Name: Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Impara la nanomanipolazione di singole molecole di RNA con pinzette ottiche per studiare il ripiegamento strutturale. Questo metodo biofisico permette di analizzare le dinamiche conformazionali con risoluzione nanometrica.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione NSF (MCB-1054449) e da un premio collaborativo interdisciplinare per il programma di ricerca pilota dall'Istituto RNA dell'Università di Albany a PTXL.

1 Preparazione di RNA Molecole per singola molecola Togliersi <ol><li> Clonazione la sequenza di interesse. Clonare la sequenza di DNA corrispondente alla struttura di RNA in un vettore. </li><li> Sintesi e purificazione del template trascrizione. Sintetizzare un modello di trascrizione mediante PCR. [Tabella 1 posto qui] Avanti, purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR, e concentrare il campione&gt; 200 ng / ml. Poiché il DNA purificato viene utilizzato per la trascrizione, RNasi acqua libera deve essere utilizzato nelle fasi di eluizione e concentrazione. </li><li> Nella trascrizione in vitro. Sintetizzare RNA da trascrizione in vitro a 37 ° C per una notte per massimizzare la resa di RNA. [Tabella 2 posto qui] Dopo la trascrizione, aggiungere 1 ml DNasi I per digerire il DNA stampo per 15 minuti a 37 ° C. Purificare l&#39;RNA utilizzando una colonna di spin di silice. </li><li> Sintesi del biotinilato maniglia A. In primo luogo, produce la maniglia non modificato A mediante PCR utilizzando primers Af e Ar e concEntrate il DNA amplificato a&gt; 200 ng / ml. Successivamente, incorporare modifiche biotina nel prodotto di PCR utilizzando una reazione di primer extension. [Luogo tabella 3 qui] NOTA: La maniglia biotinilato A (biotina-HA) può essere utilizzato direttamente nel ricottura, senza purificazione. Come la biotina-HA deve essere ricotto con l&#39;RNA, è fondamentale utilizzare RNasi acqua libera in entrambe le fasi. </li><li> Sintesi della maniglia digossigenina modificato B. Synthesize digossigenina modificato maniglia B (dig-HB) mediante PCR utilizzando fondo Bf e oligo-digossigenina modificato Dig-Br (Figura 3). Avanti, purificare il prodotto di PCR e concentrare il campione&gt; 200 ng / ml. </li><li> Ricottura RNA alle maniglie. Anneal l&#39;RNA con maniglie. [luogo tabelle 4 e 5 qui] </li><li> Purificare campione ricotto. Aggiungere 3 volumi di etanolo del campione ricotta e mescolare bene. Conservare la miscela a -70 ° C per almeno 1 ora. Spin down a 15.800 xg e scartare il surnatante. Asciugare il pellet con un liofilizzatore. Sciogliere il pellet in100 microlitri RNasi acqua libera. NOTA: Il campione è pronto per essere utilizzato e può essere conservato a -20 ° C. </li></ol> 2 Taratura e funzionamento delle pinzette ottiche <ol><li> Calibrare Pixel Dimensioni di Video Monitor <ol><li> Utilizzare la trappola ottica per intrappolare un cordone con diametro noto (dimensioni standard). </li><li> Cattura immagini di un cordone intrappolato utilizzando software di imaging (Figura 4). </li><li> Determinare il diametro della perlina utilizzando il software di imaging basata sul metodo centroide. </li><li> Ripetere questa procedura per determinare diametri di perle di varie dimensioni. </li><li> Montare i diametri misurati e conosciute di perle da una regressione lineare per ottenere la dimensione fisica di un pixel. </li></ol></li><li> Verifica Distanza di calibrazione <ol><li> Utilizzare la trappola ottica per intrappolare una perlina. </li><li> Determinare la posizione dei pixel del suo baricentro dal software di acquisizione delle immagini e registrare la propria posizione utilizzando i Minitweezers. </li><li> Steer il tallone di diffe<html> affittare posizioni e