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Articolo metodologico

Trasferimento Gene vascolare da stent metallico superfici utilizzando Adenoviral Vettori Tethered tramite idrolizzabili Cross-linker

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DOI:

10.3791/51653

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12 agosto 2014

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1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

In questo articolo

Sommario

Questi studi riportano l'attaccamento reversibile di vettori genici adenovirali a superfici metalliche senza rivestimento di stent e dischi a rete modello. Il rilascio prolungato di particelle virali competenti per la trasduzione, subordinato all'idrolisi dei reticolanti utilizzati per l'immobilizzazione del vettore, determina un'espressione transgenica sito-specifica duratura nelle cellule vascolari e nelle arterie con stent.

Abstract

In-stent restenosi presenta una complicazione maggiore di procedure di rivascolarizzazione basato stent-ampiamente utilizzati per ristabilire il flusso di sangue attraverso segmenti criticamente socchiusi delle arterie coronariche e periferiche. Stent endovascolari capaci di rilascio regolabile di geni con attività anti-restenotico può presentare una strategia alternativa di utilizzare attualmente stent a rilascio di farmaco. Per raggiungere traduzione clinica, gli stent a eluizione di geni devono presentare cinetica prevedibili del gene vettore di rilascio dello stent-immobilizzato e site-specific trasduzione dei vasi, evitando una eccessiva risposta infiammatoria tipicamente associati con i rivestimenti polimerici utilizzati per intrappolamento fisico del vettore. Questo documento descrive una metodologia dettagliata per il tethering senza cappotto di vettori genici adenovirali di stent sulla base di un legame reversibile delle particelle adenovirali per polyallylamine bifosfonati (PABT) -Modified superficie in acciaio inox con idrolizzabili reticolanti (HC). Una famiglia dibifunzionale HC (ammina e nonil fenolo tiolo-reattiva), con una t media mezzo di idrolisi in-catena compresa tra 5 e 50 giorni sono stati usati per collegare il vettore con lo stent. La procedura vettore immobilizzazione viene tipicamente effettuata entro 9 ore e comprende diverse fasi: 1) incubazione dei campioni di metallo in una soluzione acquosa di PABT (4 ore); 2) deprotezione dei gruppi tiolici installati in PABT con tris (2-carbossietil) fosfina (20 min); 3) l'espansione del tiolo capacità reattiva della superficie metallica facendo reagire i campioni con polietileneimmina derivatizzati con pyridyldithio (PDT) gruppi (2 ore); 4) la conversione di gruppi di PDT per tioli con ditiotreitolo (10 min); 5) modifiche di adenovirus con HC (1 ora); 6) la purificazione di particelle adenovirali modificate per dimensione-esclusione cromatografia su colonna (15 min) e 7) immobilizzazione di particelle adenovirali tiolo reattivo sulla superficie di acciaio tiolati (1 ora). Questa tecnica ha ampia applicabilità potenziale oltre stent,facilitando ingegneria delle superfici di dispositivi bioprotesi per migliorare la loro biocompatibilità attraverso la consegna del gene substrato mediata alle cellule di interfacciamento del materiale estraneo impiantato.

Introduzione

L'efficacia della terapia genica come modalità terapeutica è ostacolata dalla capacità di targeting poveri di vettori di terapia genica 1,2. La mancanza di risultati di targeting propri in livelli sub-terapeutici di espressione del transgene nella posizione di destinazione e porta a una vasta diffusione dei vettori di organi non bersaglio 3, comprese quelle responsabili per il montaggio risposte immunitarie contro sia il vettore e codificati prodotto terapeutico 4, 5. Un potenziale significa compensare la promiscuità di trasduzione e di promuovere il targeting è quello di introdurre vettori genetici nella posizione desiderata in una forma che impedisce la loro libera diffusione attraverso il sangue e la linfa. Tipicamente, tali sforzi si basano su un sistema di consegna locale iniettabili comprendenti sia di vettori virali o non virali mescolati con fibrina, collagene o acido ialuronico matrici di idrogel 6-10 che sono in grado di transitoriamente sostengono vettori genetici nel sito di iniezione intrappolando fisicamente them in una rete polimerica.

