Name: Metodo per ottenere primarie cellule tumorali ovariche da campioni solidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Impara a isolare e caratterizzare cellule tumorali ovariche primarie da campioni solidi clinici. Questo metodo consente la coltura di cellule epiteliali per settimane, supportando applicazioni di ricerca oncologica e medicina personalizzata.

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Vorremmo ringraziare il personale del Fondo prelievo del tessuto della University of Minnesota di assistenza e raccolta campioni di tessuto del paziente. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa Programma Ovarian Cancer Research (OCRP) OC093424 a MB, con la Randy Shaver Cancer Research Fund e Comunità MB, dal Minnesota Ovarian Cancer Alliance a MB e dal fondo di Oncologia Ginecologica del Dipartimento di MB. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

Dichiarazione Etica Esemplari solide di cancro ovarico sono stati ottenuti dalla University of Minnesota Procurement Tissue Facility (TPF) dopo che il Comitato Institutional Review Board: Human Subject Board (IRB) di approvazione. 1. Setup reagente <ol><li> Preparare Complete mezzo DMEM completandola DMEM con 10% FBS, e 100 unità di penicillina-streptomicina. Conservare il terreno a 4 ° C e riscaldare a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Aliquota dispasi II in volumi separati di 5-10 ml per evitare di congelare più scongela e conservare a -20 ° C in un congelatore no-nonfrost. </li></ol> 2. Tissue Collection <ol><li> Raccogliere campioni solidi di cancro ovarico (~ 5 g di dimensione) al momento dell&#39;intervento da aree macroscopicamente identificate come cancro da un patologo. Campioni clinici sono de-identificati e registrati secondo i protocolli istituzionali. </li><li> Mettere i campioni in una sterile, sccoperchio rew, polipropilene campioni contenitore riempito con 30 ml di PBS freddo. Trasportare i campioni dal laboratorio patologia chirurgica al laboratorio di ricerca per la trasformazione in ghiaccio, e in 30 min dalla raccolta del campione (Figura 1). </li></ol> 3. Tissue Processing <ol><li> Lavorando in condizioni sterili, trasferire i campioni sul piatto Petri (60 mm x 60 mm) contenenti 10 ml di fresco, PBS freddo e con una lama di rasoio sterile, ulteriormente tagliato in piccoli pezzi possibili (2 mm o meno) ( Figure 2A e 2 B). </li><li> Trasferire i tessuti macinate in una provetta conica da 15 ml contenente 10 ml di preriscaldata (37 ° C per 30 min) dispasi II (2,4 U / ml) in DMEM e incubare a 5% di CO 2 e 37 ° C per 30 min. Per assicurare una digestione ottimale dei campioni, agitare manualmente lo slurry cella ogni 5 min. </li><li> Dopo 30 minuti di incubazione, il trasferimento (usandoA 10 ml pipetta sierologica) slurry cella su un filtro cella (70 micron mesh) collocata sopra un tubo conico da 50 ml e applicare una leggera pressione contro la maglia utilizzando uno stantuffo della siringa. Scartare qualsiasi tessuto non dissociato (rimanente sulla parte superiore della maglia) e raccogliere la sospensione cellulare ottenuta nella provetta sterile da 50 ml. Centrifugare a 320 xg per 7 minuti a 4 ° C (Figura 3). </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di DMEM contenente 10% FBS. </li><li> Incubare la sospensione cellulare in una capsula di Petri in 5% CO 2 e 37 ° C (Figura 4). </li><li> Cambia il mezzo dopo 24 ore dal fasciame iniziale. Questo consente la rimozione di detriti cellulari e la maggior parte degli eritrociti presenti in coltura. </li><li> Cambia il mezzo ogni tre giorni per le due settimane successive, dopo di che le culture di primaria EOC sono pronti per le applicazioni a valle. </li></ol>

