Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di dimostrare un esperimento di dispiegamento meccanico di una singola molecola su una struttura di RNA. Nella prima fase, viene costruita una camera di flusso e montata sullo strumento. Nella seconda fase, le perle di dimensioni micron vengono mescolate con il campione di RNA di interesse, quindi le due diverse dimensioni di perle vengono caricate nella camera di flusso.

Infine, la camera di flusso e la trappola ottica possono essere utilizzate per guidare le perle in contatto l'una con l'altra per valutare una varietà di interazioni di singole molecole. In definitiva, questa tecnica di nano manipolazione può essere utilizzata per studiare il ripiegamento dell'RNA a livello strutturale secondario e terziario. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del ripiegamento dell'RNA, ad esempio come si piega e si dispiega un RNA?

Come transita tra diverse conferme in risposta a un cambiamento ambientale? E come interagisce con altre molecole? L'esperimento di oggi sarà eseguito dal mio studente laureato, il signor Williams Stevenson, per creare una camera di flusso, iniziare perforando sei fori di due millimetri di diametro in un vetrino coprioggetti numero due.

Quindi usa un incisore laser per tagliare tre fessure larghe due millimetri in due pezzi di nastro biadesivo in poliammide. Attacca uno dei pezzi di nastro adesivo al vetrino coprioggetto, assicurandoti di allineare i fori del nastro con i fori del vetrino coprioggetto. Attacca l'altro pezzo di nastro adesivo a un vetrino coprioggetto pulito e non forato.

Rimuovere la copertura protettiva da entrambi i pezzi di nastro adesivo, quindi posizionare una micropipetta in vetro e due provette bi tra ciascuno dei canali su uno dei vetrini. Successivamente, i due bicchieri di copertura, mantenendo in posizione la micropipetta e i tubi di bypass con i due strati di nastro adesivo. Per creare una camera di flusso, montare la camera di flusso sul retro di un telaio metallico, facendo corrispondere i fori nella camera sopra i canali fluidici.

Quindi capovolgere il telaio e collegare i canali a siringhe da 10 millilitri riempite con un tampone a scelta tramite un tubo in polietilene. Ora monta l'intera camera sulle pinzette ottiche tra i due obiettivi, assicurandoti che il lato anteriore della camera con i canali fluidici sia rivolto a destra. Quindi ritrarre l'obiettivo sinistro e inserire i perni di ottone del telaio nei fori di montaggio sulle pinzette e serrare le viti per fissare la camera in posizione.

Utilizzare una corda elastica per sollevare lo strumento dal tavolo. Racchiudere lo strumento in una scatola acustica prima di erogare le perle al sito di reazione della camera di flusso. Per prima cosa, mescolare un campione di RNA inginocchiato A con anti-D, scavare perle rivestite di ossigeno ENC o scavare perline, quindi incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti.

Durante l'incubazione, la sospensione di loto di perle spogliate e rivestite in una siringa da un millilitro e collegare la siringa al tubo fluidico che porta al canale inferiore della camera di flusso. Immergere la siringa per caricare le perle di streptococco nella camera, quindi utilizzare il software di controllo del motore per posizionare la trappola ottica vicino all'apertura del tubo di bypass inferiore e spostare l'intera camera. Quindi manipola la track ball per azionare la trappola ottica e catturare una perlina streptococcica.

Utilizzare il software di controllo del motore per avvicinare il cordone alla punta della micropipetta. Quindi, tirare la siringa collegata alla micropipetta per aspirare il cordone sulla micropipetta, quindi immergere delicatamente la siringa per applicare il flusso al canale centrale e sciacquare via le perle di streptococco rimanenti. Consegnare la miscela di campioni di perlina di scavo al canale superiore della camera e catturare una perlina di scavo come appena dimostrato.

Quindi utilizzare la trappola ottica per avvicinare il cordone di scavo al cordone di streptococco. Applicare il flusso per pulire il canale centrale. Quindi pescare una singola molecola legata tra la coppia di perline.

Posiziona la perlina di scavo catturata verticalmente sopra la perlina di streptococco. Quindi, orienta la trappola per spostare il cordone di scavo verso il basso verso il cordone streptococco e apri una finestra del grafico della distanza di forza sul monitor per visualizzare i cambiamenti di forza. Infine, al contatto, spostare il cordone di scavo verticalmente lontano dal cordone streptococco seguendo la forza della loro separazione.

Una volta che una molecola di RNA è legata tra le perle dalle sue cinque e tre estremità prime, può essere ripetutamente allungata e rilassata. L'elasticità delle maniglie a doppio trefolo è indicata da curve di estensione della forza non lineari. Il ripiegamento e lo spiegamento cooperativo della struttura dell'RNA tra le maniglie si riflettono in bruschi strappi e chiusure nella curva di estensione della forza con pendenze negative, il ripiegamento della forcina è indicato da una cerniera sulla curva di estensione della forza.

È importante sottolineare che la stessa molecola può essere dispiegata e ripiegata con forze diverse ogni volta. Tale tendenza è evidente nella distribuzione delle forze di transizione. Un meccanismo di feedback può essere utilizzato per mantenere una forza costante sull'RN. Un ripiegamento a forcina di una forcina a RNA è indicato da un accorciamento dell'estensione, mentre l'unfolding è riflesso da un aumento dell'estensione in modalità passiva, le posizioni della trappola e della micropipetta sono entrambe fisse.

Quando un RNA si ripiega in una forcina e accorcia la sua estensione, la perlina intrappolata si allontana dal centro della trappola aumentando la forza. Quando l'RNA viene esteso a un singolo filamento, la perlina si sposta verso il centro della trappola diminuendo la forza. Utilizzando questa tecnica, le vie di ripiegamento dell'RNA possono essere osservate e manipolate.

Con pico Newton e la risoluzione nanometrica, è possibile accumulare i tempi di vita degli stati e le forze di transizione delle singole molecole per derivare le costanti di velocità e le energie libere del ripiegamento dell'RNA. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere pazienti durante il phishing di una singola molecola. La possibilità di trovare un legame a singola molecola tra due perline è molto bassa.

Pertanto, molte paia di perline potrebbero non aderire affatto.