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Articolo metodologico

Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

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DOI:

10.3791/51542

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20 agosto 2014

 ,  ,  , 
1Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 2Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 3Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 4The RNA Institute, University at Albany, State University of New York, 5Department of Biological Sciences, University at Albany, State University of New York

In questo articolo

Sommario

Le pinzette ottiche sono state utilizzate per studiare il ripiegamento dell'RNA allungando le singole molecole dalle loro estremità 5' e 3'. Qui vengono descritte le procedure comuni per sintetizzare molecole di RNA per la pinzetta, la calibrazione dello strumento e i metodi per manipolare singole molecole.

Abstract

Una gran parte del genoma umano viene trascritto ma non tradotto. In questo post genomica, funzioni di regolamentazione di RNA hanno dimostrato di essere sempre più importante. Dato che la funzione RNA spesso dipende dalla sua capacità di adottare strutture alternative, è difficile prevedere RNA strutture tridimensionali direttamente dalla sequenza. Singola molecola approcci mostrano potenzialità per risolvere il problema di RNA polimorfismo strutturale monitorando strutture molecolari una molecola alla volta. Questo lavoro presenta un metodo per manipolare con precisione la piegatura e la struttura delle molecole di RNA singoli utilizzando pinzette ottiche. In primo luogo, i metodi per sintetizzare molecole adatte a singola molecola lavoro meccanico sono descritti. Avanti, diverse procedure di calibrazione per garantire le operazioni corrette delle pinzette ottiche sono discussi. Successivamente, vari esperimenti sono spiegati. Per dimostrare l'utilità della tecnica, i risultati di dispiegamento meccanicamente forcine RNA e un singolo RNA kissing complesso sono utilizzati come prova. In questi esempi, la tecnica nanomanipolazione stato utilizzato per studiare piegatura di ciascun dominio strutturale, comprese secondaria e terziaria, in modo indipendente. Infine, le limitazioni e le future applicazioni del metodo sono discussi.

Introduzione

Lo sviluppo della tecnica pinzette ottiche è stata a lungo accompagnato con la sua applicazione nella ricerca biologica. Quando l'effetto intrappolamento ottico è stato scoperto, Arthur Ashkin osservato che i batteri in acqua contaminata potrebbero essere intrappolati nel fuoco del laser 1. Da allora, i batteri trapping è diventato un involontario, divertente esperimento per generazioni di studenti biofisica, nonché come strumento di ricerca seria per studiare la fisiologia microbica 2,3. La tecnica di intrappolamento ottico utilizza focalizzato fascio laser per immobilizzare un oggetto microscopico 1. In pratica, una funzione di limitatore laser come una molla ottico, che misura anche la forza (F) sull'oggetto intrappolato dal suo spostamento dal centro della trappola (AX). Entro un breve intervallo, F = κ x AX, in κ è la costante della molla della trappola. La trappola ottica può essere utilizzato per esercitare una forza in piconewton (PN) di precisione ad un microsoggetto Copic e misurare la sua posizione con nanometri (nm) di precisione. Negli ultimi due decenni, pinzette ottiche sono diventati una delle più utilizzate tecniche di singola molecola in biofisica. La tecnica è stata impiegata per studiare piegatura e la meccanica di 4-6 DNA, RNA 7-9, e le proteine ​​10,11. Pinzette ottiche sono stati utilizzati anche per osservare la replicazione del DNA 12, trascrizione dell'RNA 13, e la sintesi proteica 14,15, così come molti altri eventi biomolecolari 16-18.

Approcci singola molecola sono impiegati in RNA ricerca strutturale principalmente per esplorare il paesaggio aspro energia folding di RNA. Una sequenza di RNA di solito può piegare in più stabili, strutture si escludono a vicenda, a causa delle semplici di composizione chimica e di sbucciatura base di regole di RNA. E 'noto da tempo che l'RNA polimorfismo strutturale, come ad esempio che si verifica in riboswitches 19,20, gioca un ruolo importante nella regolazione genica. A Recent sondaggio a livello di genoma ha rivelato che le variazioni di temperatura di soli pochi gradi influenzano notevolmente la struttura e la sintesi proteica di una grande porzione del trascrittoma cellulare 21. Questo esempio suggerisce che il ruolo biologico di RNA folding alternativa è forse più importante e pervasivo di quanto precedentemente ipotizzato. Polimorfismo strutturale, tuttavia, rappresenta una sfida per i tradizionali approcci biochimici e biofisici, che esaminano le proprietà medie di molte molecole. Ad esempio, la "a" e conformazioni "off" di un riboswitch si escludono a vicenda. Una struttura media derivato da strutture eterogenee non è in grado di assomigliare uno dei conformeri biologicamente rilevanti. Inoltre, RNA non tradotta e mRNA di solito formano strutture. La loro interazione con proteine ​​e RNA regolatori comunemente richiede svolgersi della struttura esistente come parte dell'interazione. Pertanto, lo studio di RNA dispiegamento / ripiegamento diventa un pertinentequestione di RNA biologia. Per rispondere a tale sfida, l'approccio di singola molecola è stato impiegato per svelare RNA polimorfismo strutturale studiando una molecola alla volta 22-27.

