ ha generazione sistematica antigene, in particolare di domini isolati, ragionevolmente conveniente e può potenzialmente alleviare la difficoltà di ottenere quantità sufficienti di purificato, antigeni full-length. Utilizzando le due tecnologie in tandem, una pipeline autonomo e generazione antigene scalabile e selezione anticorpo è stato ideato che consente l'isolamento parallelo di anticorpi per grandi insiemi di domini antigeni espressi e facilitare lo sviluppo di reagenti per characterizing intere classi di proteine ​​strutturalmente o funzionalmente collegate.

Verso questo obiettivo, una pipeline integrata che è stato sviluppato coppie in silico individuazione di domini antigene esprimibili, sintesi genica, espressione batterico high-throughput di antigeni e anticorpi selezioni scalabili fagi-visualizzato. Questo gasdotto richiede solo infrastrutture di base a disposizione la maggior parte dei laboratori di scienze della vita (comprese le biblioteche di anticorpi che sono sempre disponibili tramite licenza o trasferimento di materiale accordo), ma è anche suscettibile di automazione per l'utilizzo su scala industriale. Utilizzando questo protocollo, è possibile generare centinaia di domini antigene-tag di affinità e di routine isolare altamente specifici frammenti anticorpali a molti di questi antigeni.

Tecnologia di visualizzazione dei fagi ha dimostrato la compatibilità dimostrata con una vasta gamma di formati di reagenti affinità ricombinanti tra cui Fab, scFv, e domini autonomi Fv ecrescente schiera di piccoli 'quadri alternativi "(progettati proteine ​​ankyrin ripetizione (DARPINS), fibronectina (FN), domini lipocalina e più ^10). La discussione è limitata in questo esempio per l'isolamento di frammenti anticorpali Fab, anche se si presume questi metodi possono essere adattati ad altri tipi di librerie. Grazie a questa tecnologia, Fabs con bassa affinità nanomolare piccolo, tagged domini proteici compresi settori fattore di trascrizione, i domini SH2,-RNA binding proteine ​​e altri sono stati selezionati con successo, molti dei quali legano la proteina full-length e sono funzionali in test immunologici quali immunofluorescenza , immunoprecipitazione ed immunoistochimica. È importante sottolineare che, cloni vincolanti ricombinanti sono completamente rinnovabili e possono essere rigenerati dalla espressione costruisce attraverso un'offerta produzione batterica maggiore coerenza, riproducibilità ed economicità, giustificando così la spesa di convalida clone rigorosa.

In questo protOcol e video di accompagnamento, sono dimostrati metodi di base per la selezione di anticorpi da librerie fagiche-visualizzato utilizzando domini antigene immobilizzati. Questo particolare metodo utilizza i domini di proteine ​​GST-tagged immobilizzati per adsorbimento passivo in micropiastra, anche se altri tag ^11,12,13 e formati di selezione ^13,14,2 sono stati utilizzati con successo. Considerazioni critiche per l'impostazione e lo svolgimento delle selezioni con monitoraggio parallelo di parametri di selezione volti a identificare e isolare anticorpi monoclonali specificamente arricchiti per la convalida sono dettagliati.

Protocollo

1. Generation Antigen

NOTA: i domini Antigen può essere sintetizzato e clonato da una varietà di fornitori commerciali a un adeguato espressione costrutto IPTG-inducibile.