ripetere la determinazione della posizione. </li><li> Convertire le posizioni X e Y del tallone da pixel a m unità utilizzando la dimensione dei pixel calibrata. </li><li> Confrontare il X e Y tra le posizioni misurate dal video e dai Minitweezers. I due insiemi di valori dovrebbero concordare. Poiché la risoluzione dell&#39;immagine è&gt; 0,1 micron, spostare il tallone sopra 1 micron tra le misure per garantire l&#39;accuratezza. Se la calibrazione distanza non è paragonabile a quella memorizzata nei Minitweezers, ricalibrare lo strumento. </li></ol></li><li> Trappola Rigidità Calibrazione <ol><li> Catturare una perlina utilizzando la trappola ottica e tenerlo ancora. </li><li> Registrare la forza della trappola con un bypass di acquisizione veloce di dati a una velocità&gt; 5 kHz per 3 sec. </li><li> Genera uno spettro di potenza dalla registrazione del movimento tallone utilizzando il software. Montare lo spettro di potenza di un Lorentziana (Figura 5) 38: 542 / 51542eq1.jpg &quot;width =&quot; 200 &quot;/&gt; (Eq. 1) in cui S (f) è la potenza alla frequenza di f, f c è la frequenza di taglio, e S 0 è la potenza asintotica. La frequenza di taglio f c è la frequenza in cui la potenza del moto termico è sceso a metà del valore asintotico. Come f c varia con la potenza del laser e le dimensioni tallone, calibrare ogni perla intrappolati individualmente. </li><li> Calcola la costante elastica della trappola, κ, da f c: <img alt="Equazione 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> (Eq. 2) in cui γ è il coefficiente di resistenza del tallone (Eq. 3). Utilizzare la costante della molla per determinare le variazioni di estensione di un RNA dal cambiamento vigore. </li></ol></li><li> Stokes &#39;Legge di prova <ol><li> Catturare una perlina utilizzando la trappola ottica. Spostare il tallone posteriore-e-forza a velocità diversa. </li><li> Registrare il movimento del tallone e la forza con i Minitweezers. </li><li> Calcola il raggio del tallone. NOTA: La forza di attrito, F d, generato dal moto di una particella sferica in un fluido può essere descritto dalla legge di Stokes &#39;: <img alt="Equazione 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> (Eq. 3) in cui r è il raggio della sfera, v è la velocità, e h è la viscosità dinamica del fluido, che si trova in tabelle di riferimento. Utilizzando la forza misurata come F d, il raggio del cordone può essere calcolato utilizzando l&#39;Eq. 3 (Figura 6) e deve concordare con quello determinato dal software di acquisizione immagini. Il test di legge di Stokes &#39;test efficace le tarature e le prestazioni dello strumento. </li></ol></li></ol> 3. nanomanipolazione di Single RNA Molecole <ol><li> Fare fluidica. <ol><li> Praticare sei fori (mm diametro 2 ciascuno) su un vetro di copertura n ° 2 (Figura 7a) e tagliare tre fessure (larghezza 2 mm) nel lato doppio nastro poliimmide (Figura 7b) utilizzando un incisore laser. </li><li> Fare una camera di flusso da sandwich di due vetro di copertura con due strati di nastro biadesivo Kapton. Inserire una micropipetta e due tubi bypass tra il nastro (Figura 7c). </li><li> Montare la camera di flusso su un telaio metallico, facendo corrispondere i fori fluidici (Figura 7d). </li><li> Collegare i canali fluidici della camera a 10 ml siringhe riempite con tampone di scelta tramite tubi di polietilene (Figura 7e). </li><li> Montare l&#39;intera camera sulle pinzette ottiche tra i due obiettivi. Assicurarsi che il lato anteriore della camera con i canali fluidici rivolto verso destra. Ritrarre l&#39;obiettivo a destra e inserire i perni di ottone del telaio (Figura 7e) per fori di montaggio sulla tegli pinzette. Serrare le viti per fissare la posizione della camera. </li></ol></li><li> Mescolando