Un altro paradigma generalmente accettato per la terapia genica localizzata utilizza immobilizzazione di vettori genetici sulla superficie dei dispositivi protesici impiantati 11,12. Impianti medici permanenti (endovascolari, bronchiali, stent urologici e gastrointestinali, pacemaker, articolazioni artificiali, maglie chirurgici e ginecologici, ecc.) Sono utilizzati ogni anno in decine di milioni di pazienti 13. Mentre generalmente efficace, questi dispositivi sono inclini a complicazioni che non sono adeguatamente controllati dalla pratiche mediche attuali 14-17. Dispositivi protesici impiantabili presentano un'opportunità unica per fungere da piattaforme di proxy per il trattamento localizzato la terapia genica. Dal punto di vista farmacocinetico, la superficie derivatizzazione di protesi mediche con dosi relativamente basse di ingresso di vettori genici risultati nel raggiungimento sia alte concentrazioni locali di vettori genetici sulla interfaccia impianto / tessuto e rallentare la cinetica di their eliminazione da questa posizione. Come conseguenza di residenza protratto e migliorato assorbimento da parte della popolazione di cellule bersaglio, vettore immobilizzazione minimizza propagazione del vettore gene. Così l'inoculazione involontaria di tessuti non bersaglio è ridotta.

Tethering superficie di vettori genici sui biomateriali impiantabili (anche definito come substrato mediata consegna del gene o la consegna del gene fase solida) è stato implementato in colture di cellule animali e gli esperimenti utilizzando sia specifica (antigene-anticorpo 18-20, avidina-biotina 21,22) e 23-26 (a pagamento, di van der Waals) interazioni non-specifiche. L'attacco covalente di vettori per la superficie del dispositivo impiantato è stata precedentemente considerata non funzionale fin troppo forti legami con la superficie precludono vettore internalizzazione dalle cellule bersaglio. Recentemente è stato dimostrato che questa limitazione può essere superata mediante l'uso di spontaneamente idrolizzabile reticolante usato come tetlei tra la superficie metallica modificata dello stent e del capside proteine ​​del vettore adenovirale 27,28. Inoltre, il tasso di rilascio vettoriale e decorso di espressione del transgene in vitro e in vivo possono essere modulati con l'uso di idrolizzabili reticolanti espongono diverse cinetiche di idrolisi 28.

Il presente lavoro fornisce un protocollo dettagliato per il legame covalente reversibile di vettori adenovirali per superficie metallica attivato e introduce un setup sperimentale utile per lo studio successivi eventi di trasduzione in vitro nel muscolo liscio colto e cellule endoteliali e in vivo nel modello di ratto di stent carotideo angioplastica .

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Protocollo

1 Preparazione di Cy3-marcato Adenovirus per gli esperimenti di rilascio

  1. Sospendere 2 x 10 12 particelle di annuncio vuoto (circa 2 x 10 11 unità infettivi) in 650 ml di tampone carbonato / bicarbonato (CBB; pH 9.3).
  2. Sciogliere il contenuto di 1 fiala (0,2 mg) di colorante fluorescente ammina-reattiva (Cy3 (NHS) 2) in 1 ml CBB ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml.
  3. Aggiungere 100 ml di soluzione colorante di sospensione di virus, vortex per 5 secondi e incubare per 1 ora a 28 ° C con agitazione (100-200 giri al minuto).
  4. Equilibrare un ml Sepharose 6B colonna 20 con PBS. Aggiungere 750 ml di Cy3-marcato sospensione annuncio goccia a goccia al centro del letto di gel.
  5. Dopo la sospensione virale permea la resina, aggiungere 5 ml di PBS. Scartare l'eluato.
  6. Aggiungere 0,5 ml di PBS e raccogliere l'eluato in un contenitore di vetro con etichetta. Ripetere questo passaggio 10x raccogliendo un totale di dieci 0,5 ml frazioni.
  7. Assay the raccolte frazioni mediante spettrofotometria (260 e 280 nm) per contenuto di DNA virale.
  8. Comune le frazioni contenenti più del 10% del totale (somma di F1 a F10) densità ottica (OD) a 260 nm. Nota: in genere le frazioni F3, F4, F5, F6 e sono raggruppati e mescolati.
  9. Re-test frazioni aggregati misti di spettrofotometria (260 e 280 nm) e test di fluorometria (ex 550 / em 570 nm) per il contenuto di DNA virale e Cy3 etichettati proteina del capside, rispettivamente. Nota: Una curva di calibrazione Cy3 (NHS) 2 che copre la gamma 10 -9 -10 -13 mol / L è preparato e fluorimetrically saggiati sulla stessa piastra come le frazioni pool.
  10. Calcolare il rendimento virus etichettati e densità di etichettatura. Si supponga che le particelle di 1.19 x 10 12 virus / ml corrisponde a 1 unità per OD da 1 cm di lunghezza percorso 29. Utilizzare la formula: Yield = [(OD 260 nm /1.19)*10 12 * quantità V / ingresso annuncio] * 100, dove, OD 260nm è il de otticansity della formulazione pool a 260 nm e V è il volume della formulazione pooled (ml) per calcolare la resa di recupero annuncio (%). Utilizzare la formula: Etichettatura Densità = C * 6,02 * 10 23 / ​​(OD 260 nm /1.19)*10 12, dove C è la concentrazione Cy3 della formulazione pooled (moli / ml) e OD 260 nm è la densità ottica della formulazione pool a 260 nm per calcolare la densità media di etichettatura Cy3. NOTA: Un tipico recupero di virus marcato è> 70% della dose di ingresso. La densità di etichettatura è 600-800 molecole di fluoroforo per particella virus singola.
  11. Ad vuoto in porzioni più piccole (in genere 5 x 10 11 particelle) adatti per gli esperimenti di rilascio singoli Aliquota Cy3-etichettati. NOTA: il protocollo corrente specifica l'uso di Ad Cy3 marcato esclusivamente nell'esperimento rilascio. Tutti gli studi di trasduzione sono effettuate con vettori non etichettati.

