Abstract
전자 스핀 공명 (EPR)가 산화 환원 적정 강력한 방법은 보조 인자 단백질의 중간 점 전위를 결정하고, 그 검출 산화 환원 상태에서 보조 자극 분자를 식별하고 정량화 모니터링한다.
기술은 전자 전달 속도에 대한 정보를 제공하지 않기 때문에, 접근하지만, 연구중인 단백질 공동 인자의 정체 및 산화 환원 상태를 확립 않는 직접 전기 화학 (볼타) 상보 적이다. 기술은 전자 상자성 공명 (EPR)을 포함하는 보조 인자 검출하는 단백질에 넓게 적용 할 수있는 것이다.
전형적인 적정 1-100 μM의 범위의 농도를 갖는 조효소 2 ㎖의 단백질을 필요로한다. 단백질은 일정한 전위로 샘플을 포이즈 위해 화학적 환원제 (온산 나트륨) 또는 산화제 (페리 시안화 칼륨)으로 적정한다. 백금선과 Ag / AgCl 기준 전극은 볼트에 연결되어m은 단백질 용액의 전위를 측정 하였다. 13 개의 다른 레 독스 매개체 세트는 단백질의 산화 환원 보조 인자와 전극 사이에 평형을 위해 사용된다. 샘플이 단백질이 다른 산화 환원 보조 인자에 대한 특성이 서로 다른 전위 전자 상자성 공명 스펙트럼에 그려, 측정된다. 시료 대 전위 신호 세기의 플롯은 보조 인자의 중간 점 전위를 측정하기 위해 네른스트 식을 이용하여 분석한다.
Introduction
그것은이 행성, 광합성, 질소 고정 호흡으로 생명에 가장 기본적인 화학 공정은 유기 및 무기 산화 환원 보조 인자를 포함하는 다양한 범위의 큰 단백질 복합체에 의해 촉매되는 타격이다. 이는 전체 단백질의 약 30 %가 하나 이상의 금속 보조 인자를 포함하는 것으로 추정되었다. 1,2- 식별 및 산화 환원 보조 인자 직접 전기 화학 (예, 단백질 막 볼타) 또는 산화 환원 적정을 사용하여 확립 될 수 특성화. 두 가지 기술은 자연과 적용의 상호 보완 적이다. 전압 전류는 전극 표면과 반응 할 수있는 중간 전위 보조 인자의 전자 이동 반응 속도의 빠른 결정을 제공한다. -3,4- 보통 이것은 사이토 크롬 C 또는 페레 독신과 같은 전자 전달 단백질에 대해 잘 작동한다. 그리고 그것은 때때로 전극 표면에 고정화 된 더 복잡한 단백질 작동합니다. 자세한 지식단백질의 보조 인자의 특성은 전압 전류가 보조 인자 (cofactor)의 신원에 대한 직접적인 정보를 제공하지 않으므로, 사용할 수 있습니다. 산화 환원 적정을 실행하는 것이 더 힘든하고 단백질 mg의 양을 필요로한다. 그러나, 이들은 중간 전위와 보조 인자의 신원에 관한 정보를 제공한다. 또한,도 5의 여러 단백질 공동 인자가 모니터링 될 수있는 단일의 적정.
산화 환원 적정의 원리는 산화 환원 활성 단백질 또는 효소 또는 화학적으로 산화 환원된다는 것이다. 위해 공동 인자가 사용되는 환원제 또는 산화제 산화 환원 매개체와 반응되었는지 확인합니다. 이러한 산화 환원 매개체는 또한 용액의 전위를 측정 할 수 있도록 전극과 반응. 산화 환원 매개체는 버퍼로서 작용하여 단백질 전극과 보조 인자 사이에 평형. 화학적 원하는 값 전위 poising 후, 샘플은 AW 액상 질소에서 빠르게 동결 흡인되고분광 기술을 추가 분석을 AIT. EPR 분광법은 정량적 상자성 금속 중심 또는 유기 라디칼을 측정하는데 사용될 수있다이 점에서 특히 유용하다.