il campione e perline ricotto. Mescolare il campione ricotto con perle anti-digossigenina-rivestite (DIG-sfere), e lasciare che la miscela di rimanere a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Tipicamente, 1 ml di campione ricotto è mescolato con 5 microlitri dig-perle in 1 ml di tampone. NOTA: La quantità di perline da caricare nella camera di flusso deve essere scelto al fine di garantire una ragionevole quantità di perline da consegnare dal tubo bypass. Il rapporto del campione ricotto per le perline non è facilmente quantificabile. In un caso ideale, la maggior parte dei branelli hanno RNA tale che solo una piccola frazione di perline può avere solo una molecola di RNA a tallone. Mentre i campioni ricotti e la sospensione di sferette sono difficili da quantificare, il migliore e unico modo attualmente è di variare il rapporto di miscelazione e testare il composto sulle pinzette. </li><li> Invia perline al sito di reazione nella camera di flusso (cioè, alcuni micrometri in cima al mipunta cropipette, Figura 7c). <ol><li> Caricare una sospensione di perline rivestite di streptavidina (strep-sfere) in una siringa da 1 ml. </li><li> Collegare la siringa al tubo fluidico che conduce al canale inferiore della camera di flusso (figura 7a). </li><li> Spingere la siringa a scorrere le strep-perle nella camera. </li><li> Spostare l&#39;intera camera utilizzando il software di controllo del motore per posizionare la trappola ottica vicino all&#39;apertura del tubo bypass inferiore (figura 7b). Quindi azionare la trappola ottica da una trackball per catturare una strep-tallone. </li><li> Spostare il tallone vicino alla punta della micropipetta utilizzando il software di controllo del motore. </li><li> Estrarre la siringa collegata alla micropipetta a succhiare il tallone sul micropipetta. </li><li> Applicare flusso premendo delicatamente la siringa per il canale centrale per scovare strep-perline extra. </li><li> Allo stesso modo, consegnare la miscela del campione e dello scavo-perline (vedi punto 3.2) al canale superiore della camera. </li><li> Cattura uno scavo-tallone e portarlo vicino alla strep-tallone utilizzando la trappola ottica. </li><li> Pulire il canale centrale mediante l&#39;applicazione di flusso. NOTA: Il strep- e Dig-perle sono scelti per essere diverse dimensioni in modo che possano essere distinti visivamente sotto la vista microscopico (Figura 4). </li></ol></li><li> Pesca &quot;una singola molecola di legare tra una coppia di perline. <ol><li> Posizionare il dig-tallone in verticale sulla parte superiore del strep-tallone (Figura 4). </li><li> Spostare il dig-tallone verso il strep-tallone dal governare la trappola. Aprire una finestra del grafico forza-distanza sul computer per visualizzare i cambiamenti di forza. </li><li> In caso di contatto delle due perle, spostare il dig-tallone verticalmente dalla strep-tallone. </li><li> Se non viene fatto alcun contatto specifico, la forza rimane quasi zero. Se i due talloni sono collegati da molecole, la forza aumenta notevolmente quando i due talloni separati. Questa procedura, comunemente indicato come &quot;pesca&quot;, è spesso perfORMED più volte su ogni coppia di perline per trovare un efficace cavezza singola molecola. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Modifica e risoluzione dei problemi in preparazione di campioni tweezing Scelta di clonazione vettoriale. Sebbene lo schema generale qui descritto (Figura 3) non richiede una speciale clonazione vettore, il vettore è preferito non avere T7 intrinseca o promotore T3 per la facilità di trascrizione tale che un promotore può essere introdotto tramite PCR in posizioni desiderate. Sequenza e Lunghezze delle maniglie...