2 Attivazione di campioni di metallo

  1. Lavare le s inossidabiliteel maglia dischi o stent in acciaio inox consecutivamente in isopropanolo (5 min x 2) e cloroformio (5 min x 2) a 55 ° C con agitazione (100 rpm). Togliere il solvente.
  2. Riscaldare i campioni per 30 minuti a 200 ° C.
  3. Sciogliere polyallylamine bisfosfonato con installati gruppi tiolici latenti (PABT 27,28,30) in acqua (1-2% w / v) a 72 ° C con agitazione (100 rpm). Regolare il pH a 4,5-5 con KHCO 3.
  4. Incubare i campioni di metallo nella soluzione PABT per 2-4 ore a 72 ° C con agitazione (100-200 giri al minuto). NOTA: La procedura può essere messo in pausa in questo punto. I campioni sono stabili per 3 giorni a 4 ° C.
  5. Sciacquare i campioni tre volte con acqua distillata doppio (DDW).
  6. Esporre i campioni di tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP; 15 mg / ml in 0,1 M tampone acetico) per 15 minuti a 28 ° C con agitazione (100-200 giri al minuto).
  7. Sciacquare 5x in degassato DDW.
  8. Esporre i campioni al 2% polietileneimmina con gruppi pyridyldithio installati (PEI PDT 27,28,30) in degasata DDW in atmosfera di argon per 2 ore a 28 ° C con agitazione (100-200 giri al minuto). NOTA: La procedura può essere messo in pausa in questo punto. I campioni sono stabili per 2 settimane a 4 ° C.
  9. Sciacquare i campioni per tre volte con DDW.
  10. Esporre i campioni a 10 mg / ml ditiotreitolo / DDW per convertire gruppi pyridyldithio di tioli.
  11. Sciacquare nuovamente 5x in degassato DDW.

3. Adenovirus Attivazione e Metal Immobilizzazione superficie

  1. Sospendere 5 x 10 11 particelle di entrambi annuncio eGFP o Ad Luc (circa 5 x 10 10 unità infettivi) in 487,5-495 ml di tampone carbonato / bicarbonato (CBB; pH 9.3). Nota: Per gli studi di rilascio, utilizzare 5 x 10 11 di Cy3 etichettato particelle vuote annuncio (regolare il volume a 487,5-495 microlitri con CBB).
  2. Sciogliere HC con diversi tassi di idrolisi 28 [(rapidamente (t 1/2 = 5 d), intermedia (t 1 /2 = 12 d) e lentamente (t 1/2 = 50 d) HC, cioè RHC, IHC o SHC; Figura 1] o non idrolizzabili cross-linker (NHC), solfo-LC-SPDP in CBB a 20 mm.
  3. Aggiungere immediatamente 5-12,5 ml di soluzione cross-linker per la sospensione di virus per un volume totale di 500 ml (200-500 micron concentrazione finale di cross-linker), vortex e incubare per 1 ora a 28 ° C con agitazione (100- 200 rpm).
  4. Equilibrare un ml Sepharose 6B colonna 20 con degasato 5 mM EDTA / PBS (EPBS). Aggiungere goccia a goccia 500 ml di sospensione Ad-reticolante modificato al centro della resina.
  5. Aggiungere 5 ml di degassato EPBS. Scartare l'eluato.
  6. Aggiungere 0,5 ml di degassato EPBS e raccogliere l'eluato in un contenitore di vetro con etichetta. Ripetere questa operazione 10 volte raccogliendo un totale di dieci frazioni da 0,5 ml.
  7. Determinare OD delle frazioni raccolte mediante spettrofotometria a 260 e 280 nm e convertire OD di titoli virus (1.19 x 10 12 / ml corrisponde a 1 OD) 29.
  8. Comune le frazioni contenenti> 10% del virus eluito (Nota: in genere, le frazioni F3-F6). Ripetere l'analisi titolo spettrofotometrico per la sospensione pool.
  9. Trasferire la sospensione virale per il flaconcino con i campioni di metallo attivati ​​(come da 2.11). Incubare in atmosfera di argon per 1 ora a 28 ° C con agitazione (100-200 giri al minuto). Nota: I campioni di metallo Ad-tethered ottenuti in questa fase sono ulteriormente utilizzati negli esperimenti di rilascio e di trasduzione successivi descritti nelle sezioni 5-7 del protocollo.

