Metodo per ottenere primarie cellule tumorali ovariche da campioni solidi

Sommario

Questo studio descrive un metodo dettagliato per l'isolamento e la caratterizzazione di cellule tumorali ovariche primarie da campioni clinici solidi. Cancro ovarico campioni clinici sono sottoposti a digestione enzimatica per ottenere praticabile, privo di fibroblasti cancro ovarico epiteliale (EOC), le cellule particolarmente adatto per applicazioni a valle.

Abstract

Sono urgentemente necessari strumenti affidabili per indagare l'iniziazione e la progressione del cancro ovarico. Mentre l'uso di linee di cellule di cancro ovarico rimane uno strumento utile per comprendere il cancro ovarico, il loro uso ha molte limitazioni. Questi includono la mancanza di eterogeneità e la pletora di alterazioni genetiche associate con prolungato passaging in vitro. Qui si descrive un metodo che consente di fissare rapidamente cellule tumorali ovariche primarie formare campioni clinici solidi raccolti al momento dell'intervento. Il metodo consiste nel sottoporre campioni clinici per digestione enzimatica per 30 min. La sospensione cellulare isolato è permesso di crescere e può essere usato per applicazioni a valle compreso screening di farmaci. Il vantaggio di linee primarie di cellule di cancro ovarico su linee di cellule di cancro ovarico stabilito è che sono rappresentativi dei campioni clinici specifiche originali sono stati derivati ​​da e possono essere derivati ​​da diversi siti se primacarcinoma ovarico ry o metastatico.

Introduzione

Nonostante la sua relativamente bassa incidenza, il cancro ovarico è il più letale delle malattie ginecologiche e la quinta causa di decessi per cancro tra le donne ^1,2. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di strumenti affidabili e modelli che ricapitolano fedelmente l'inizio e la progressione della malattia ^3. La maggior parte delle nostre conoscenze oggi sul cancro ovarico è stato possibile attraverso l'uso di cellule immortalizzate ovarici epiteliali di superficie (IOSEs), linee di cellule di cancro ovarico e le cellule tumorali ovariche primarie recuperati dal liquido ascitico ^4-7. Purtroppo, il loro utilizzo ha diverse limitazioni, tra cui una serie di modifiche genetiche e fenotipiche associate a processi immortalization o nei passaggi in vitro e l'eterogeneità della popolazione risultante dalla preparazione del liquido ascitico.

Pertanto, le cellule tumorali ovariche primarie derivate da campioni solidi identificabili e specifici del cancro ovarico rappresentano un unique strumento per studiare la progressione del cancro ovarico.

Le principali difficoltà che comporta l'ottenimento queste cellule maligne sono dovute ad una crescita eccessiva di cellule stromali o fibroblasti con perdita di vitalità e prematura mancanza di capacità proliferativa nella cultura di queste cellule EdC. Attualmente esistono diversi metodi per creare sospensioni monocellulari da tumori solidi, con mezzi meccanici o dissociazione enzimatica, tuttavia alcune tecniche producono una quantità maggiore del risultato preferito ^8. Qui mostriamo che la digestione enzimatica con dispasi II si traduca in un effettivo recupero di, privo di fibroblasti cellule EdC vitali. Le culture EOC così ottenuti sono altamente suscettibili alla manipolazione genetica e sono utili anche nel test di screening di farmaci, indicando che queste culture EOC sono adatti per molte applicazioni a valle.

Protocollo

Dichiarazione Etica
Esemplari solide di cancro ovarico sono stati ottenuti dalla University of Minnesota Procurement Tissue Facility (TPF) dopo che il Comitato Institutional Review Board: Human Subject Board (IRB) di approvazione.

1. Setup reagente

1. Preparare Complete mezzo DMEM completandola DMEM con 10% FBS, e 100 unità di penicillina-streptomicina. Conservare il terreno a 4 ° C e riscaldare a 37 ° C prima dell'uso.
2. Aliquota dispasi II in volumi separati di 5-10 ml per evitare di congelare più scongela e conservare a -20 ° C in un congelatore no-nonfrost.