Lo sviluppo della tecnica pinzette ottiche è stata a lungo accompagnato con la sua applicazione nella ricerca biologica. Quando l&#39;effetto intrappolamento ottico è stato scoperto, Arthur Ashkin osservato che i batteri in acqua contaminata potrebbero essere intrappolati nel fuoco del laser 1. Da allora, i batteri trapping è diventato un involontario, divertente esperimento per generazioni di studenti biofisica, nonché come strumento di ricerca seria per studiare la fisiologia microbica 2,3. La tecnica di intrappolamento ottico utilizza focalizzato fascio laser per immobilizzare un oggetto microscopico 1. In pratica, una funzione di limitatore laser come una molla ottico, che misura anche la forza (F) sull&#39;oggetto intrappolato dal suo spostamento dal centro della trappola (AX). Entro un breve intervallo, F = κ x AX, in κ è la costante della molla della trappola. La trappola ottica può essere utilizzato per esercitare una forza in piconewton (PN) di precisione ad un microsoggetto Copic e misurare la sua posizione con nanometri (nm) di precisione. Negli ultimi due decenni, pinzette ottiche sono diventati una delle più utilizzate tecniche di singola molecola in biofisica. La tecnica è stata impiegata per studiare piegatura e la meccanica di 4-6 DNA, RNA 7-9, e le proteine ​​10,11. Pinzette ottiche sono stati utilizzati anche per osservare la replicazione del DNA 12, trascrizione dell&#39;RNA 13, e la sintesi proteica 14,15, così come molti altri eventi biomolecolari 16-18. Approcci singola molecola sono impiegati in RNA ricerca strutturale principalmente per esplorare il paesaggio aspro energia folding di RNA. Una sequenza di RNA di solito può piegare in più stabili, strutture si escludono a vicenda, a causa delle semplici di composizione chimica e di sbucciatura base di regole di RNA. E &#39;noto da tempo che l&#39;RNA polimorfismo strutturale, come ad esempio che si verifica in riboswitches 19,20, gioca un ruolo importante nella regolazione genica. A Recent sondaggio a livello di genoma ha rivelato che le variazioni di temperatura di soli pochi gradi influenzano notevolmente la struttura e la sintesi proteica di una grande porzione del trascrittoma cellulare 21. Questo esempio suggerisce che il ruolo biologico di RNA folding alternativa è forse più importante e pervasivo di quanto precedentemente ipotizzato. Polimorfismo strutturale, tuttavia, rappresenta una sfida per i tradizionali approcci biochimici e biofisici, che esaminano le proprietà medie di molte molecole. Ad esempio, la &quot;a&quot; e conformazioni &quot;off&quot; di un riboswitch si escludono a vicenda. Una struttura media derivato da strutture eterogenee non è in grado di assomigliare uno dei conformeri biologicamente rilevanti. Inoltre, RNA non tradotta e mRNA di solito formano strutture. La loro interazione con proteine ​​e RNA regolatori comunemente richiede svolgersi della struttura esistente come parte dell&#39;interazione. Pertanto, lo studio di RNA dispiegamento / ripiegamento diventa un pertinentequestione di RNA biologia. Per rispondere a tale sfida, l&#39;approccio di singola molecola è stato impiegato per svelare RNA polimorfismo strutturale studiando una molecola alla volta 22-27. Rispetto al popolare metodo di fluorescenza singola molecola, pinzette a base meccanica dispiegarsi offre un vantaggio che conformazioni delle singole molecole possono essere manipolati con la forza applicata e essere misurate con precisione nanometrica. Questa capacità nanomanipolazione può essere utilizzato per monitorare il dispiegamento / ripiegamento dei singoli domini strutturali tali che la piegatura gerarchica di un grande RNA può essere sezionato 28. In alternativa, un singolo filo può essere diretto a piegare in uno dei diversi conformeri; o una struttura esistente può essere indotta meccanicamente per ripiegare in una diversa conformazione 29. In condizioni biologiche, una struttura di RNA può essere modificato in caso di cambio di temperatura o ligando. La capacità di manipolare direttamente s molecolariTRUTTURA apre una nuova sede di RNA studio strutturale. In linea di principio, altre tecniche meccaniche come microscopio a forza atomica e pinzette magnetiche, possono anche essere utilizzati per studiare piegatura di singole molecole di RNA. Tuttavia, tali applicazioni sono limitate soprattutto a causa