Rispetto al popolare metodo di fluorescenza singola molecola, pinzette a base meccanica dispiegarsi offre un vantaggio che conformazioni delle singole molecole possono essere manipolati con la forza applicata e essere misurate con precisione nanometrica. Questa capacità nanomanipolazione può essere utilizzato per monitorare il dispiegamento / ripiegamento dei singoli domini strutturali tali che la piegatura gerarchica di un grande RNA può essere sezionato 28. In alternativa, un singolo filo può essere diretto a piegare in uno dei diversi conformeri; o una struttura esistente può essere indotta meccanicamente per ripiegare in una diversa conformazione 29. In condizioni biologiche, una struttura di RNA può essere modificato in caso di cambio di temperatura o ligando. La capacità di manipolare direttamente s molecolariTRUTTURA apre una nuova sede di RNA studio strutturale. In linea di principio, altre tecniche meccaniche come microscopio a forza atomica e pinzette magnetiche, possono anche essere utilizzati per studiare piegatura di singole molecole di RNA. Tuttavia, tali applicazioni sono limitate soprattutto a causa della risoluzione spaziale relativamente bassa 30.

L'impiego di pinzette ottiche permette strutture di RNA di essere spiegati con la forza meccanica.

Il vantaggio di meccanica svolgimento è diverse volte. La forza può essere usata per spiegare sia le strutture secondarie e terziarie, mentre gli ioni metallici e ligando indotta piegatura sono limitati principalmente a strutture terziarie. Temperatura e denaturante possono influenzare in modo significativo le attività di acqua e soluti. Al contrario, la forza viene applicata localmente per perturbare strutture molecolari; l'effetto della forza sull'ambiente circostante è trascurabile. Inoltre, la fusione termica è meglio utilizzato per studiare la termodinamica pieghevoli di piccole strutture di RNA,considerando pinzette ottiche sono stati utilizzati per studiare le strutture di RNA con diverse dimensioni, che vanno da un sette-base-pair tetraloop tornante 28 per un ribozyme 400-nucleotide 31. Inoltre, le strutture di RNA possono essere spiegati meccanicamente a temperature mesofili. In contrasto, di dispiegarsi RNA in un esperimento di fusione termica, la temperatura è in genere ben sollevato sopra temperature fisiologiche, che aumenta significativamente l'RNA all'idrolisi, soprattutto in presenza di ioni Mg 2 +.

È importante notare che l'effetto meccanico della forza dipende da come viene applicato ad una struttura. La forza applicata inclina il pieghevole panorama energetico. Ad esempio, quando la forza è applicata ad una forcina, le coppie di basi sono rotti in sequenza, uno alla volta (Figura 1a). La forcella strappo avanza lungo l'asse elicoidale, che è perpendicolare alla forza applicata. Al contrario, quando un complesso baciare minima è sotto tensione, i due baciandocoppie di basi, che sono parallele alla forza applicata, condividono il carico di forza (Figura 1b). Le diverse geometrie del tornante e baciare relativo complesso al risultato forza applicata nella loro risposta meccanica differente, che può essere utilizzata per distinguere secondaria e terziaria piegatura 28,32. L'aspetto teorico della meccanica svolgimento è stato già recensito 8,9,30. Questo lavoro descrive gli approcci di base per impostare ed eseguire una singola molecola meccanico test dispiegarsi.

Setup sperimentale. Nel nostro esperimento trazione meccanica, il campione di RNA per tweezing è costituito da RNA di interesse affiancato da due manici a doppio filamento di DNA / RNA (Figura 2) 7. L'intera molecola può essere legato a due perle di micron-size superficie rivestita (Spherotech) tramite streptavidina-biotina e interazioni anticorpi anti-digossigenina-digoxigenin rispettivamente. Una perla è detenuto da un tr ottica forza di misuraap, mentre l'altra si tiene sulla punta di una micropipetta. La distanza relativa tra le perline può essere cambiato da uno sterzo trappola o spostando la micropipetta. Usando questo approccio, una singola molecola di RNA legare le perline può essere allungato e rilassato.