산화 환원 적정은 두 방향으로 수행 할 수 있습니다 낮은에서 높은 또는 높은에서 낮은 중간 잠재력. 선택은 연구중인 보조 인자의 안정성에 따라 달라집니다. 종종 낮은 전위에서 시작하고 잠재력을 증가 단계적하는 산화제를 추가하는 것이 현명하다. 이것은 산화 적정 호출되고 여기에 설명된다. 여기서 우리는 사카로 미세스 세 레비 시아 Nar1로부터 단백질을 함유하는 철 - 황 클러스터의 산화 환원 적정을 나타낸다. 이 단백질은 세포질 철 - 황 클러스터 생합성 기계 (CIA 경로)에, 비계 단백질로, 가능성이 참여하고있다. 6,7
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Protocol
설치 및 솔루션 1. 준비
- 100 mM 트리스, pH가 8.5에서 250 mM의 NaCl을 10 % 글리세롤을 포함하는 완충 용액을 준비합니다. 아르곤으로 플러싱 버퍼의 배기. 혐기성 챔버로 버퍼를 소개합니다.
- 두 부분에서 버퍼를 나눈다. 한 부분 (버퍼)가 1 mM의 DL-디티을 추가하려면 1 밀리미터 L 시스테인 (DTT, M은 154.25 g / 몰 R). 다른 부분 (버퍼 B)는 환원제가 포함되어 있지 않습니다.
- 산화제 및 환원제 솔루션을 준비합니다. 1 ML의 2의 솔루션, 20, 200 mM의 페리 시안화 칼륨을 확인 (FIC, M은 329.26 g / 몰 R) 및 혐기성 버퍼 B.에서 온산 나트륨 (SD, M은 174.11 g / mol 인 R)의
- 다음과 같이 매개 믹스를 준비합니다
- B 버퍼는 아래의 산화 환원 매개 제 및 50 mM의 NaCl을 각각 160 μM 추가 : N, N, N ', N'테트라 메틸 -p- phenylendediamine (TMPD, M은 237.17 g / 몰, R, E '0 0.276 V) 2,6- 디클로로 페놀 인도 페놀(DCIP, M은 290.08 g / 몰, E R, 메틸렌 블루 (M r에 '(0 0.055 V, 페나 ethosulphate 0 0.217 V)를 PES, M은 334.4 g / 몰, E R') 319.85 g / 몰, E ' 0 0.011 V), 레조 루핀 (resorufin) (M 연구 235.17 g / mol이고, E '0 -0.051 V) Indigodisulphonate (M 연구 466.35 g / mol이고, E'0 -0.125 V), 2- 히드 록시 -1,4- naphtaquinone ( R의 M 174.15 g / mol이고, E '0 -0.145 V), 안트라 퀴논 -2- 술폰산 (M 연구 328.28 g / mol이고, E'0 -0.225 V) Phenosafranin (M R 322.8 g / 몰, E '0 -0.252 V), Safranin O (M r에 350.84 g / 몰, E '0 -0.280 V), 중립 빨간색 (M r에 288.8 g / 몰, E'0 -0.340 V), 벤질 비올로 겐 (M R 409.4 g / 몰, E '0 -0.350 V) 및 메틸 비올로 겐 (M은 257.16 g / mol이고, E, R'을 0 -0.440 V).
- 중재자를 보호하기 위해 알루미늄 호일에 병을 감싸빛으로부터의.
- 준비 10 ㎎ / ㎖ S. cerevisiae의 연쇄상 구균-태그 Nar1 단백질 버퍼 A. 익스프레스 S.에서 (181 μM, M은 55.2 kDa의 R) E.에서 cerevisiae의 Nar1 대장균은 연쇄상 구균 단백질로서 태깅 pET24A 발현 벡터를 이용. 연쇄상-tactin 크로마토 매체 (IBA)를 사용하여 혐기성 챔버에서 단백질을 정제 및 악타 청정기 (GE 헬스 케어)으로 단백질 정제 시스템을 사용하여 정제.