1. Trasforma costrutti di espressione in chimicamente competente, T1-fago resistente, BL21 E. coli di miscelazione 10 ng di DNA codificante in 20 ml di 1X KCM su ghiaccio in una piastra da 96 pozzetti PCR seguita dall'aggiunta di 20 L di cellule chimicamente competenti.
2. Incubare la miscela di cellule / DNA in ghiaccio per 20 minuti, a temperatura ambiente per 10 minuti e poi in ghiaccio ancora per 2 minuti prima di salvataggio con 100 ml di brodo eccellente ottimale pre-riscaldato con glucosio (SOC) i media, coprendo con un sigillo piatto traspirante e agitazione a 37 ° C per 1 ora a 200 rpm in un agitatore orbitale 2,5 centimetri.
3. Tavola 5 microlitri di cellule trasformate a Luria-Bertani (LB) piastre di agar addizionato con / carbenicillina (100 g / ml) e crescere O / N per ottenere colonie singole utilizzati pergenerando scorte glicerolo.
4. Seminare 1 ml di 2YT media / carb con 5 ml di glicerolo magazzino e crescere per 12 ore a 37 ° C in un blocco di 96 ben profondo bene con agitazione a 200 rpm in un 2,5 centimetri agitatore orbitale.
5. Seminare NZY media15 (integrato con 0,05% di glucosio, 2% di lattosio e 100 g / ml carbenicillina) con una diluizione 1:40 di questa cultura, poi agitare per 6-8 ore a 30 ° C e 200 rpm in un orbitale 2,5 centimetri shaker.
6. Batteri pellet e purificano proteine ​​antigeniche in high-throughput in un piatto di filtro a 96 pozzetti contenente 100 ml di resina Ni-NTA secondo protocols16,17 pubblicato in precedenza.
7. Determinare la concentrazione di proteine ​​purificate da Bradford-dye vincolante assay18 e si caratterizza per le dimensioni e la purezza, la separazione e la visualizzazione di 10-50 mg con macchia Coomassie su un gel SDS-page (vedi figura 2).
   NOTA: In questa fase le proteine ​​può essere ulteriormente caratterizzata da metodi che valutano la proteina aggregazione ¹⁹ o piegatura ²⁰ a seconda della natura dell'antigene e requisiti della tubazione di selezione.

2. Preparazione e titolazione della Biblioteca dei fagi

1. Scegli una singola colonia di T1 fago resistenti E. coli cellule in 1 ml di media 2YT integrato con 50 mg / ml tetraciclina.
2. Una volta che la crescita cellulare è visivamente stabilito, diluire la cultura in un volume maggiore di 2YT integrata con 50 mg / ml di tetraciclina per garantire un volume sufficiente di cellule per l'infezione (in genere 45 ml per la diluizione biblioteca, vedi sotto.).
3. Preparare la libreria per l'uso da precipitare il fago dal buffer di memorizzazione con 1/5 ° volume autoclavato 20% PEG-8000, 2.5 M NaCl (PEG-NaCl) incubazione in ghiaccio per 30 min e pellet precipitato fago per centrifugazione a 12.000 x g.
4. Eliminare il surnatante e risospendere precipitato fago in un volume adeguato di 1x PBS pH 7.4, 0.2% BSA e 0,05% Tween (PBT), regolazione to una concentrazione fago appropriato per le selezioni (se necessario) per garantire una copertura adeguata biblioteca. Vedere il punto 2.9 e discussione.
5. Diluire 5 ml fago aliquota in 45 microlitri di 1x PBS pH 7.4 in un piatto multi-bene sterili, mescolare e creare una serie di 10 diluizioni nello stesso tampone.
6. Aggiungere 5 ml di ogni diluizione fago a 45 ml di T1 fago resistente E. coli cellule in fase di crescita di registro (OD ₆₀₀ = 0,4-0,8) in un altro piatto pozzetti, coprire con un sigillo traspirante e incubare a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 30 minuti in un 2,5 centimetri agitatore orbitale.
7. Tavola 5 ml di cellule infettate da ciascuno dei pozzetti di una piastra di agar preriscaldata integrato con 100 g / ml carbenicillina e crescere O / N a 37 ° C fino colonie sono visibili.
8. Calcolare il totale fago / ml come segue:
   Phage / ml = numero di colonie su una piastra carbenicillina nel diluire il campione x 200 x 10 ⁱ (i = massimo num piùBER di diluizioni in cui le colonie sono evidenti).
9. Per determinare il numero di pozzetti rivestiti di antigene per assicurare la copertura della diversità biblioteca, calcola come segue:
   Numero di pozzetti dell'antigene rivestiti richiesto =
   Copertura piega desiderata * diversità biblioteca
   # Di fago per 100 ml

3. Anticorpo Selezione da librerie fagiche-visualizzato

3.1) Antigen immobilizzazione

1. Per evitare cicli di gelo-disgelo, che possono influenzare la qualità dell'antigene e per facilitare diluizioni, preparare un piatto di proteine ​​magazzino dell'antigene normalizzato a 100x concentrazioni di lavoro (ad esempio, 500 g / ml) e aliquote per non vincolanti piastre da 96 pozzetti.
2. Preparare piatti antigene rivestite da soluzioni magazzino proteine ​​un giorno prima di ogni turno di selezioni diluendo dai piatti azionari con PBS.
3. Coat 96 pozzetti lastre di polistirene di legame alle proteine ​​alti con 100 ml di proteina dell'antigene GST-tagged o controllo negativo protein (GST, BSA, neutravidina, etc.) a 5 mg / ml in PBS. Agitare a 250 giri al minuto 4 ° CO / N, un vortex.
4. Rimuovere la soluzione di proteine ​​dal rivestito micropiastre, bloccare le piastre antigene rivestite e di selezione negativa con 200 microlitri tampone di bloccaggio (0,2% BSA in 1x PBS pH 7.4) e agitare a 250 rpm a temperatura ambiente per 1-2 ore.
5. Dopo il blocco, lavare le piastre rivestite con proteine ​​bloccate quattro volte con 200 microlitri di PBS 1x pH 7,4 con 0,05% Tween (PT) tampone manualmente oppure utilizzando un lavatore automatico di micropiastre.