4.-Quantificazione di superficie associata annuncio Vector mediante PCR

  1. Preparare maglie formulati con superficie immobilizzato annuncio eGFP legato con NHC, SHC, IHC e RHC (n = 3 per ogni tipo), come descritto nelle sezioni 2 e 3.
  2. Utilizzare un kit QIAamp Micro DNA per isolare il DNA virale. Posizionare le maglie singolarmente in tubi di plastica da 1,5 ml contenente 200 ml di miscela composta da 180 ml di ATL bUffer e 20 ml di proteinasi K (sia dal kit). Aggiungi quantità nota di particelle Ad eGFP (come standard per la curva di calibrazione) nelle provette separate contenenti la stessa miscela. Incubare a 56 ° C per una notte senza agitare.
  3. Aggiungere 200 ml di tampone AL (dal kit), mescolare nel vortex, aggiungere 200 ml di etanolo al 100%, e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  4. Trasferire la miscela da ciascuna provetta su una singola colonna MinElite (dal kit) e far girare a 8000 rpm per 1 min. Sciacquare i tubi-maglia contenente 180 ml di tampone ALT fresco, aggiungere sulle rispettive colonne e centrifuga a 8000 rpm per 1 min. Scartare gli eluati.
  5. Aggiungere 500 ml di tampone AW1 (dal kit) nelle colonne e far girare a 8000 rpm per 1 min. Scartare gli eluati.
  6. Aggiungere 500 ml di tampone AW2 (dal kit) nelle colonne e far girare a 8000 rpm per 1 min.
  7. Scartare gli eluati.
  8. Spin a 14.000 rpm per un ulteriore 3 min until le colonne sono completamente asciutti. Scartare gli eluati.
  9. Aggiungere 50 ml di acqua MilliQ-grade nelle colonne. Spin a 14.000 rpm per 5 min. Raccogliere 50 ml di eluato da ogni colonna nel tubo di raccolta individuale (dal kit).
  10. Preparare la soluzione PCR Master Mix combinando moltiplica dei seguenti (12,5 ml di Potenza SYBR Green PCR Master Mix, 0,63 ml di 10 mM eGFP senso di primer [5'-ACG ACG TAA CCG ACA AGT TC -3 '], 0,63 ml di 10 mM eGFP anti-senso di primer [5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 '], 6,3 ml di acqua MilliQ-grade). Moltiplicate questi volumi per il numero di reazioni previste compresi i controlli "no" del DNA.
  11. Carico 5 ml di annuncio eGFP DNA (dal punto 4.8) e 20 ml di PCR Master Mix nei pozzetti in triplicato di una piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp. Sigillare la piastra con MicroAmp ottico Pellicola adesiva. Gira la piastra a 1000 rpm per 1 min per eliminare le bolle d'aria.
  12. Posizionare la piastra nella presa di un motore 7500 Real-Time PCR. Nel menu principale del 7500 Sistema SDS Software (v1.4 o superiore) selezionare "Crea nuovo esperimento". Fare clic su "Avanti". Nella schermata "Nuovo esperimento wizard" scegliere Sybr verde da un menu a tendina e cliccare su "add". Fare clic su "Avanti" per ottenere un layout della piastra. Evidenziare tutti i pozzetti da analizzare, selezionare SYBR Green. Evidenziare consecutivamente senza pozzetti di controllo del DNA, annuncio eGFP standard di DNA e di incognite, e contrassegnarli con rispettive designazioni dal menu a tendina.
  13. Passare alla scheda strumento. Selezionare "aggiungi fase di dissociazione", modificare il volume e dal default 50 ml a 25 ml. Fare clic su Start.
  14. Analizzare i risultati della PCR utilizzando dopo aver controllato il riepilogo QC per valori anomali e di altre irregolarità.