della risoluzione spaziale relativamente bassa 30. L&#39;impiego di pinzette ottiche permette strutture di RNA di essere spiegati con la forza meccanica. Il vantaggio di meccanica svolgimento è diverse volte. La forza può essere usata per spiegare sia le strutture secondarie e terziarie, mentre gli ioni metallici e ligando indotta piegatura sono limitati principalmente a strutture terziarie. Temperatura e denaturante possono influenzare in modo significativo le attività di acqua e soluti. Al contrario, la forza viene applicata localmente per perturbare strutture molecolari; l&#39;effetto della forza sull&#39;ambiente circostante è trascurabile. Inoltre, la fusione termica è meglio utilizzato per studiare la termodinamica pieghevoli di piccole strutture di RNA,considerando pinzette ottiche sono stati utilizzati per studiare le strutture di RNA con diverse dimensioni, che vanno da un sette-base-pair tetraloop tornante 28 per un ribozyme 400-nucleotide 31. Inoltre, le strutture di RNA possono essere spiegati meccanicamente a temperature mesofili. In contrasto, di dispiegarsi RNA in un esperimento di fusione termica, la temperatura è in genere ben sollevato sopra temperature fisiologiche, che aumenta significativamente l&#39;RNA all&#39;idrolisi, soprattutto in presenza di ioni Mg 2 +. È importante notare che l&#39;effetto meccanico della forza dipende da come viene applicato ad una struttura. La forza applicata inclina il pieghevole panorama energetico. Ad esempio, quando la forza è applicata ad una forcina, le coppie di basi sono rotti in sequenza, uno alla volta (Figura 1a). La forcella strappo avanza lungo l&#39;asse elicoidale, che è perpendicolare alla forza applicata. Al contrario, quando un complesso baciare minima è sotto tensione, i due baciandocoppie di basi, che sono parallele alla forza applicata, condividono il carico di forza (Figura 1b). Le diverse geometrie del tornante e baciare relativo complesso al risultato forza applicata nella loro risposta meccanica differente, che può essere utilizzata per distinguere secondaria e terziaria piegatura 28,32. L&#39;aspetto teorico della meccanica svolgimento è stato già recensito 8,9,30. Questo lavoro descrive gli approcci di base per impostare ed eseguire una singola molecola meccanico test dispiegarsi. Setup sperimentale. Nel nostro esperimento trazione meccanica, il campione di RNA per tweezing è costituito da RNA di interesse affiancato da due manici a doppio filamento di DNA / RNA (Figura 2) 7. L&#39;intera molecola può essere legato a due perle di micron-size superficie rivestita (Spherotech) tramite streptavidina-biotina e interazioni anticorpi anti-digossigenina-digoxigenin rispettivamente. Una perla è detenuto da un tr ottica forza di misuraap, mentre l&#39;altra si tiene sulla punta di una micropipetta. La distanza relativa tra le perline può essere cambiato da uno sterzo trappola o spostando la micropipetta. Usando questo approccio, una singola molecola di RNA legare le perline può essere allungato e rilassato. Preparazione dei campioni. La sintesi di campioni di RNA per tweezing comprende a pochi passi (Figura 3). Innanzitutto, la sequenza di DNA corrispondente alla RNA di interesse viene dapprima clonato in un vettore plasmidico. Avanti, tre reazioni di PCR vengono eseguite per generare le due maniglie e un modello per la trascrizione. Il modello trascrizione comprende le regioni della leva e le sequenze inserite. La lunghezza totale RNA è sintetizzato in vitro trascrizione. Infine, l&#39;RNA e le maniglie modificati chimicamente sono sottoposti a ricottura insieme per generare le molecole per tweezing. Taratura e funzionamento delle pinzette. Il disegno di base dell&#39;uso Minitweezersd in questo lavoro segue quello dei dual-beam pinzette ottiche 33. Con molti miglioramenti, i Minitweezers visualizzare straordinaria stabilità rispetto alle pinzette ottiche di prima generazione. Un certo numero di gruppi di ricerca in diversi paesi utilizzano le Minitweezers nella loro ricerca singola molecola 14,15,34-37. I dettagli di costruzione, taratura e il funzionamento del dispositivo, inclusi video di istruzioni, sono disponibili sul sito &quot;Pinzetta Lab&quot; (http://tweezerslab.unipr.it). Qui, miglioramenti e procedure di calibrazione che devono essere eseguite su basi giornaliere sono descritte in dettaglio.