3.2) Biblioteca pre-clearance e Antigen-fago incubazione

1. Esaurire la biblioteca di non (o su tag) specifici fago-visualizzato cloni di frammenti di anticorpi leganti tramite trasferimento di 100 ml (10 ¹²⁾ fagi di biblioteca fagi preparato in tampone PBT ad un numero di pozzi rivestiti con proteine ​​controllo negativo o tag affinità gratuito proteine ​​(ad esempio, GST) pari al numero di obiettivi e incubare fagoin pozzi per 1-2 ore a temperatura ambiente con agitazione a 250 rpm.
   NOTA: Come alternativa o ulteriori mezzi di selezione negativa, incubazione può anche essere eseguita in presenza di un eccesso (5-25 mM) tag di affinità proteina solubile (ad esempio, GST) per rimuovere ulteriormente cloni-tag legame e migliorare il recupero di destinazione specifica cloni vincolante.
2. Trasferimento fago surnatante dalla selezione negativa a piastre antigene-rivestito e incubare per 1-2 ore a temperatura ambiente con agitazione a 250 rpm per la cattura di specifici cloni vincolanti.
3. Rimuovere fago non legato e lavare i pozzetti della micropiastra 8-15 volte con tampone di PT manualmente o utilizzando una rondella micropiastre. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso appena prima eluizione.

3.3) eluizione, infezione e fagi Amplificazione

1. All'inizio della giornata di selezioni, scegliere una singola colonia di T1 fago resistenti E. coli cellule in 1 ml di supporti 2YT integrato con 50 ug / ml di tetraciclina e crescere a 37 ° C with agitazione a 200 rpm in un 2,5 centimetri agitatore orbitale o equivalente.
2. Una volta stabilita la crescita cellulare e può essere visto da occhio, aumentare il volume del supporto con 2YT integrato con 50 ug / ml di tetraciclina per garantire un volume sufficiente di cellule per l'infezione (generalmente 100 microlitri per selezione ben).
3. Crescere le cellule finché un OD ₆₀₀ di 0,4-0,8 è raggiunto (circa 5-7 ore), poi per eluire fago bound aggiungere 100 microlitri di cellule alla piastra dell'antigene lavato e agitare a 37 ° C per 30 min.
4. Aggiungere M13K07 helper phage ad una concentrazione finale di 1 x 10 ¹⁰ CFU / ml e incubare a 37 ° C per 45 minuti con agitazione a 200 rpm.
5. Trasferire le cellule in 1,2 ml di 2YT integrate con 150 mg / ml carbenicillina e 75 ug / ml kanamicina in un blocco ben 96 pozzetti profondi con V-bottom e crescere O / N a 37 ° C con agitazione a 200 rpm in 2,5 centimetri agitatore orbitale.

3.4) Phage Preparazione e Rounds ripetute di Seleczione

1. Batteri pellet per centrifugazione a 4.000 xg per 15 min a 4 ° C.
2. Miscelare uguali volumi di surnatanti fagi da lastre replicate in un mini-tube 96 pozzetti sterili micropiastre blu box, neutralizzare con ^1/10 volume di 10X PBT e mescolare. Ripetere round di selezione (a partire dal punto 3.1.1) per 3-4 turni o fino a quando si osserva l'arricchimento (Vedere le sezioni 4. e 7.) rispetto alle proteine ​​di controllo negativo.
   NOTA: Nei primi turni di selezione quando non è previsto significativo arricchimento / rilevabile (cioè, arrotonda 1 e 2), la quantificazione di ingresso e di uscita dei fagi titoli (descritte nella sezione 7 e risultati rappresentativi mostrato in Figura 3) può essere utile per garantire Le concentrazioni minime fagi per le selezioni di successo (descritti in discussione) e siano più appropriate di ELISA pool.