<ol><li>Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+and+treatment+of+ovarian+cancer%3A+shifting+from+early+stage+to+minimal+volume+of+disease+based+on+a+new+model+of+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).</li>
<li>Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+Cancer+Is+an+Imported+Disease%3A+Fact+or+Fiction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Obstet.+Gynecol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction.</a> Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Sarojini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+biomarkers+for+ovarian%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Early detection biomarkers for ovarian.</a> J. Oncol. , (2012).</li>
<li>Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nachtigal+M.W.+Primary+culture+of+ovarian+surface+epithelial+cells+and+ascites-derived+ovarian+cancer+cells+from+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).</li>
<li>Tsao, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells+immortalized+by+human+papilloma+viral+oncogenes+%28HPV-E6E7+ORFs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs).</a> Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).</li>
<li>Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cultured+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+phenotypic+plasticity+and+premalignant+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes.</a> Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).</li>
<li>Brewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+normal%2C+immortalized+ovarian+surface+epithelial+and+ovarian+cancer+cells+for+chemoprevention+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).</li>
<li>Sueblinvong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization+and+downstream+application+of+primary+ovarian+cancer+cells+derived+from+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>Rockwell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-in+vitro+tumour+cell+lines%3A+characteristics+and+limitations+as+models+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer+Suppl%22%5BJournal%5D)">In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer.</a> Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).</li>
<li>Wong, C., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development%2C+application+and+limitations+of+breast+cancer+cell+lines+to+study+tamoxifen+and+aromatase+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid.+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance.</a> J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una migliore comprensione della eziologia cancro ovarico e sviluppo è fondamentale per migliorare l&#39;esito delle donne affette da questa malattia devastante. In questo contesto, l&#39;uso di stabilito e &quot;disponibili commercialmente&quot; ovarico linea cellulare di cancro è stato indubbiamente estremamente utile. Tuttavia, oggi sappiamo che le linee cellulari del cancro non sono rappresentativi del tumore umano hanno avuto origine da molti aspetti, tra cui la mancanza di eterogeneità 9,10. <p class...

Nonostante la sua relativamente bassa incidenza, il cancro ovarico è il più letale delle malattie ginecologiche e la quinta causa di decessi per cancro tra le donne 1,2. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di strumenti affidabili e modelli che ricapitolano fedelmente l&#39;inizio e la progressione della malattia 3. La maggior parte delle nostre conoscenze oggi sul cancro ovarico è stato possibile attraverso l&#39;uso di cellule immortalizzate ovarici epiteliali di superficie (IOSEs), linee di cellule di cancro ovarico e le cellule tumorali ovariche primarie recuperati dal liquido ascitico 4-7. Purtroppo, il loro utilizzo ha diverse limitazioni, tra cui una serie di modifiche genetiche e fenotipiche associate a processi immortalization o nei passaggi in vitro e l&#39;eterogeneità della popolazione risultante dalla preparazione del liquido ascitico. Pertanto, le cellule tumorali ovariche primarie derivate da campioni solidi identificabili e specifici del cancro ovarico rappresentano un unique strumento per studiare la progressione del cancro ovarico. Le principali difficoltà che comporta l&#39;ottenimento queste cellule maligne sono dovute ad una crescita eccessiva di cellule stromali o fibroblasti con perdita di vitalità e prematura mancanza di capacità proliferativa nella cultura di queste cellule EdC. Attualmente esistono diversi metodi per creare sospensioni monocellulari da tumori solidi, con mezzi meccanici o dissociazione enzimatica, tuttavia alcune tecniche producono una quantità maggiore del risultato preferito 8. Qui mostriamo che la digestione enzimatica con dispasi II si traduca in un effettivo recupero di, privo di fibroblasti cellule EdC vitali. Le culture EOC così ottenuti sono altamente suscettibili alla manipolazione genetica e sono utili anche nel test di screening di farmaci, indicando che queste culture EOC sono adatti per molte applicazioni a valle.