5 Rilascio Cinetica di idrolizzabili Croce-linker-legato Vector particelle dal modello in maglia di acciaio

  1. Lavare i campioni di maglia derivatizzati con Ad Cy3 marcato via RHC, IHC, SHC e NHC (come da 3.9) a 1% BSA / PBS (1 ora x 3) con agitazione (100-200 giri al minuto).
  2. Utilizzando sterili pinza sottile, posizionare le maglie in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti pre-riempite con 200 ml di tampone di eluizione (0.1% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS).
  3. Prendere immagini fluorescenti di una parte centrale di ciascuna maglia. Registrare le impostazioni del microscopio e la camera CCD utilizzata per l'acquisizione delle immagini.
  4. Analizzare la piastra fluorimetrically (ex 550/570 em) in modalità ben scansione con la massima riduzione. Utilizzare i pozzetti con maglie non derivatizzate come controllo di sfondo.
  5. Incubare la piastra a 37 ° C con agitazione (50 rpm).
  6. A orari prestabiliti (range 1-30 giorni) aspirare il tampone di eluizione senza disturbare le maglie e aggiungere 200 ml di tampone di eluizione fresco. Ripetere i passaggi 4,3-4,5 dopo la sostituzione il buffer.

6. trasduzione di Cultured CelLS di Mesh-immobilizzati Ad vettori

  1. Lavare l'annuncio eGFP - o Ad Luc -derivatized maglie tre volte con PBS sterile per 5 minuti con agitazione (100 rpm).
  2. Utilizzando pinza sottile sterile rimuovere i dischi della maglia uno per uno e individualmente metterli nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con il tipo cellulare di interesse nella fase di log di crescita.
  3. Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2.
  4. Utilizzare il rispettivo test non terminale endpoint (microscopia a fluorescenza, fluorometria per eGFP o bioluminescenza di imaging per luciferasi) per determinare l'entità e la distribuzione spaziale di espressione genica nei pozzetti.
  5. Facoltativamente, media sostituto di PBS per aumentare la sensibilità del test fluorometria (485/535 nm) se si prevede bassa espressione eGFP. Nota: Se un fluorimetro è dotato di capacità ben scansione, leggere la piastra in una modalità ben scansione per valutare la distribuzione spaziale delle cellule nei pozzetti eGFP-esprimono. Scambio PBS per mezzo dopo aver completato fluorometria.
  6. Immagine le cellule trasdotte nei pozzetti con maglie annuncio eGFP -eluting (sia sottostanti e periferiche della maglia) utilizzando il set di filtri FITC. Prendere immagini rappresentative a 40-200X ingrandimento. Registrare le impostazioni esatte del microscopio a fluorescenza e la camera CCD utilizzata per l'acquisizione delle immagini.
  7. Aggiungere 5 ml di luciferina magazzino in PBS (10 mg / ml) direttamente pozzetti con Ad Luc -eluting maglie a una concentrazione finale di 500 mg / ml ed incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 10 min prima di imaging bioluminescenza . Aspirare i media e sostituirli con supporti libero-luciferina dopo l'imaging.
  8. Ripetere dosaggi endpoint ad orari prestabiliti (fino a 2 settimane) per studiare la cinetica di espressione del gene reporter seguenti trasferimento di geni substrato-mediata.

7 Convalida dei Conservato trasduzione capacità ai punti di ritardata

  1. Preparare l'annuncio eGFP demaglie rivatized utilizzando RHC, IHC, SHC e NHC per il vettore di tethering (come da 2,1-2,11 e 3,1-3,9) e posizionare individualmente le maglie dei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con 60-80% confluenti cellule endoteliali aortiche bovine (BAEC ).
  2. Analizzare trasduzione di coltura BAEC con maglia-immobilizzato annuncio eGFP a 1 e 2 giorni di collocamento post-maglia con microscopia a fluorescenza e fluorometria (come da 6,4-6,5).
  3. 48 ore dopo l'inizio della trasduzione lavare i pozzetti a maglia contenenti due volte con PBS.
  4. Aggiungere 200 ml di 0,25% tripsina / EDTA in ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a 37 ° C con agitazione (100 rpm). Lavare 3x con PBS.
  5. Utilizzare microscopia a fluorescenza e fluorometria per accertare la completa rimozione di tutte le cellule eGFP-positivi associati alle maglie.
  6. Seme fresco diversi passaggi BAEC nei pozzetti con maglie parzialmente rilasciato ad una densità di semina iniziale 60-80% (2-2,7 x 10 4 cellule / pozzetto).
  7. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% di CO 2 per periodi predeterminati di tempo (1-10 giorni) prima della valutazione dei "nuovi" eventi di trasduzione mediante microscopia a fluorescenza e fluorometria.