Preparazione dei campioni. La sintesi di campioni di RNA per tweezing comprende a pochi passi (Figura 3). Innanzitutto, la sequenza di DNA corrispondente alla RNA di interesse viene dapprima clonato in un vettore plasmidico. Avanti, tre reazioni di PCR vengono eseguite per generare le due maniglie e un modello per la trascrizione. Il modello trascrizione comprende le regioni della leva e le sequenze inserite. La lunghezza totale RNA è sintetizzato in vitro trascrizione. Infine, l'RNA e le maniglie modificati chimicamente sono sottoposti a ricottura insieme per generare le molecole per tweezing.

Taratura e funzionamento delle pinzette. Il disegno di base dell'uso Minitweezersd in questo lavoro segue quello dei dual-beam pinzette ottiche 33. Con molti miglioramenti, i Minitweezers visualizzare straordinaria stabilità rispetto alle pinzette ottiche di prima generazione. Un certo numero di gruppi di ricerca in diversi paesi utilizzano le Minitweezers nella loro ricerca singola molecola 14,15,34-37. I dettagli di costruzione, taratura e il funzionamento del dispositivo, inclusi video di istruzioni, sono disponibili sul sito "Pinzetta Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Qui, miglioramenti e procedure di calibrazione che devono essere eseguite su basi giornaliere sono descritte in dettaglio.

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Protocollo

1 Preparazione di RNA Molecole per singola molecola Togliersi

  1. Clonazione la sequenza di interesse. Clonare la sequenza di DNA corrispondente alla struttura di RNA in un vettore.
  2. Sintesi e purificazione del template trascrizione. Sintetizzare un modello di trascrizione mediante PCR. [Tabella 1 posto qui] Avanti, purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR, e concentrare il campione> 200 ng / ml. Poiché il DNA purificato viene utilizzato per la trascrizione, RNasi acqua libera deve essere utilizzato nelle fasi di eluizione e concentrazione.
  3. Nella trascrizione in vitro. Sintetizzare RNA da trascrizione in vitro a 37 ° C per una notte per massimizzare la resa di RNA. [Tabella 2 posto qui] Dopo la trascrizione, aggiungere 1 ml DNasi I per digerire il DNA stampo per 15 minuti a 37 ° C. Purificare l'RNA utilizzando una colonna di spin di silice.
  4. Sintesi del biotinilato maniglia A. In primo luogo, produce la maniglia non modificato A mediante PCR utilizzando primers Af e Ar e concEntrate il DNA amplificato a> 200 ng / ml. Successivamente, incorporare modifiche biotina nel prodotto di PCR utilizzando una reazione di primer extension. [Luogo tabella 3 qui] NOTA: La maniglia biotinilato A (biotina-HA) può essere utilizzato direttamente nel ricottura, senza purificazione. Come la biotina-HA deve essere ricotto con l'RNA, è fondamentale utilizzare RNasi acqua libera in entrambe le fasi.
  5. Sintesi della maniglia digossigenina modificato B. Synthesize digossigenina modificato maniglia B (dig-HB) mediante PCR utilizzando fondo Bf e oligo-digossigenina modificato Dig-Br (Figura 3). Avanti, purificare il prodotto di PCR e concentrare il campione> 200 ng / ml.
  6. Ricottura RNA alle maniglie. Anneal l'RNA con maniglie. [luogo tabelle 4 e 5 qui]
  7. Purificare campione ricotto. Aggiungere 3 volumi di etanolo del campione ricotta e mescolare bene. Conservare la miscela a -70 ° C per almeno 1 ora. Spin down a 15.800 xg e scartare il surnatante. Asciugare il pellet con un liofilizzatore. Sciogliere il pellet in100 microlitri RNasi acqua libera. NOTA: Il campione è pronto per essere utilizzato e può essere conservato a -20 ° C.