4. Caratterizzazione by pool ELISA

1. Coat 96 pozzetti ad alto contenuto proteico-binding lastre di polistirene con 100 ml di GST-tagged proteine ​​antigene o proteina di controllo negativo (GST, BSA, neutravidina etc.) a 2 mg / ml di cui alla Sezione 3.1 e agitare a 4 ° CO / N.
2. Rimuovere eccesso di antigene, bloccare la piastra con 200 ml di tampone di bloccaggio con agitazione per 1-2 ore a temperatura ambiente a 250 rpm su un agitatore per micropiastre e lavare quattro volte con tampone di PT 200 microlitri mano o con apparecchio di lavaggio piatto.
3. Applicare 100 ml di surnatante fago (diluito 1: 10-1: 20 in tampone PBT), agitare a 250 rpm per 15 minuti a RT, e lavare la piastra otto volte con tampone di PT 200 microlitri.
4. Aggiungere 100 ml di anti-M13-HRP (1: 5.000 in tampone PBT). Agitare a 200 rpm per 30 min a temperatura ambiente, poi lavare la piastra sei volte con tampone PT 200 microlitri e due volte con 200 ml di PBS.
5. Applicare 100 ml di 1: 1 substrato TMB e sviluppare per 5-15 min (o fino a colore sostanziale ha sviluppato), quindi arrestare la reazione mediante aggiunta di 100 ml di 1 MH ₃ PO ₄ e leggere a 450 nm.
6. In generale, l'arricchimento in piscine fagiche può essere osservato in turni 3-4 come rapporto di legame specifico rispetto legame non specifico di> 2 (vedi figura 4)
   NOTA: E 'informativa notare che segnale alto vincolante assoluto sulla proteina tag affinità indica l'arricchimento di leganti specifici tag (anziché leganti target), e che segnale alto vincolante assoluto sulla proteina di controllo negativo indica l'arricchimento di non-specifico o " leganti appiccicoso ".

5. Clone Selection, Sequencing e caratterizzazione

5.1) Isolamento di singoli cloni Fab-fago

1. Per isolare cloni individuali per il sequenziamento e la caratterizzazione, infettare ^1/10 volume della piscina fago amplificato per T1 fago resistenti E. coli cellule in fase di log di crescita (OD ₆₀₀ = 0,4-0,8) in micropiastra a fondo rotondo, coprire con un Breathaguarnizione della piastra bile e incubare con agitazione a 200 rpm per 30 min a 37 ° C.
2. Preparare diluizioni seriali di 10 volte nei media 2YT e piastra su piastre di agar separati integrati con 100 g / ml carbenicillina.
3. Scegli singole colonie in 450 ml di mezzi 2YT / carb integrati con 1 x 10 ⁹ M13K07 fago / ml e crescere O / N in un mini-tubo 96 e sterile microplate blu box incubazione a 37 ° C con agitazione a 200 rpm.
4. Batteri pellet di filatura a 4.000 xg per 10 min a 4 ° C.
5. Clonale fago supernatante può essere utilizzato per il sequenziamento dei cloni Fab-fagi (come descritto nella Sezione 5.4) o per clonale diretta vincolante ELISA per determinare la specificità contro antigeni immobilizzati (come descritto nelle sezioni 5.3 e ²¹⁾ per i quali i risultati rappresentativi sono mostrati in figura 5.

5.2) Espressione di Fab cloni per la caratterizzazione

1. Dopo la clonazione in un adeguato expression vettore (vedi la discussione), selezionare singola E. coli colonie trasformate con espressione crea per 1 ml di 2YT media / carb in un piatto ben 96 profondo bene con una punta stuzzicadenti o pipetta sterile e crescere per 12-16 ore a 37 ° C con agitazione a 200 rpm. Questo può essere fatto manualmente o con un selettore colonia automatizzato.
2. Trasferire 40 ml di cultura in crescita a 1,5 ml di mezzi nZY integrato con glucosio / lattosio / glicerolo in un blocco ben Deepwell 96 secondo la metodologia di Studier et al. ¹⁵
   NOTA: In alternativa, le cellule possono essere coltivate per 3-4 ore (OD 0.8-1.0) nell'espressione non integrato e proteine ​​indotta mediante l'aggiunta di 1 mM IPTG.
3. Coprire il blocco coltura (s) con una guarnizione traspirante ed esprimere Fab cloni per 6-8 ore a 30 ° C con agitazione a 200 rpm. Piastre Spin a 4.000 xg per 15 min a pellet cellule batteriche, rimuovere il surnatante, piastre di copertura con un sigillo di alluminio e congelare pellet a -20 ° C fino lisi.
4. Liberate Fabs espresse dal pellet raccolti con 100 ml di tampone di lisi (Tris HCl 50 mM, NaCl 200 mm, 1,25% Triton X-100 pH 8.0 con 1 mg / ml di lisozima e 10 U benzonasi / cultura ml e inibitori della proteasi) e agitazione per 2 ore a 4 ° C.
5. Rimuovere i detriti delle cellule per centrifugazione a 4.000 xg per 15 minuti a 4 ° C e raccogliere greggio surnatante lisato per l'uso in prima caratterizzazione della specificità da piastre ELISA (vedere paragrafo 5.3).