8 Ad-stent a eluizione di distribuzione nel ratto carotideo Modello di stent per angioplastica

  1. Tutte le procedure sugli animali descritti in questo protocollo sono conformi alle normative federali sull'uso animali da laboratorio e sono stati approvati dal IACUC dell'Ospedale dei Bambini di Philadelphia. Per aderire alle condizioni chirurgiche asettiche tutti gli strumenti sono sterilizzati in autoclave. Per assicurare la sterilità continua uno sterilizzatore tallone è impiegato tra l'uso degli strumenti in un massimo di cinque animali consecutivi.
  2. Preparare Ad Luc -eluting stent secondo 2,1-2,11 e 3,1-3,9. Conservare gli stent virus-derivatizzati in PBS sterile a 4 ° C per non più di 24 ore prima dell'uso.
  3. Anestetizzare ratti maschi Sprague-Dawley (400-450 g) con iniezione ip di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg). DeTermine della profondità dell'anestesia da zampa risposta pizzico e tono muscolare. Applicare una pomata oftalmica veterinario per prevenire la secchezza della cornea e nella sclera. Nota: L'anestesia inalatoria con il 4% e il 2% isoflurano (1 L / min) per l'induzione e il mantenimento dell'anestesia, rispettivamente, è possibile, ma impedisce il libero accesso alla regione del collo dell'animale e quindi non è raccomandato per un utente inesperto.
  4. Rivalutare la profondità di anestesia pizzico punta. Shave e il collo in modo asettico preparazione e della regione superiore del torace. Somministrare antibiotico (cefazolina; 20 mg / kg IM), analgesici (meloxicam, 0,5 mg / kg; SC) e soluzione salina (10 ml / kg SC). Cateterizzarla la vena della coda con un catetere di 24 G e somministrare eparina (200 UI / kg IV). Nota: Una dose di 10 mg / kg (IM) enrofloxacina (Baytril) può essere usato al posto di cefazolina. Evitare l'uso di antibiotici privi di significativa attività contro i batteri Gram-positivi. 10-15 mg / kg carprofen (Rimadyl) può essere utilizzato al posto di meloxicam come un analgesico preventivo. Analgesici narcotici (e.g., morfina, buprenorfina) deve essere evitato a causa delle loro proprietà-respirazione deprimente.
  5. Eseguire un'incisione mediana attraverso la fascia pelle e del collo. Utilizzare tecniche di dissezione smussa per isolare sinistra arteria carotide esterna. Tie-off carotide esterna presso il sito accessibile più distale. Applicare una legatura temporanea scorrevole all'origine della carotide interna.
  6. Fare un'incisione arteriotomia 2 mm nella sinistra arteria carotide esterna.
  7. Inserire un catetere di Fogarty 2-Francese nell'arteria carotide comune attraverso l'incisione nella carotide esterna. Gonfiare la punta del catetere con soluzione salina e passare 3x dall'arco aortico alla biforcazione carotidea per spogliare l'endotelio.
  8. Far scorrere un pezzo di tubo (1.04 mm di diametro esterno, ID 0,99 millimetri) sopra il catetere di Fogarty e nell'arteria carotide comune. Ritirare il catetere di Fogarty.
  9. Montare e crimpare un annuncio Luc -derivatized stent sul palloncino di un 1,5mm diametro del catetere per angioplastica. Inserire lo stent attraverso il tubo di Teflon e avanzare nella parte centrale della carotide comune. Evitare di strofinare lo stent contro la parete del tubo o della nave.
  10. Distribuire lo stent a 12 atm per 30 sec e ritirare il catetere angioplastica.
  11. Fermatura prossimale carotide esterna al sito arteriotomia e rilasciare la legatura temporanea sulla carotide interna.
  12. Riparare la ferita operatoria in strati con esecuzione 4.0 Vicryl sutura e fiocco la pelle.
  13. Recuperare l'animale su un blocco di riscaldamento fino ambulatoriale e tornare alla sua gabbia isolata. Mentre nessun segno di dolore o fastidio sono tipicamente esposti dagli animali post-operatorie oltre il primo 12 ore dopo la procedura, considerare l'estensione della terapia meloxicam (0,5 mg / kg, SC al giorno) per 72 ore.