2 Taratura e funzionamento delle pinzette ottiche

  1. Calibrare Pixel Dimensioni di Video Monitor
    1. Utilizzare la trappola ottica per intrappolare un cordone con diametro noto (dimensioni standard).
    2. Cattura immagini di un cordone intrappolato utilizzando software di imaging (Figura 4).
    3. Determinare il diametro della perlina utilizzando il software di imaging basata sul metodo centroide.
    4. Ripetere questa procedura per determinare diametri di perle di varie dimensioni.
    5. Montare i diametri misurati e conosciute di perle da una regressione lineare per ottenere la dimensione fisica di un pixel.
  2. Verifica Distanza di calibrazione
    1. Utilizzare la trappola ottica per intrappolare una perlina.
    2. Determinare la posizione dei pixel del suo baricentro dal software di acquisizione delle immagini e registrare la propria posizione utilizzando i Minitweezers.
    3. Steer il tallone di diffe affittare posizioni e ripetere la determinazione della posizione.
    4. Convertire le posizioni X e Y del tallone da pixel a m unità utilizzando la dimensione dei pixel calibrata.
    5. Confrontare il X e Y tra le posizioni misurate dal video e dai Minitweezers. I due insiemi di valori dovrebbero concordare. Poiché la risoluzione dell'immagine è> 0,1 micron, spostare il tallone sopra 1 micron tra le misure per garantire l'accuratezza. Se la calibrazione distanza non è paragonabile a quella memorizzata nei Minitweezers, ricalibrare lo strumento.
  3. Trappola Rigidità Calibrazione
    1. Catturare una perlina utilizzando la trappola ottica e tenerlo ancora.
    2. Registrare la forza della trappola con un bypass di acquisizione veloce di dati a una velocità> 5 kHz per 3 sec.
    3. Genera uno spettro di potenza dalla registrazione del movimento tallone utilizzando il software. Montare lo spettro di potenza di un Lorentziana (Figura 5) 38:
      542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Eq. 1)
      in cui S (f) è la potenza alla frequenza di f, f c è la frequenza di taglio, e S 0 è la potenza asintotica. La frequenza di taglio f c è la frequenza in cui la potenza del moto termico è sceso a metà del valore asintotico. Come f c varia con la potenza del laser e le dimensioni tallone, calibrare ogni perla intrappolati individualmente.
    4. Calcola la costante elastica della trappola, κ, da f c:
      figure-protocol-1 (Eq. 2)
      in cui γ è il coefficiente di resistenza del tallone (Eq. 3). Utilizzare la costante della molla per determinare le variazioni di estensione di un RNA dal cambiamento vigore.
  4. Stokes 'Legge di prova
    1. Catturare una perlina utilizzando la trappola ottica. Spostare il tallone posteriore-e-forza a velocità diversa.
    2. Registrare il movimento del tallone e la forza con i Minitweezers.
    3. Calcola il raggio del tallone.
      NOTA: La forza di attrito, F d, generato dal moto di una particella sferica in un fluido può essere descritto dalla legge di Stokes ':
      figure-protocol-2 (Eq. 3)
      in cui r è il raggio della sfera, v è la velocità, e h è la viscosità dinamica del fluido, che si trova in tabelle di riferimento. Utilizzando la forza misurata come F d, il raggio del cordone può essere calcolato utilizzando l'Eq. 3 (Figura 6) e deve concordare con quello determinato dal software di acquisizione immagini. Il test di legge di Stokes 'test efficace le tarature e le prestazioni dello strumento.