5.3) Clone Caratterizzazione da Direct Binding clonale Fab ELISA

1. Immobilizzare antigeni come descritto nella sezione 3.1, invece aliquotting 30 ml di 2 mg / ml di antigene in PBS a pozzetti di una piastra ben 384. Basata Quad-layout antigene nella piastra possono facilitare reattivo quando si utilizza 96 teste di dosaggio in funzione del canale. Lavare e blocco piastre ELISA ai sensi dell'articolo 3.1.
2. Lisati sgomberati raccolti da Sezione 5.2 può essere applicato direttamente all'antigene immobilizzato per evatazione di associazione. Incubare 30 ml di lisato per bene per 15 minuti a RT con agitazione a 200 rpm.
   NOTA: proteina purificata clone Fab può alternativamente essere utilizzato diluendo a 10 ug / ml in tampone PBT e applicando 30 microlitri di ciascun clone di pozzetti bloccati contenente antigene o proteina controllo negativo (GST, ecc BSA) e sviluppando nello stesso modo descritto seguito. In alternativa, Fab-fago può anche essere utilizzato diluendo 10 ml di fago surnatante (descritta nel paragrafo 5.1) in 20 microlitri di buffer PBT (1: 3) e rilevando con anticorpi anti-M13-HRP (descritto nei passaggi 4,4-4,5)
3. Rimuovere l'eccesso lisato e lavare pozzi manualmente o utilizzando una piastra automatico lavato 8x con 100 ml di buffer di PT e rimuovere il tampone in eccesso.
4. Incubare 30 ml di una diluizione 1: 5000 di anticorpo anti-FLAG secondaria in tampone PBT per 30 minuti a RT con agitazione a 200 rpm.
5. Lavare, sviluppare e quantificare come da sezioni 4,3-4,5.
   NOTA: I risultati rappresentativiillustrano cloni vincolanti sia specifici e non specifici sono mostrati in Figura 5.

5.4) Clone Sequencing

1. Preparare una master mix PCR come indicato nella tabella 2.
2. Aggiungere 2 ml di appropriata template PCR (o fago surnatante o singola colonia batterica ri-sospeso-fagemidi contenenti) a 20 ml di PCR master mix preparata con primer adeguati in pozzetti di una piastra PCR.
   NOTA: Master Mix separati sono necessari per il sequenziamento di entrambi i geni della catena pesanti e leggeri.
3. Eseguire la reazione di PCR utilizzando i parametri indicati nella tabella 2 - Impostazioni PCR.
4. Verificare successo della reazione PCR mescolando 5 ml di reazione completata con colorante di caricamento su un gel di agarosio 1% supplementato con macchia visualizzazione DNA e immagini su un transilluminatore a 300 nm.
5. Aggiungere 2 ml di prodotto di PCR a 10 ml di acqua sterile contenente 0,2; Microlitri ciascuno di esonucleasi e alcalino fosfatasi gamberetti e incubare a 37 ° C per 20 minuti seguito da inattivazione enzimatica a 80 ° C per 10 minuti per rimuovere i primer in eccesso in preparazione per il sequenziamento.