- 다음 혐기 챔버에서 산화 환원 적정 설치 준비 :
- Ag / AgCl 기준 전극과 적정 용기에 백금 와이어 전극을 연결한다. V.까지 MV에서 측정 할 수있는 전압계에 두 전극을 연결
- 작은 교반 막대를 삽입합니다.
- 자석 교반기 위의 적정 용기를 놓습니다.
- 완충액 B, 즉, 72 μM의 최종 단백질 농도를 최대 2 ㎖, 각각 38 μM의 매개체로 혼합 용액 및 단백질 용액으로 적정 용기를 채우기중재자. 주 : 단백질 농도에 의존하고 필요한 매개체가 조정되어야 세 용액의 양 농도.
- 30 분 동안 저어 전압계에 전환합니다.
- 10 깨끗한 석영 유리 EPR 튜브를 준비합니다. 혐기성 챔버 내에 도입 관.
- 액체 질소로 작은 (200 ㎖ 년경) 액체 질소 듀어를 입력합니다.
2. 산화 환원 적정을 수행
- 용액의 전위가 안정 될 때까지 기다립니다. 주 :이 실제로 전위가 분당 1 mV 미만 드리프트 것을 의미한다.
- 전압계에 의해 주어진 잠재력을합니다.
- 200 μL의 첫 번째 샘플을 그리고 EPR 튜브에 주입.
- 고무 마개로 튜브를 캡과 혐기성 챔버에서 튜브를 제거합니다.
- 다음과 같이 액체 질소에 튜브를 고정 :주의! 이것은 그렇지 않으면 관이 끊어집니다, 천천히 수행해야합니다.
- 먼저 t을 삽입액체 질소에서의 IP 튜브.
- 치찰음의 소리가 될 수있을 때까지 기다립니다. 참고 :이 10 초까지 걸릴 수 있습니다.
- 샘플 파트가 완전히 잠기도록 천천히 튜브의 나머지 부분을 삽입한다.
- -0.6 V로 용액의 전위를 낮추기 위해 적정 용기 내의 용액에 2 mM의 SD 용액의 작은 분취 1-2 μl를 추가
참고 : 10 개 이상의 μL 첨가되어야한다면, 20mM의 용액으로 전환. 그것이 특정 전위 값 포이즈 매우 어렵 기 때문에, 전압계에 기록 된 실제 값이 적어 및 적정 곡선을 구성하는 데 사용된다. - 단계 2.3-2.5의 설명에 따라 샘플을 그린다.
- 전압계에 의해 주어진 실제 가능성을합니다.
- 가능성이 약 50 MV 증가 할 때까지 산화제를 추가합니다. 2 mM의 FIC 용액의 작은 분취 1-2 μl를 첨가하여 시작한다. 이상 10 μL를 추가해야 할 경우, 20mM의 용액으로 전환.
- 호를 참고와트 솔루션의 대부분이 추가되었습니다. 주 : 이것은 적정 기간 동안 시료 희석을 교정 할 필요가있다.
- 단계 2.3-2.5의 설명에 따라 샘플을 그린다.
- 전압계에 의해 주어진 실제 가능성을합니다.
- 반복 덮여있다 -0.6 V 0.2에 V에서 잠재적 인 범위까지 2.9 및 2.12 단계를 모두 10 EPR 튜브 200 μL 각을 채워집니다.
주 : 모든 출금 볼륨이 감소됨에 따라, 전극의 위치는 조정될 필요가 간섭없이 교반 용액과의 양호한 접촉을 가질 수있다. 이 마지막 샘플의 취하하므로 그 시료의 전위가 덜 정확할 수있다 후의 전위를 측정하기 어려울 수도있다. - EPR 측정이 일어날 때까지 선택적으로, 액체 질소에 냉동 EPR 샘플을 저장합니다.