3. nanomanipolazione di Single RNA Molecole

  1. Fare fluidica.
    1. Praticare sei fori (mm diametro 2 ciascuno) su un vetro di copertura n ° 2 (Figura 7a) e tagliare tre fessure (larghezza 2 mm) nel lato doppio nastro poliimmide (Figura 7b) utilizzando un incisore laser.
    2. Fare una camera di flusso da sandwich di due vetro di copertura con due strati di nastro biadesivo Kapton. Inserire una micropipetta e due tubi bypass tra il nastro (Figura 7c).
    3. Montare la camera di flusso su un telaio metallico, facendo corrispondere i fori fluidici (Figura 7d).
    4. Collegare i canali fluidici della camera a 10 ml siringhe riempite con tampone di scelta tramite tubi di polietilene (Figura 7e).
    5. Montare l'intera camera sulle pinzette ottiche tra i due obiettivi. Assicurarsi che il lato anteriore della camera con i canali fluidici rivolto verso destra. Ritrarre l'obiettivo a destra e inserire i perni di ottone del telaio (Figura 7e) per fori di montaggio sulla tegli pinzette. Serrare le viti per fissare la posizione della camera.
  2. Mescolando il campione e perline ricotto. Mescolare il campione ricotto con perle anti-digossigenina-rivestite (DIG-sfere), e lasciare che la miscela di rimanere a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Tipicamente, 1 ml di campione ricotto è mescolato con 5 microlitri dig-perle in 1 ml di tampone. NOTA: La quantità di perline da caricare nella camera di flusso deve essere scelto al fine di garantire una ragionevole quantità di perline da consegnare dal tubo bypass. Il rapporto del campione ricotto per le perline non è facilmente quantificabile. In un caso ideale, la maggior parte dei branelli hanno RNA tale che solo una piccola frazione di perline può avere solo una molecola di RNA a tallone. Mentre i campioni ricotti e la sospensione di sferette sono difficili da quantificare, il migliore e unico modo attualmente è di variare il rapporto di miscelazione e testare il composto sulle pinzette.
  3. Invia perline al sito di reazione nella camera di flusso (cioè, alcuni micrometri in cima al mipunta cropipette, Figura 7c).
    1. Caricare una sospensione di perline rivestite di streptavidina (strep-sfere) in una siringa da 1 ml.
    2. Collegare la siringa al tubo fluidico che conduce al canale inferiore della camera di flusso (figura 7a).
    3. Spingere la siringa a scorrere le strep-perle nella camera.
    4. Spostare l'intera camera utilizzando il software di controllo del motore per posizionare la trappola ottica vicino all'apertura del tubo bypass inferiore (figura 7b). Quindi azionare la trappola ottica da una trackball per catturare una strep-tallone.
    5. Spostare il tallone vicino alla punta della micropipetta utilizzando il software di controllo del motore.
    6. Estrarre la siringa collegata alla micropipetta a succhiare il tallone sul micropipetta.
    7. Applicare flusso premendo delicatamente la siringa per il canale centrale per scovare strep-perline extra.
    8. Allo stesso modo, consegnare la miscela del campione e dello scavo-perline (vedi punto 3.2) al canale superiore della camera.
    9. Cattura uno scavo-tallone e portarlo vicino alla strep-tallone utilizzando la trappola ottica.
    10. Pulire il canale centrale mediante l'applicazione di flusso. NOTA: Il strep- e Dig-perle sono scelti per essere diverse dimensioni in modo che possano essere distinti visivamente sotto la vista microscopico (Figura 4).
  4. Pesca "una singola molecola di legare tra una coppia di perline.
    1. Posizionare il dig-tallone in verticale sulla parte superiore del strep-tallone (Figura 4).
    2. Spostare il dig-tallone verso il strep-tallone dal governare la trappola. Aprire una finestra del grafico forza-distanza sul computer per visualizzare i cambiamenti di forza.
    3. In caso di contatto delle due perle, spostare il dig-tallone verticalmente dalla strep-tallone.
    4. Se non viene fatto alcun contatto specifico, la forza rimane quasi zero. Se i due talloni sono collegati da molecole, la forza aumenta notevolmente quando i due talloni separati. Questa procedura, comunemente indicato come "pesca", è spesso perfORMED più volte su ogni coppia di perline per trovare un efficace cavezza singola molecola.

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Risultati

Limitato dallo spazio, nanomanipolazione di singole molecole di RNA è dimostrato mostrando solo esempi meccanici dispiegarsi di forcine RNA e di un RNA con struttura terziaria.

Manipolare singolo Hairpin Molecole

Una volta che una pastoia è stabilito tra le perle, l'estensione di e vigore alla cavezza possono essere manipolati tramite un protocollo definito dall'utente. Quattro protocolli comuni di manipolazione sono comunemente usati.

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Discussione

Modifica e risoluzione dei problemi in preparazione di campioni tweezing

Scelta di clonazione vettoriale. Sebbene lo schema generale qui descritto (Figura 3) non richiede una speciale clonazione vettore, il vettore è preferito non avere T7 intrinseca o promotore T3 per la facilità di trascrizione tale che un promotore può essere introdotto tramite PCR in posizioni desiderate.

Sequenza e Lunghezze delle maniglie...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione NSF (MCB-1054449) e da un premio collaborativo interdisciplinare per il programma di ricerca pilota dall'Istituto RNA dell'Università di Albany a PTXL.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MinitweezersSteven B. Smith Engineeringhttp://tweezerslab.unipr.it
Scheda di acquisizione datiNational InstrumentsUSB-6351
Scheda videoNational InstrumentsPCI-1407
Software di programmazione LabviewNational Instruments
NI Vision BuilderNational Instruments
Incisore laserSistemi laser EpilogueZing-16
Kit Qiagen28104
MEGAscript T7 LifeTechnologiesKit AM1334
MEGAclearLife TechnologiesAM1908
Biotin-11-UTPThermo Fisher
T4 DNA polimerasiNew England LabsM0203
Microsfera rivestita di streptavidinaSpherotechSVP-20-5
Microsfera rivestita di antidigossigeninaSpherotechDIGP-20-2
Dimensioni microsfere standardNastro Kapton SpherotechPPS-6K
Kaptontape.comKPPTDE-1
N. 2 vetri di coperturaThermo Fisher12-543D
Kit di purificazione PCR FERR0081

Riferimenti

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