9 Imaging bioluminescenza delle arteriosa Gene Expression

  1. A intervalli di tempo prefissati (1 giorno - 3settimane range) dopo la distribuzione stent a eluizione di gene in arteria carotide comune, anestetizzare il topo con isoflurano anestesia per inalazione (2-4% isoflurano in ossigeno).
  2. Rimuovere i punti chirurgici, asetticamente preparare il sito e riaprire la ferita operatoria. Utilizzando smussato accesso dissezione, ri-guadagno per l'arteria carotide comune sinistra e separarla dal nervo vago e del tessuto connettivo adiacente.
  3. Preparare una miscela di 50 mg / ml in PBS Luciferin e il 25% Pluronic F-127 in PBS (1: 4 v / v) e memorizzarlo sul ghiaccio. Nota: Questa formulazione presenta come una soluzione viscosa a 4 ° C e si rivolge a gel a contatto con il tessuto a 37 ° C immediatamente.
  4. Applicare 200 ml di una miscela raffreddata Luciferin / Pluronic direttamente al segmento esposta della carotide comune e verificare gel solidità.
  5. Mettere l'animale in posizione supina nella camera di imaging dell'apparato IVIS-Spectrum e mantenere l'anestesia isoflurano con una maschera.
  6. Nel acquisitisulla finestra del pannello di controllo (Immagine vivente, versione 4.2 o superiore) scegliere la posizione "B" (6,6 centimetri telecamera di opporsi distanza) e binning factor "medio" dal menù a tendina intitolato "campo visivo" e di "binning", rispettivamente. Digitare "2,5 centimetri" nella casella altezza soggetto. Scegliere "min" come unità di tempo nella casella "tempo di esposizione", e scegliere un valore numerico di "2".
  7. Tre minuti dopo l'applicazione del / gel Pluronic Luciferin, avviare l'acquisizione dell'immagine facendo clic sul pulsante "Acquisisci" sullo schermo. NOTA: L'immagine tempo di acquisizione può variare da 1 a 6 min a seconda della potenza del segnale atteso.
  8. Dopo aver acquisito l'immagine, lavare il gel fuori con soluzione fisiologica e tamponare lo spazio periarterial con garza sterile e cotone applicatori.
  9. Chiudere la ferita con Vicryl sutura e fiocco la pelle.
  10. Recuperare l'animale e tornare alla sua gabbia. Ripetere l'imaging a seguito tpunti IME per studiare l'andamento temporale di espressione arteriosa causata da vettori Ad stent-immobilizzato.
  11. In alternativa, effettuare l'imaging a seguito di una somministrazione sistemica di luciferina. Anestetizzare e preparare l'animale come da 9.1-9.2. Cateterizzarla la vena della coda con un catetere di G 24 e il catetere sicuro con nastro adesivo chirurgico.
  12. Preparare una soluzione di luciferina in PBS (50 mg / ml) e iniettare 1 ml della soluzione attraverso il catetere in un intervallo di 10 secondi. Un minuto dopo l'iniezione avviare l'acquisizione dell'immagine come da 9,7-9,8. Nota: Una velocità di iniezione più veloce (<10 sec) può provocare l'attività di sequestro e arresto respiratorio. L'animale deve essere eutanasia se convulsioni o arresto respiratorio si verificano durante l'imaging.
  13. Seguire passo 9.10.

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Risultati

Esperimenti di vettore di uscita

Tethering di vettori adenovirali alla superficie degli impianti, compresi i dispositivi interventistici, come gli stent endovascolari, approssima il vettore al sito di malattia, in parte ovviando alla mancanza di mirati fisica vettori. Tuttavia, per poter ottenere effetti terapeutici attraverso la trasduzione del tessuto bersaglio, il vettore deve essere rilasciato dalla superficie (Figura 2). L'uso di idrolizzabili retic...

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Discussione

Il protocollo presentato descrive un metodo operativo per substrato mediata consegna genico ottenuto attraverso l'attaccamento reversibile di vettori adenovirali per senza cappotto superfici in acciaio inox. Mentre sviluppato per lo scopo specifico della terapia genica basata stent-di restenosi vascolare, questa tecnica ha applicazioni molto più ampie nei settori dei biomateriali, protesi biomedicali e la terapia genica.

Anche se gli studi presentati sono esclusivamente utilizzato ...