6. Scaling per Automated Selezioni

6.1) basata Pipetta-Handling Liquid

1. Preparare un 1% (w / v) blu di bromofenolo in acqua e rimuovere le particelle insolubili usando un filtro da 0,45 ml.
2. Per determinare il campo lineare di assorbanza sul lettore piatto, preparare una diluizione 1: 1.000 del bromofenolo soluzione blu 1% in acqua, e continuare con due diluizioni seriali (16 diluizioni totale).
3. Trasferire 100 ml di ogni diluizione ad un fondo 96 pozzetti piatta e leggere l'assorbanza a 590 nm. Plot assorbanza assoluto rispetto fattore di diluizione e scegliere una diluizione a metà di fascia alta del range lineare per le prove successive.
4. Aggiungere blu di bromofenolo all'acqua o alla soluzione effettivache sarà pipettato basato sulla diluizione scelta nel passaggio precedente in volume sufficiente per pipettamento per tre 96 pozzetti, più il volume morto nel serbatoio.
5. Calibrare una pipetta a singolo canale per fornire il volume di prova pipettando acqua su una bilancia analitica (100 ml di acqua pesa 100 mg a RT.)
6. Usando il pipettatore calibrato, trasferire il volume di prova della soluzione tinto di almeno tre pozzi di fondo 96 pozzetti piatta e leggere i loro assorbanza a 590 nm, in triplice copia.
7. Pesare tre a fondo piatto 96 pozzetti vuoti su una bilancia analitica e registrare le loro masse.
8. Pipetta volume di prova dal serbatoio a ciascuno dei tre 96 pozzetti e misurare le loro assorbanza a 590 nm, in triplice copia.
9. Pesare ciascuna piastra e calcolare la differenza di massa.
10. In primo luogo, valutare se l'assorbanza di ciascun pozzetto sono uniformi all'interno della gamma di tolleranza (ad es., +/- 5%) e se sono coerenti con the assorbanza ottenuta a mano-pipettaggio con la Pipetman calibrata. Se i canali particolari sono costantemente sovra o sotto-fornitura (per esempio vedi figura 6), seguire le procedure di riparazione e ripetere la procedura di valutazione fino a quando tutti i canali offrono i volumi uniformi.
11. In secondo luogo, una volta che tutti i canali sono confermati a fornire volumi uniformi, verificare l'esattezza di tale volume, calcolando la differenza media di massa, per pozzetto. Per esempio, un insieme gestore liquido perfettamente calibrata per 100 microlitri fornirà 9.60 g di acqua per piastra, o 0,10 g di acqua per pozzetto. Se il volume reale erogata è costantemente sopra o sotto il volume desiderato, poi un fattore di correzione può essere applicato, ad esempio, programmazione 110 microlitri per fornire effettivamente 100 microlitri.
    NOTA: Per piccoli volumi, ad esempio, 10 microlitri, utilizzare dieci volte più blu di bromofenolo nella soluzione tinto, e pre-aliquota 90 microlitri di acqua alle piastre a 96 pozzetti a mano, per garantire che il absorbances sono misurabili e la caduta nella gamma lineare.

6.2) lavaggio automatico Piatto

1. Immobilizzare target positivo e di proteine ​​di controllo negativo in pozzetti separati di 96 pozzetti (due piastre per ogni condizione di essere testati), come descritto nella sezione 3.1.
2. Bloccare non specifici siti di legame di incubazione con la soluzione di blocco per un ora a RT.
3. Aggiungi identiche aliquote di 100 microlitri di una ufc 10 ¹³ / ml obiettivo vincolante soluzione Fab-fago in PBT per tutti i pozzetti di tutte le piastre e incubare con agitazione a temperatura ambiente per 2 ore.
4. Lavare due piastre in base alla situazione, una piastra per l'infezione e di titolazione e una piastra per ELISA.
5. Valutare l'efficacia del lavaggio per contagio diretto in batteri e di titolazione (come descritto nella sezione 3.3 (senza M13K07 aggiunta) e 7.2.1) o di sviluppo con M13 anti-anticorpo HRP e substrato colorimetrico (come descritto nella Sezione 4).
6. Titres fago from cloni specifici spesso cedere nell'intervallo 10 ⁵ -10 ⁷ fago / ml da una proteina immobilizzata contro cui il clone lega specificamente. Alcuni residui di legame alle proteine ​​controllo negativo (ad esempio, BSA) è prevedibile e in generale 10 ² -10 ⁵ fago / ml si osservano, tuttavia molto basso titolo (es., <10 ¹⁾ può segnalare lavaggio eccessivamente stringenti, che possono compromettere una selezione.
7. Per fago legame determinato dalla ELISA, confrontare i segnali vincolanti assoluto per le proteine ​​di controllo positivi e negativi per determinare se il lavaggio robotica equivale a risultati di lavaggio a mano stabiliti (Figura 7).