<table><tbody><tr><td>Minitweezers</td><td>Steven B. Smith Engineering</td><td></td><td><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td></tr><tr><td>Scheda di acquisizione dati</td><td>National Instruments</td><td>USB-6351</td><td></td></tr><tr><td>Scheda video</td><td>National Instruments</td><td>PCI-1407</td><td></td></tr><tr><td>Software di programmazione Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI Vision Builder</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incisore laser</td><td>Sistemi laser Epilogue</td> Kit di purificazione PCR <td>Zing-16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kit Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Life</td><td>Technologies</td><td>Kit AM1334</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-11-UTP</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>FERR0081</tr><tr><td>T4 DNA polimerasi</td><td>New England Labs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>Microsfera rivestita di streptavidina</td><td>Spherotech</td><td>SVP-20-5</td><td></td></tr><tr><td>Microsfera rivestita di antidigossigenina</td><td>Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>Dimensioni microsfere standard</td><td>Nastro Kapton Spherotech</td><td>PPS-6K</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kaptontape.com</td><td>KPPTDE-1</td><td></td></tr><tr><td>N. 2 vetri di copertura</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543D</td><td></td></tr></tbody></table>

nanomanipolazione di single rna molecole da pinzette ottiche

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Una gran parte del genoma umano viene trascritto ma non tradotto. In questo post genomica, funzioni di regolamentazione di RNA hanno dimostrato di essere sempre più importante. Dato che la funzione RNA spesso dipende dalla sua capacità di adottare strutture alternative, è difficile prevedere RNA strutture tridimensionali direttamente dalla sequenza. Singola molecola approcci mostrano potenzialità per risolvere il problema di RNA polimorfismo strutturale monitorando strutture molecolari una molecola alla volta. Questo lavoro presenta un metodo per manipolare con precisione la piegatura e la struttura delle molecole di RNA singoli utilizzando pinzette ottiche. In primo luogo, i metodi per sintetizzare molecole adatte a singola molecola lavoro meccanico sono descritti. Avanti, diverse procedure di calibrazione per garantire le operazioni corrette delle pinzette ottiche sono discussi. Successivamente, vari esperimenti sono spiegati. Per dimostrare l&#39;utilità della tecnica, i risultati di dispiegamento meccanicamente forcine RNA e un singolo RNA kissing complesso sono utilizzati come prova. In questi esempi, la tecnica nanomanipolazione stato utilizzato per studiare piegatura di ciascun dominio strutturale, comprese secondaria e terziaria, in modo indipendente. Infine, le limitazioni e le future applicazioni del metodo sono discussi.

Limitato dallo spazio, nanomanipolazione di singole molecole di RNA è dimostrato mostrando solo esempi meccanici dispiegarsi di forcine RNA e di un RNA con struttura terziaria. Manipolare singolo Hairpin Molecole Una volta che una pastoia è stabilito tra le perle, l&#39;estensione di e vigore alla cavezza possono essere manipolati tramite un protocollo definito dall&#39;utente. Quattro protocolli comuni di manipolazione sono comunemente usati. </...

Le pinzette ottiche sono state utilizzate per studiare il ripiegamento dell'RNA allungando le singole molecole dalle loro estremità 5' e 3'. Qui vengono descritte le procedure comuni per sintetizzare molecole di RNA per la pinzetta, la calibrazione dello strumento e i metodi per manipolare singole molecole.

Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare un esperimento di svolgimento meccanico a singola molecola su una struttura di RNA. Nel primo passaggio, viene costruita una camera a flusso e montata sull'apparecchiatura. Nel secondo passaggio, delle microsfere di dimensioni micrometriche vengono mescolate con il campione di RNA di interesse, quindi le due diverse tipologie di microsfere vengono caricate nella camera a flusso.Infine, la camera a flusso e il trappolamento ottico possono essere utilizzati per guidare le microsfere in contatto l'una con l'altra al fine di valutare una varietà di interazioni a livello di singola molecola. In definitiva, questa tecnica di nanomanipolazione può essere impiegata per studiare il ripiegamento dell'RNA a livello di struttura secondaria e terziaria. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del ripiegamento dell'RNA, come ad esempio in che modo un RNA si ripiega e si svolge?Come transita tra diverse conformazioni in risposta a un cambiamento ambientale? E come interagisce con altre molecole? L'esperimento di oggi sarà eseguito dal mio studente laureando, il signor Williams Stevenson, per realizzare una camera a flusso iniziando a trapanare sei fori del diametro di due millimetri in un coperchio di vetro numero due.Quindi utilizzare un incisore laser per tagliare tre fessure larghe due millimetri in due pezzi di nastro di poliammide doppia faccia. Applicare uno dei pezzi di nastro sul vetrino, assicurandosi di allineare i fori nel nastro con i fori del vetrino. Applicare l'altro pezzo di nastro su un vetrino pulito e non forato.Rimuovere la protezione da entrambi i pezzi di nastro, quindi posizionare una micropipetta di vetro tirata e due biotubi tra ciascun canale su uno dei coprioggetti. Successivamente, unire i due coprioggetti, mantenendo la micropipetta e i tubi di bypass al loro posto con i due strati di nastro. Per creare una camera di flusso, montare la camera sul retro di un telaio metallico, allineando i fori della camera ai canali fluidici.Quindi capovolgere il telaio e collegare i canali a siringhe da 10 millilitri riempite con un tampone a scelta mediante tubi di polietilene. A questo punto montare l'intera camera sugli optical tweezers tra i due obiettivi, assicurandosi che il lato anteriore della camera con i canali fluidici sia rivolto verso destra. Successivamente ritrarre l'obiettivo sinistro e inserire i perni in ottone del telaio nei fori di montaggio degli optical tweezers, quindi serrare le viti per fissare la camera in posizione.Utilizzare un cordino elastico per sollevare lo strumento dal tavolo. Racchiudere lo strumento in una scatola acustica prima di consegnare le perle al sito di reazione della camera a flusso. Per prima cosa, mescolare un campione di RNA a ginocchio con perle rivestite con anti-D, ENC ossigeno dig o perle dig, quindi incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti.Durante l'incubazione, aspirare la sospensione di perle priva di rivestimento e perle rivestite in una siringa da un millilitro e collegare la siringa al tubo fluidico che conduce al canale inferiore della camera a flusso. Spingere lo stantuffo della siringa per caricare le perle streptavidina nella camera, quindi utilizzare il software di controllo del motore per posizionare il trappola ottica vicino all'apertura del tubo di by-pass inferiore e spostare l'intera camera. Successivamente, manovrare la trackball per azionare la trappola ottica e catturare una perla streptavidina.Utilizzare il software di controllo del motore per avvicinare la microsfera alla punta della micropipetta. Successivamente, aspirare con la siringa collegata alla micropipetta per attirare la microsfera sulla micropipetta, quindi spingere delicatamente lo stantuffo della siringa per applicare un flusso al canale centrale e rimuovere eventuali microsfere streptavidina rimanenti. Introdurre la miscela campione di microsfere marcate con digossigenina nel canale superiore della camera e catturare una microsfera con digossigenina come appena dimostrato.Quindi utilizzare la trappola ottica per avvicinare la perla dig alla perla strep. Applicare un flusso per pulire il canale centrale. Quindi pescare una singola molecola ancorata tra la coppia di perle.Posizionare il microsfera catturata con dig verticalmente sopra la microsfera con strep. Successivamente, spostare la trappola per muovere la microsfera con dig verso il basso, in direzione della microsfera con strep, e aprire una finestra del grafico forza-distanza sul monitor per visualizzare le variazioni di forza. Infine, al contatto, allontanare verticalmente la microsfera con dig dalla microsfera con strep, registrando la forza del loro distacco.Una volta che una molecola di RNA è ancorata tra le perle tramite le sue estremità 5' e 3', può essere allungata e rilassata ripetutamente. L'elasticità dei tratti a doppio filamento è indicata da curve forza-allungamento non lineari. Il ripiegamento e l'apertura cooperativi della struttura dell'RNA compresa tra i tratti sono riflessi da strappi e richiusure bruschi nella curva forza-allungamento con pendenze negative; il ripiegamento dell'elica in bolla è indicato da una richiusura sulla curva forza-allungamento.È importante notare che la stessa molecola può essere svolta e ripiegata a forze diverse ogni volta. Una tale tendenza è evidente nelle distribuzioni delle forze di transizione. Un meccanismo di retroazione può essere utilizzato per mantenere costante la forza sull'RN.A. Il ripiegamento di un'elica in RNA è indicato da una riduzione dell'estensione, mentre lo svolgimento si manifesta con un aumento dell'estensione; nella modalità passiva, le posizioni della trappola ottica e della micropipetta sono entrambe fisse.Quando un RNA si ripiega in una forcina e accorcia la sua estensione, la perla intrappolata si sposta dal centro della trappia, aumentando la forza. Quando l'RNA viene esteso in un filamento singolo, la perla si muove verso il centro della trappia, riducendo la forza. Utilizzando questa tecnica, è possibile osservare e manipolare i percorsi di ripiegamento dell'RNA.Con una risoluzione nell'ordine dei piconewton e dei nanometri, è possibile accumulare dati sulle durate degli stati e sulle forze di transizione di singole molecole per ricavare le costanti di velocità e le energie libere del ripiegamento dell'RNA. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere pazienti durante il recupero di una singola molecola. La probabilità di trovare un legame tra due perle costituito da una singola molecola è molto bassa.Pertanto, molte coppie di perline potrebbero non aderire affatto tra loro.