<table><tbody><tr><td>1x PBS, sterile&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio a vite, contenitore per campioni in polipropilene, sterile</td><td>Thermo Scientific</td><td>02 1090</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium, sterile&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, sterile</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicillina-streptomicina, liquido</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, sterile</td><td>Roche</td><td>04942 078 001</td><td></td></tr><tr><td>Pinza a punta fine piccola e lama per bisturi, sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>Pincipe: 08-953E, lame: 08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione piccole, sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-945</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Provette con tappo conico,</td><td>BD Falcon</td><td>sterile 352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Provette con tappo conico,</td><td>BD Falcon</td><td>sterile 352027</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 10 ml, sterile.</td><td>Corning</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Stantuffo siringa da 6 ml, sterile&nbsp;</td><td>Tyco Healthcare</td><td>8881516911</td><td></td></tr><tr><td>Filtro in nylon (70 &mu; m ) colino cellulare, sterile</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>piastra di Petri da 5 cm, sterile&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Petri da 10 cm, sterile&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr></tbody></table>

metodo per ottenere primarie cellule tumorali ovariche da campioni solidi

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Sono urgentemente necessari strumenti affidabili per indagare l&#39;iniziazione e la progressione del cancro ovarico. Mentre l&#39;uso di linee di cellule di cancro ovarico rimane uno strumento utile per comprendere il cancro ovarico, il loro uso ha molte limitazioni. Questi includono la mancanza di eterogeneità e la pletora di alterazioni genetiche associate con prolungato passaging in vitro. Qui si descrive un metodo che consente di fissare rapidamente cellule tumorali ovariche primarie formare campioni clinici solidi raccolti al momento dell&#39;intervento. Il metodo consiste nel sottoporre campioni clinici per digestione enzimatica per 30 min. La sospensione cellulare isolato è permesso di crescere e può essere usato per applicazioni a valle compreso screening di farmaci. Il vantaggio di linee primarie di cellule di cancro ovarico su linee di cellule di cancro ovarico stabilito è che sono rappresentativi dei campioni clinici specifiche originali sono stati derivati ​​da e possono essere derivati ​​da diversi siti se primacarcinoma ovarico ry o metastatico.

Campioni clinici freschi di cancro ovarico vengono raccolti dopo l&#39;intervento (Figura 1) e tagliati in piccoli pezzi (figure 2a e 2b) costituenti il liquame cella. Questo permette l&#39;esposizione ottimale dei campioni al trattamento enzimatico. Slurry cellula è esposta a digestione enzimatica ed incubato a 37 ° C per 30 min. Durante il tempo di incubazione slurry diventa sempre più torbida (soprattutto dopo ogni agitazione) e questo è un segno di disaggregazione tessuto. Al termin...

Questo studio descrive un metodo dettagliato per l&#39;isolamento e la caratterizzazione di cellule tumorali ovariche primarie da campioni clinici solidi. Cancro ovarico campioni clinici sono sottoposti a digestione enzimatica per ottenere praticabile, privo di fibroblasti cancro ovarico epiteliale (EOC), le cellule particolarmente adatto per applicazioni a valle.

Metodo per ottenere primarie cellule tumorali ovariche da campioni solidi

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e caratterizzare cellule tumorali ovariche primarie da campioni clinici solidi. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo il campione del tumore ovarico e posizionandolo in una piastra di Petri. Il secondo passaggio consiste nel tagliare il campione in frammenti e trasferire i frammenti in un tubo conico contenente reagenti per la digestione, da incubare.Successivamente, la sospensione cellulare viene fatta passare attraverso un filtro, dove vengono raccolte solo le cellule. Per la centrifugazione, l'ultimo passaggio consiste nell'eliminare il soprannatante e risospendere le cellule nel mezzo di coltura, lasciandole incubare per tutta la notte. Alla fine, le cellule di carcinoma ovarico epiteliale cresceranno in coltura per settimane, permettendo così applicazioni successive. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del carcinoma ovarico, ad esempio quale sia l'opzione terapeutica migliore per ogni singolo paziente.Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento del cancro ovarico poiché permettono di utilizzare colture cellulari più realistiche, altamente suscettibili alla man

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Descriviamo metodologie per la creazione...

Eterotipica tridimensionale<em&gt; In Vitro</emModellazione&gt; di stromale-epiteliali interazioni Durante iniziazione e la progressione del cancro ovarico

Questo protocollo descrive una tecnica per la preparazione del campione mediante la co-coltura di espianti ovarici con le cellule tumorali delle tube di Falloppio. Questi campioni vengono visualizzati utilizzando la spettroscopia di massa per immagini, o IMS, per rilevare lo scambio di piccole molecole tra le cellule e i tessuti che porta allo sviluppo del tumore.