6.3) Piastra Rondella Decontaminazione

1. Per iniziare, eseguire il protocollo di decontaminazione da testare.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare almeno il doppio del volume totale della linea, e il primo e immergere la testa di lavaggio per 5 min in 0,5% di ipoclorito di sodio, fr fresco diluitoom candeggina commerciale (in genere 6% di ipoclorito di sodio).
2. Prime e immergere la testa di lavaggio per 5 minuti a sterile (autoclave) acqua e infine, il primo sistema fino a quando le linee sono pieni d'aria.
3. Prime le linee con acqua sterile o tampone di lavaggio.
4. Lavare sterile micropiastra 96 ​​bene una volta, togliere dal lavatrice e sigillare con guarnizione piastra sterile. Questa è la piastra di controllo pre-contaminazione.
5. Aliquotare 100 ml di O / N amplificati cultura fago surnatante in tutti i pozzetti di una piastra ben 96.
6. Lavare la piastra-fago contenente una volta, quindi rimuovere dalla lavatrice e sigillare con un sigillo piatto di plastica o carta stagnola. Questa è la piastra di controllo della contaminazione.
7. Effettuare il protocollo di decontaminazione in fase di test. In questo esempio, ripetere i passaggi 6.3.1 e 6.3.2.
8. Lavare micropiastra sterili una volta, quindi togliete dal lavatrice e di tenuta. Questa è la piastra di prova decontaminazione.
9. Piatto 50 ml di fase log E. coli alle piastre di titolazione; questo è il pre-infepiastra di controllo zione.
10. Dissigillare pre-contaminazione, contaminazione e decontaminazione piastre da 96 pozzetti e aggiungere 100 ml di E. coli in fase di fase di crescita logaritmica a tutti i pozzetti, utilizzando nuove punte per ogni bene.
11. Sigillare e incubare a 37 ° C per 30 min a 200 rpm.
12. Piatto 50 ml di cellule infette da tre pozzi casuali di ogni piastra a 96 pozzetti per 10 centimetri piatti 2YT / carb e incubare a 37 ° CO / N.
13. Trasferire 50 ml di cellule infette da tutti i pozzetti di ogni piastra a pozzetti profondi contenenti 1 ml 2YT più 100 g / ml carbenicillina per bene e crescere O / N a 37 ° C.
14. Ripetere il protocollo di decontaminazione e lasciare la rondella linee asciutte.
    NOTA: No O crescita / N su piastre o in mezzo liquido deve osservare sulle piastre di controllo pre-infezione, controllo pre-contaminazione o prova decontaminazione. Molte colonie e la crescita devono essere osservati sulla piastra di controllo della contaminazione; se non, alcuna conclusione circa l'efficacia delprotocollo di decontaminazione può essere fatto. Idealmente, le piastre di decontaminazione produrrà senza colonie e non O crescita / N in uno dei pozzi nel O / N piastre. La rigorosità del protocollo di decontaminazione può essere aumentato con concentrazioni più elevate di candeggina, orari e ulteriori cicli più ammollo.

7. Input / Output titolazioni

7.1) titolazioni fagi Input

1. Diluire un'aliquota 5 ml di fago a 50 ml con sterile filtrata PBS e mescolare.
2. Preparare serie di diluizione di 10 volte in sterile filtrata PBS per ¹⁰ 10 con pipetta multicanale o una pipetta a 96 canali.
3. Seminare 5 ml di fago diluito in 45 ml di T1 fago resistenti E. coli in log-fase di crescita (OD 0,6-0,8) e incubare coperto con una guarnizione traspirante per 30 minuti a 37 ° C.
4. Tavola 5 ml di cellule infette su di un / piastra di agar LB addizionato con 100 mg / ml e incubare carbenicillina O / N at 37 ° C.
5. La concentrazione fago può essere stimato dal campione più diluito in cui le colonie appaiono secondo i calcoli descritti nel paragrafo 2.8.

7.2) Uscita Phage Pitrations

1. Dopo eluizione della piastra-bound fago mediante aggiunta di E. coli cellule, diluire un'aliquota 5 microlitri di cellule fago infettate a 50 ml con i media 2YT autoclave
2. Preparare serie di diluizione di 10 volte nei media 2YT autoclave a 10 ⁶ utilizzando una pipetta multicanale o 96 canali pipetta.
3. Tavola 5 ml di cellule infette su di una piastra di agar integrato con 100 mg / ml carbenicillina e incubare O / N a 37 ° C.
4. La concentrazione fago può essere stimato dal campione più diluito in cui le colonie appaiono secondo i calcoli descritti nel paragrafo 2.8.
   NOTA: In entrambi i casi (ad esempio, di ingresso e di uscita dei fagi titoli, il confronto con i numeri di colonie sia tetraciclina (cel totalenumero l) e kanamicina (helper phage titolo) possono anche essere informativo.