EPR 분광학 및 데이터 분석을 사용하여 3. 측정 적정 샘플
- 다른의 기록 EPR 스펙트럼적정 샘플은 다음과 같습니다 :
- <10-5 막대에 석영 저온 유지 장치를 대피 높은 진공 펌프를 사용합니다.
- EPR 자석의 물 냉각에 전환합니다. EPR 구멍을 통해 건조한 공기의 흐름을 엽니 다.
- 자석 전원과 EPR의 컴퓨터 스위치.
- 주파수 보정 프로그램을 실행합니다. EPR 측정 매개 변수를 설정합니다. 액체 헬륨 듀어에 저온 유지 장치를 연결합니다. 9-16 K.에 캐비티 쿨
- 공동의 EPR 샘플을 소개합니다. EPR 스펙트럼을 기록합니다.
- 다른 EPR 종을 확인하고 신호를 정량화하는 가장 좋은 스펙트럼을 사용합니다. 외부 구리 표준 용액의 스펙트럼 스펙트럼과 비교 더블 통합하여 EPR 정량을 달성 10 mM의 CuSO / 2 M 차아 염소산 나트륨 4 10분의 4 mM의 염산. (8)
- 다음 적정 곡선을 확인 :
- 파라에 대한 특징 g 값에 EPR 신호 진폭 플롯가능성에 대한 관심의 자기 종.
- 스핀에 EPR 신호 진폭 스케일을 변경 / 분자 규모를 단계 3.2에서 EPR 정량을 사용하여.
- 산화제 또는 환원제의 첨가로 인해 발생한 희석 각 샘플의 신호 진폭을 수정한다.
- Ag / AgCl 기준 전극의 전위에 대한 중간 점 전위를 수정한다.
주 : (포화 된 KCl을 포함) Ag / AgCl 기준 전극은 25 ° C에서의 표준 수소 전극 (SHE) 대 0.194 V의 중간 점 전위를 갖는다. 전압계의 전위는 -0.6 V 년경 읽으면 따라서, SHE을 참조 전위는 -0.4이다 V.
- 다음과 같이 네른스트 식에 맞는 신호 :
종은 그 감소 된 상태에서 상자성은 다음과 같습니다
상자성가 오에있는 종xidized 상태 :
중간 상태에서 상자성하는 종의 경우 :
이러한 방정식은 하나의 전자가 전송 된 산화 환원 반응에 유효하므로 N = 1.
볼트의 E는 = 가능성
E의 m = 볼트에 중점 가능성
F = 패러데이 상수 = 96,480 C · 몰 -1
R = 기체 상수 = 8.314 J · K -1 · 몰 -1
켈빈 T는 = 온도
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Representative Results
Nar1 : 사카로 미세스 세 레비 시아에서 단백질 Nar1를 포함하는 철 - 황 클러스터의 산화 환원 적정 세 가지 보조 인자의 확인 결과 [3Fe-4S] 클러스터, [4Fe-4S] 클러스터와 단핵 철 센터 (그림 1) . EPR 신호는 자신의 g-값 특징 : 대한 [3Fe-4S] + g Z 2.01 g 크로스 오버 2.00 (그림 1B); 대한 [4Fe-4S] +, G z를 2.02 g y를 1.93, g X 1.82 (그림 C) 및 단핵구의 Fe 3+ g 4.3 및 9.7 (그림 1A)를 참조하십시오. [4Fe-4S] + 클러스터의 EPR 신호가 Nar1에 대해보고 된 내용과 매우 유사 이전. 6,9 단핵 철의 EPR 신호는 사방 높은 스핀 철 종 (그림 1A)에 대한 특성이다.
EPR 신호의 정량화가 표시 [4Fe-4S] 그클러스터 단핵 철은 약 단백질 농도의 60 % 등몰이며, [3Fe-4S] 클러스터 함량은 5 % (도 1)된다. [3Fe-4S] 클러스터는 대부분 분해 생성물과 불완전 클러스터입니다. [3Fe-4S] 클러스터 신호는 아마도 인해 산화 저하, 0.05 V 이상 사라졌다.