Modellazione della comunicazione del cancro ovarico per l'analisi della spettrometria di massa per immagini: un metodo per identificare i comunicatori chimici di piccole molecole nello sviluppo di tumori ovarici metastatici

In questo video, descriviamo un metodo per isolare e caratterizzare le cellule di cancro ovarico primario da campioni di tessuto tumorale ovarico solido. Le cellule tumorali epiteliali ottenute utilizzando questo protocollo sono adatte per comprendere i processi che possono portare all'inizio e allo sviluppo del cancro ovarico.

Ottenere cellule di cancro ovarico primario da campioni solidi: un metodo per coltivare cellule di cancro ovarico epiteliale da campioni di tumore ovarico

Ovarico invasione delle cellule di cancro nel rivestimento mesoteliali del peritoneo è un processo dinamico nel tempo. Utilizzando un analizzatore in tempo reale, la capacità invasiva delle cellule tumorali ovariche in una cella modello di co-coltura sferoide-mesoteliali può essere quantificato in periodi di tempo prolungati, fornendo approfondimenti fattori che regolano il processo metastatico.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Le cellule tumorali (TIC) possono rappresentare un valido bersaglio terapeutico per il trattamento del cancro ovarico, una malattia altamente ricorrente e fatale. Presentiamo un protocollo per le condizioni di coltura che arricchiscono questa popolazione altamente tumorigenica di cellule.

In Arricchimento vitro di Ovarian Cancer Cells-tumorali avvio

Qui, presentiamo un protocollo per costruire un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale, composto da cellule mesoteliali umane primarie e fibroblasti stratificati con matrice extracellulare, come strumento per studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano

Per chiarire il processo a più fasi di diffusione peritoneale del carcinoma ovarico, questo studio presenta un modello sperimentale murino di sviluppo del tumore originale e metastasi peritoneali tramite inoculazione ortotopico con queste cellule tumorali.

Modello murino sperimentale di sviluppo del tumore originale e peritoneale Metastasi<em&gt; via</em&gt; Ortotopico inoculazione con cellule dell&#39;ovaio Carcinoma

Gli organoidi derivati dal paziente (PDO) sono una coltura tridimensionale (3D) che può imitare l'ambiente tumorale in vitro. Nel carcinoma ovarico sieroso di alto grado, le DOP rappresentano un modello per studiare nuovi biomarcatori e terapie.

Generazione e coltura di organoidi di alto grado derivati da pazienti con carcinoma ovarico sieroso

Presentiamo un protocollo che può essere utilizzato per condurre test terapeutici sui farmaci con organoidi di carcinoma ovarico derivati da pazienti.

Modelli di organoidi derivati da pazienti con carcinoma ovarico per test preclinici sui farmaci

Questo protocollo descrive la creazione di un modello tridimensionale (3D) ex vivo dell'interazione cellula tumorale-omento. Il modello fornisce una piattaforma per chiarire i meccanismi pro-tumorali all'interno della nicchia adiposa e per testare nuove terapie.

Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

Questo protocollo offre un quadro sistematico per la creazione di organoidi di carcinoma ovarico provenienti da diversi stadi di malattia e affronta le sfide della variabilità specifica del paziente per aumentare la resa e consentire una robusta espansione a lungo termine per le applicazioni successive. Include passaggi dettagliati per la lavorazione dei tessuti, la semina, la regolazione dei requisiti dei terreni e la colorazione in immunofluorescenza.

Strategia per la biobanca degli organoidi del carcinoma ovarico: affrontare l'eterogeneità interpaziente tra sottotipi istologici e stadi di malattia

Impara a isolare e caratterizzare cellule tumorali ovariche primarie da campioni solidi clinici. Questo metodo consente la coltura di cellule epiteliali per settimane, supportando applicazioni di ricerca oncologica e medicina personalizzata.

Metodo per ottenere primarie cellule tumorali ovariche da campioni solidi

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