2. Tissue Collection

1. Raccogliere campioni solidi di cancro ovarico (~ 5 g di dimensione) al momento dell'intervento da aree macroscopicamente identificate come cancro da un patologo. Campioni clinici sono de-identificati e registrati secondo i protocolli istituzionali.
2. Mettere i campioni in una sterile, sccoperchio rew, polipropilene campioni contenitore riempito con 30 ml di PBS freddo. Trasportare i campioni dal laboratorio patologia chirurgica al laboratorio di ricerca per la trasformazione in ghiaccio, e in 30 min dalla raccolta del campione (Figura 1).

3. Tissue Processing

1. Lavorando in condizioni sterili, trasferire i campioni sul piatto Petri (60 mm x 60 mm) contenenti 10 ml di fresco, PBS freddo e con una lama di rasoio sterile, ulteriormente tagliato in piccoli pezzi possibili (2 mm o meno) ( Figure 2A e 2 B).
2. Trasferire i tessuti macinate in una provetta conica da 15 ml contenente 10 ml di preriscaldata (37 ° C per 30 min) dispasi II (2,4 U / ml) in DMEM e incubare a 5% di CO ₂ e 37 ° C per 30 min. Per assicurare una digestione ottimale dei campioni, agitare manualmente lo slurry cella ogni 5 min.
3. Dopo 30 minuti di incubazione, il trasferimento (usandoA 10 ml pipetta sierologica) slurry cella su un filtro cella (70 micron mesh) collocata sopra un tubo conico da 50 ml e applicare una leggera pressione contro la maglia utilizzando uno stantuffo della siringa. Scartare qualsiasi tessuto non dissociato (rimanente sulla parte superiore della maglia) e raccogliere la sospensione cellulare ottenuta nella provetta sterile da 50 ml. Centrifugare a 320 xg per 7 minuti a 4 ° C (Figura 3).
4. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di DMEM contenente 10% FBS.
5. Incubare la sospensione cellulare in una capsula di Petri in 5% CO ₂ e 37 ° C (Figura 4).
6. Cambia il mezzo dopo 24 ore dal fasciame iniziale. Questo consente la rimozione di detriti cellulari e la maggior parte degli eritrociti presenti in coltura.
7. Cambia il mezzo ogni tre giorni per le due settimane successive, dopo di che le culture di primaria EOC sono pronti per le applicazioni a valle.

Risultati

Campioni clinici freschi di cancro ovarico vengono raccolti dopo l'intervento (Figura 1) e tagliati in piccoli pezzi (figure 2a e 2b) costituenti il liquame cella. Questo permette l'esposizione ottimale dei campioni al trattamento enzimatico. Slurry cellula è esposta a digestione enzimatica ed incubato a 37 ° C per 30 min. Durante il tempo di incubazione slurry diventa sempre più torbida (soprattutto dopo ogni agitazione) e questo è un segno di disaggregazione tessuto. Al termine del pe...

Discussione

Una migliore comprensione della eziologia cancro ovarico e sviluppo è fondamentale per migliorare l'esito delle donne affette da questa malattia devastante. In questo contesto, l'uso di stabilito e "disponibili commercialmente" ovarico linea cellulare di cancro è stato indubbiamente estremamente utile. Tuttavia, oggi sappiamo che le linee cellulari del cancro non sono rappresentativi del tumore umano hanno avuto origine da molti aspetti, tra cui la mancanza di eterogeneità ^9,10.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1x PBS, sterile	Invitrogen	14190-144
Coperchio a vite, contenitore per campioni in polipropilene, sterile	Thermo Scientific	02 1090
DMEM medium, sterile	Invitrogen	11995-065
Siero fetale bovino, sterile	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x Penicillina-streptomicina, liquido	Invitrogen	15140-122
Dispase II, sterile	Roche	04942 078 001
Pinza a punta fine piccola e lama per bisturi, sterile	Fisher Scientific	Pincipe: 08-953E, lame: 08-927-5D
Forbici da dissezione piccole, sterili	Fisher Scientific	08-945
15 ml Provette con tappo conico,	BD Falcon	sterile 352097
50 ml Provette con tappo conico,	BD Falcon	sterile 352027
Pipetta sierologica da 10 ml, sterile.	Corning	13-678-11E
Stantuffo siringa da 6 ml, sterile	Tyco Healthcare	8881516911
Filtro in nylon (70 μ m ) colino cellulare, sterile	BD Falcon	352350
piastra di Petri da 5 cm, sterile	Corning	430166
Piastra Petri da 10 cm, sterile	Corning	430167