다음의 중간 점 전위가 다른 보조 인자 측정 하였다 :
단핵 철 센터의 철 3+ / 철 2+ 커플 (그림 2A)에 대한 0.003 V, -0.125 [3Fe-4S]의 V + / [3Fe-4S 0 커플 (그림 2B)과 -0.45 사이 그리고 [4Fe-4S] 2+ / [4Fe-4S] + 커플 (그림 2C)에 대한 -0.50 V. 때문에 [4Fe-4S]의 낮은 값 더 정확한 중간 잠재력을 클러스터되지로 결정될 수있다. [4Fe-4S] 클러스터의 저 전위는 산화 환원 반응에서 역할을 갖고 있지 않음을 의미단백질은 또한 클러스터를 줄이는 것이 매우 어려울 수있는 바와 같이. 단핵 철 중심은 감소되거나 세포질에서 산화 될 수있다. 이 산화 환원 중심의 역할 것이 가능하다.
정제 된 단백질에 Nar1 독립 철 ferene 판정 방법을 이용하여 행 하였다. (10)이 3.2의 Fe / 분자를 수득 하였다. 단핵 FE 신호는 분자 당 0.6 철을 나타내고, [3Fe-4S] 클러스터은 분자 당 0.05이다. 이것은 2.45 철 / 분자, 단백질 분자 당 따라서 0.61 [4Fe-4S] 클러스터를 떠난다. -0.45V에서 [4Fe-4S] + 클러스터의 EPR 신호의 정량화 0.26 스핀 / 분자 결과. 그래서 [4Fe-4S]는 클러스터가 이러한 정량화를 바탕으로 -0.45 V.에서 감소 될 수있다 [4Fe-4S]의 중간 잠재적 2+ / [4Fe-4S가] + 부부의 -0.46 V가 결정되었다의 만 42 % .
그림 1 : EPR Nar1의 다른 보조 인자의 스펙트럼. (A) 단핵 높은 스핀 철의 S 0.031 V. EPR 조건에서 태세 Nar1의 = 이분의 오 신호 : 마이크로 웨이브 주파수, 9.386 GHz의; 마이크로파 전력, 20dB; 변조 주파수 100 kHz로; 변조 크기, 12.5 G; -0.004 V. EPR 조건에서 태세 Nar1의 온도, 16 K. (B) 3Fe-4S] + 클러스터 S = 1 / 조건 2 신호 : 마이크로 웨이브 주파수, 9.386 GHz의; 마이크로파 전력, 16dB; 변조 주파수 100 kHz로; 변조 크기, 12.5 G; 온도, 9.5 K. (C) 4Fe-4S] + -0.45 V. EPR 조건에서 태세 Nar1의 클러스터 S = 1 / 조건 2 신호 : 마이크로 웨이브 주파수, 9.385 GHz의; 마이크로파 전력, 16dB; 변조 주파수 100 kHz로; 변조 크기, 12.5 G; 온도, -0.25 V 아래 9.2 K. 메틸 비올로 겐과 벤질 비올로 겐의 양이온 라디칼 종에 기인 날카로운 S = 1 / 조건 2 신호 (*) 등장.
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그림 2 : Nar1의 보조 인자의 산화 환원 적정. (A) g = 4.3에서 모니터 단핵 높은 스핀 철 신호의 적정 곡선;. g에서 모니터 (B) 적정 [3Fe-4S]의 곡선 + 신호 = [4Fe-4S]의 2.01 (C) 적정 곡선 + 신호 g = 1.82에서 모니터. 실선은 중간 전위 단핵 철 센터의 철 3+ / 철 2+ 커플 0.003 V, [3Fe-4S] + / [3Fe-4S에 대한 -0.125 V와 N = 1 산화 환원 전환을위한 맞는 있습니다 ] [4Fe-4S] 2+ / [4Fe-4S] + 부부 영 커플 -0.46 V.