Risultati

Il protocollo qui descritto è stato usato per isolare frammenti anticorpali ad una varietà di entrambi i domini antigene strutturalmente e funzionalmente correlati da combinatori fago visualizzato librerie Fab in parallelo. Questioni relative alla disponibilità di antigene possono essere aggirate, in molti casi, per l'identificazione in silico di domini antigene esprimibili che sono adatti per la selezione di anticorpi ^23. Accoppiando espressione dell'antigene alla selezione anticorpo nello stesso laboratorio...

Discussione

Nel condurre nelle selezioni di anticorpi in vitro, i due fattori determinanti principali di successo di selezione sono: 1) l'isolamento di obiettivi antigeniche ben piegati, per la selezione su e 2) la disponibilità di una libreria di anticorpi diversità funzionale. In molti casi, la disponibilità di quantità sufficienti di ben piegata, proteina intera può essere limitante. Un approccio per superare questa limitazione è quello di utilizzare i domini individuati dall'analisi bioinformatica

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
MATERIALI
Agitatore per incubatore impilabile New Brunswick Innova44	Eppendorf	M1282-0004
Liquidatore Sistema di pipettaggio manuale da banco a 96 canali	Anachem Ltd Anachem Ltd	LIQ-96-200
Agitatore per micropiastre	VWR	12620-926
ThermoScientific Centrifuga da banco Sorvall ST-40	Prodotto	termico
ELx405 Select Lavatrici per micropiastre a pozzetti profondi	Biotek	ELX405USD
Robot per la selezione automatizzata dei fagi ad alta produttività personalizzata	S & P Robotics
Provetta Falcon conica in plastica: 50 ml	VWR	21008-178
Provetta Falcon conica in plastica: 15 ml	VWR	89039-668
Provette per microcentrifuga Axygen da 1,7 ml	Corning	MCT-175-L-C
Piastra Maxisorp a 96 pozzetti/384 pozzetti	Sigma	M9410-1CS
Corning Blocco a pozzetti profondi con fondo a V a 96 pozzetti	Corning	3960
Axygen Mini-provetta Micropiastra sterile a 96 pozzetti scatola blu	Corning	AXY-MTS-06-C-R-S
Pellicola sigillante per piastre adesive traspirante	VWR	60941-084
REAGENTI
Nome	Azienda	Numero
polietilenglicole	Bioshop	PEG800.1
estratto di lievito	Bioshop	YEX401.1
bio-triptone	Bioshop	TRP402.1
Ammina N-Z	Sigma	C7290
glucosio	Sigma	G8270-1KG
lattosio	Bioshop	LAC234
glicerolo	Bioshop	GLY001.500
carbenicillina	Bioshop	CAR544.10
kanamicina	Bioshop	KAN201.25
tetraciclina	Bioshop	TET701.25
Tween 20 Bioshop		TWN510.500
fosfato di potassio monobasico	Bioshop	PPM302.1
fosfato di sodio bibasico	Anachemia	84486-440
cloruro di sodio	Bioshop	SOD001.10
cloruro di potassio	Bioshop	POC308.1
cloruro di calcio	Bioshop	CCL302.500
solfato di magnesio	EMD	MX0070-1
cloruro di magnesio	Bioshop	MAG510.500
NH4Cl	Amresco	0621-1KG
Na2SO4	Bioshop	SOS513.500
agar	Bioshop	AGR001.500
SybrSafe DNA gel colorante	Invitrogen	S33102
acido fosforico	Acros Organics	201140010
lisozima	Bioshop	LYS702.25
benzonasi	Novagen	71205
Triton X-100		Bioshop	TRX506.500
cocktail di inibitori della proteasi compresse	Roche	11 836 170 001
resina Ni-NTA	Qiagen	1018240
1.000x fago helper (M13K07) stock (1013 fago per ml)	NEB	N0315S
HRP coniugato anticorpo M13-specifico (anti-M13-HRP).	Substrato TMB GE Healthcare	27-9241-01
miscelare volumi uguali di TMB e substrato di perossidasi H2O2	KPL	50-76-00
dNTP	Biobasic	DD0056
Taq polimerasi	Genscript	E00007
Esonucleasi	GE Healthcare	EZ0073X-EZ
Fosfatasi alcalina per gamberetti	GE Healthcare	E70092Z-EZ