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JoVE Journal

Bioengineering

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Una piattaforma di singola molecola magnetico pinzette per manipolare G-quadruplex è segnalata, che permette per lo studio della stabilità di G4 e regolamento di varie proteine.

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro sperimentale completo per lo studio delle interazioni RNA-proteina utilizzando pinzette ottiche. Sono delineate diverse possibili configurazioni sperimentali, tra cui la combinazione di pinzette ottiche con microscopia confocale.

Pinzette ottiche per studiare le interazioni RNA-proteina nella regolazione della traduzione

La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.

Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Qui, descriviamo una configurazione di pinzette magnetiche ad alta velocità che esegue misurazioni nanomeccaniche su biomolecole sensibili alla forza alla velocità massima di 1,2 kHz. Presentiamo la sua applicazione a forcine di DNA e complessi SNARE come sistemi modello, ma sarà applicabile anche ad altre molecole coinvolte in eventi meccanobiologici.

Pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza

Questo protocollo dimostra l'utilizzo di pinzette magnetiche a singola molecola per studiare le interazioni tra le proteine telomeriche leganti il DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e i lunghi telomeri estratti da cellule umane. Descrive le fasi preparatorie per i telomeri e i fattori di legame ripetuto telomerico, l'esecuzione di esperimenti su singole molecole e i metodi di raccolta e analisi dei dati.

Analisi delle interazioni proteina-DNA telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola

Microscopia ottica con risoluzione fotoacustico (OR-PAM) è una tecnologia emergente in grado di assorbimento di imaging ottico...

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Illustriamo l'uso di una forza costante pinzette ottiche assiali per esplorare le proprietà meccaniche delle molecole di DNA brevi. Con stiramento DNA assialmente, riduciamo al minimo gli ostacoli sterici e manufatti derivanti convenzionale manipolazione laterale, che ci permette di studiare molecole di DNA più corto ~ 100 nm.

Stretching brevi sequenze di DNA con pinzette costante forza assiale ottici

Procedure semplici e riproducibili sono descritte per la realizzazione di tre assemblee collagene strutturalmente distinti da un tipo comune, disponibile in commercio ho monomero collagene. Tipo nativo, fibroso spaziatura lungo o segmentale collagene spaziatura lungo può essere costruito variando le condizioni a cui i 300 nm di lunghezza e diametro di 1.4 nm blocco monomero edificio è esposto.

In sintesi in vitro di Native, Spaziatura fibrosa lungo e segmentale collagene spaziatura lungo

Impara la nanomanipolazione di singole molecole di RNA con pinzette ottiche per studiare il ripiegamento strutturale. Questo metodo biofisico permette di analizzare le dinamiche conformazionali con risoluzione nanometrica.

Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

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