그림 3 :. 중재자 믹스를 구성하는 다른 산화 환원 매개체의 네른스트 곡선 순서는 GIV으로 오른쪽에서 왼쪽입니다EN 프로토콜 및 표 1.
| 이름 | CAS 번호 | SHE VS E '0 (V) | w M (g / mol)의 |
| N, N, N ', N'테트라 메틸 -p- phenylendediamine (TMPD) · (HCL) 2 | 637-01-4 | 0.276 | 237.17 |
| 2,6- 디클로로 페놀 인도 페놀 (DCIP), 나트륨 염 | 620-45-1 | 0.217 | 290.08 * |
| 페나 에토 (PES) | 10510-77-7 | 0.055 | 334.4 |
| 메틸렌 블루 | 122965-43-9 | 0.011 | 319.85 * |
| 레조 루핀 (resorufin), 나트륨 염 | 34994-50-8 | -0.051 | 235.17 |
| Indigodisulfonate (인디고 카민) | 860-22-0 | -0.125 | 466.35 |
| 2- 하이드 록시 -1,4- naphtaquinone | 83-72-7 | -0.145 | 174.15 |
| 안트라 퀴논 -2- 술폰산 나트륨 + H 2 O | 153277-35-1 | -0.225 | 328.28 |
| Phenosafranin | 81-93-6 | -0.252 | 322.8 |
| Safranin O | 477-73-6 | -0.280 | 350.84 |
| 중립 빨간색 | 553-24-2 | -0.340 | 288.8 |
| 벤질 비올로 겐 | 1102-19-8 | -0.350 | 409.4 |
| 메틸 비올로 겐 | 1910-42-5 | -0.440 | 257.16 * |
* 무수
표 1 : 중재자 믹스를 구성하는 산화 환원 매개체.
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Discussion
13 산화 환원 매개체의 시리즈에서 -0.45 SHE 대 +0.3 V (표 1 및도 3)의 범위로 용액의 산화 환원 평형을 허용한다. 그럼 위의 이러한 잠재력 아래의 모든 매개체 중 하나를 완전히 줄어들거나 완전히 산화 따라서 단백질의 산화 환원 반응의 센터와 더 이상 평형은 발생하지 않을 수 있습니다. 때때로 산화 환원 적정 만 좁은 범위 11 측정 될 수 있도록, 두 개 또는 세 개의 매개로 수행 문헌 이것은, 중요한 개념이다. 산화 환원 매개체는 보조 인자의 중간 점 전위의 약 ± 50 MV의 범위 내에서 중간 전위가 있으면 이러한 산화 환원 적정 만 신뢰할 수있는 결과를 줄 것이다. 다른 매개체의 중간 전위의 온도 의존성이 결정되고있어, 그 산화 환원 적정 짹이 80 ° C. 증발시켜 12만큼 높은 온도에서 수행 될 수있다 나타났다배급량 용액 가장 단백질 함유 용액과 호환 뉴졸 광유의 층을 추가로 방지 할 수있다.
용액 및 적정 용기의 anaerobicity은 매우 중요하다. 적정 바람직 혐기성 글러브 박스에서 수행해야합니다. 그러나, 아르곤 가스 공급 장치에 연결된 밀봉 적정 용기를 사용하는 것이 가능하다. EPR 튜브 고무 튜브의 작은 조각을 사용하여 아르곤 / 진공 매니 폴드에 연결될 수있다. 적정 샘플을 13cm 긴 바늘 기밀 주사기를 사용하여 고무 튜브를 통하여 튜브에 주입 할 수있다.
단백질은 호기성 조건 하에서 석출물의 Nar1 anaerobicity의 적정 중에 매우 중요했다 (도시 생략). 석출이 적정 동안 발생하지 않았다.
EPR은 두 가지 접근 방식은 중간 점 포를 결정하는 데 사용 할 수 있지만 산화 환원 적정은, 직접 전기 화학 (전압 전류)에 보완 모니터링 보조 인자의 tentials. 첫 번째는 EPR 검출 산화 환원 상태에서 보조 인자 (들)의 식별 및 정량화를 제공한다. 후자는 전자 전달 동력학에 대한 정보를 제공하고 더 적은 양의 단백질을 필요로한다. 종종 직접 전기 화학적 방법에 필요로 산화 환원 적정의 단백질 시료는 표면에 특별한 사전 처리 또는 고정을 필요로하지 않습니다.
직접 전기 화학은 특별한 경우에만 성공과 최적의 조건을 찾기 위해 집중적 인 실험을 필요로하고있다. EPR는 산화 환원 적정에 관계없이 효소 시스템의 복잡성, 산화 환원 보조 인자를 특성화하는 비교적 간단한 방법을 제공하는 모니터. 이 기술은 여러 보조 인자와 큰 단백질 복합체의 특성에 필수적이다. 구조 정보 및 효소 반응 속도론의 특성과 결합, 촉매 메커니즘은 상세하게 공부하실 수 있습니다.
jove_content "> 본 연구에서는 S. cerevisiae의 Nar1p의 보조 인자가 특징으로 한 철 보조 인자의 세 종류가 발견되었다 :.. 단핵 철, [3Fe-4S] 클러스터는 [4Fe-4S] 클러스터 [3Fe의 양 -4S] 클러스터는 단백질 농도의 5 %이고 가능성 [4Fe-4S] 클러스터의 산화 분해 제품을 나타냅니다. 단핵 철 [4Fe-4S] 클러스터 모두 화학 양 론적 양으로 존재.의 중간 가능성 [4Fe-4S] 클러스터는 클러스터의 생리 산화 상태임을 2+하고 클러스터가 산화 환원 기능을 갖는 가능성되지 않았 음을 나타내는 매우 낮다. 단핵 철 그러나 중간 중간 전위를 가지며 가능한 생리적 조건 하에서 산화 환원 변화를 겪게된다.산화 환원 효소의 생 촉매 응용 프로그램은 재생 에너지 원보다 지속 가능한 합성 경로에 대한 요구에 대한 응답으로 부상하고있다. 산화 환원 P의 특성이들 효소의 roperties 이러한 효소의 촉매기구 및 범위를 이해하는 것이 중요하다. 예를 들어, T1 락카의 구리 중심의 중간 점 전위가이 효소의 중요한 특성으로 간주된다. laccases의 촉매 효율은 T1 구리 중심과 기판 (13)의 중간 점 전위의 차이 즉, 전자 전달의 열역학적 구동력에 직접적으로 의존하는 것으로 나타났다. 산화 환원 적정 효소와 단백질에 다른 산화 환원 반응의 보조 인자의 중간 점 잠재력을 얻을 수있는 매우 강력한 방법을 제공합니다. 기법은 일반적으로 비교적 소수의 단백질 mg의 필요 단백질의 관점에서 요구하고 있지만, 성공 가능성이 매우 높다 할 것이다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 재정적으로 화학 디자인 (NRSC-촉매)에 의해 제어 네덜란드 국가 연구 학교 겸용, 촉매에서 연구비에 의해 지원되었다. 박사 HY Steensma과 라이덴 대학에서 박사 GPH 반 Heusden는 S의 재조합 발현과의 지원 인정 cerevisiae의 Nar1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference electrode (Ag/AgCl) | Radiometer | ||
| Chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| EPR spectrometer | Bruker | ||
| N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) · (HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt | 620-45-1 | ||
| Phenazine ethosulfate (PES) | 10510-77-7 | ||
| Methylene blue | 122965-43-9 | ||
| Resorufin, sodium salt | 34994-50-8 | ||
| Indigodisulfonate (indigo carmine) | 860-22-0 | ||
| 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone | 83-72-7 | ||
| Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Phenosafranin | 81-93-6 | ||
| Safranin O | 477-73-6 | ||
| Neutral red | 553-24-2 | ||
| Benzyl viologen | 1102-19-8 | ||
| Methyl viologen | 1910-42-5 |
References
- Lippard, S. J., Berg, J. M. Principles of Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. (1994).
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