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Dichiarazioni

Lo sviluppo del protocollo e gli studi presentati in questo documento sono stati supportati in parte dalle sovvenzioni per lo sviluppo degli scienziati dell'American Heart Association (I.F. 0735110N e M.C. 10SDG4020003), dalla sovvenzione HL 72108 (R.J.L.) del National Heart, Lung, and Blood Institute degli Stati Uniti e dal National Heart, Lung, and Blood Institute T32 007915 (SPF). I cateteri per angioplastica sono stati gentilmente donati da NuMED (Hopkinton, NY). Gli autori desiderano ringraziare l'assistenza di segreteria della signora Susan Kerns.

Ringraziamenti

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da rivelare.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
316 dischi a rete in acciaio inossidabileElecton Microscopy SciencesE200-SS
Generico stent in acciaio inossidabile di grado 304personalizzatoLaserage
AdeGFPUniversità della Pennsylvania Vector CoreAD-5-PV0504
AdLucUniversity of Pennsylvania Vector CoreAD-5-PV1028
AdEMPTYUniversity of Pennsylvania Vector CoreA858
Cy3(NHS)2GE HealthcarePA23000
Sepharose 6BSigma-Aldrich6B100-500ML
Piastre UV a 96 pozzettiCostar3635
Fluorimetria Piastre a 96 pozzettiCostar3915
Piastre per colture cellulari a 96 pozzettiFalcon353072
Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP)Pierce Thermo Scientific20490
Ditiotreitolo (DTT)Pierce Thermo Scientific20290
sulfo-LC-SPDPPierce Thermo Scientific21650
SpettrofotometroMolecular Devices SpectraMax 190
SpettrofluorimetroDispositivi molecolariSpectraMax Gemini EM
Incubatore con agitatore orbitaleVWR1575R
Forno a flusso d'aria orizzontaleShel Lab1350 FM
Centra-CL2 centrifuga International Equipment Company426
Miscelatore digitale a vorticeFisher Thermo Scientific02-215-370
Eclipse TE300 microscopio a fluorescenzaNikon Telecamera CCD TE300
DC 500Sistema PCR inDC-500
7500Biosistemi applicatinon disponibile
Stazione di bioluminescenza dello spettro IVISPerkins-Elmernon disponibile
Sale dipotassico EDTASigma-AldrichED2P
Frazione di albumina sierica bovina V (BSA)Fisher Thermo ScientificBP1600-100
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Dumont pinzeFine Science Tools11255-20
A10 linea cellulareATCCCRL-1476
Cellule endoteliali dell'aorta bovinaLonzaBW-6002
Luciferina, sale di potassioGold BiotechnologyLUCK-1Ge
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
PBS senza calcio e magnesioGibco14190-136
Siero fetale bovinoGemini Bio-Products100-106
Soluzione di penicillina/streptomicinaGibco11540-122
DMEM, alto glucosioCellule Corninggro 10-013-CV
0,25% Tripsina/EDTAGibco25200-056
QIAamp Kit micro DNAQiagen56304
Power Sybr Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmpBiosystems applicataN8010560
Film adesivo ottico MicroAmpBiosystems applicati4360954
Cephazolin Apotexnon disponibile
Loxicom (Meloxicam)Norbrooknon disponibile
Eparina sodicaAPP Pharmaceuticalsnon disponibile
Ketavet (Ketamina)VEDCOnon disponibile
Anased (Xilazina) Lloidnon disponibile
Forano (isoflurano) Baxternon disponibile
Pinze curve per iride MoriaStrumenti per le scienze11370-31
Pinze curve per Graefe extrafiniStrumenti per le scienze Fine11152-10
Pinze Dumont #5Strumenti per le scienze Fini11252-20
Forbici a molla Vannas Forbici per lescienze fini15018-10
Forbici per le scienze fini - ToughCutFine Science Tools14058-09
Forbici chirurgicheFine Science Tools14101-14
Sutura Vicryl (5-0)EthiconJ385
Filo di sutura (seta 4/0) Fine Science Tools18020-40
Clip per sutura MichelFine Science Tools12040-02
Dilatatore per ferite (Lancaster eye speculum)KLS Martin34-149-07
Sterilizzatore a perline caldeFine Science Tools18000-45
Applicatore di clip per sutura MichelFine Science Tools112028-12
Insyte Autoguard 24 G IV catetereBeckton-Dickinson381412
2F Catetere FogartyEdwards Lifesciences120602F
Tubo in teflonVention041100BST
Catetere PTANuMedordine
Tamponi di garzaKendall Healthcare9024
Applicatori in cotoneSolon ManufacturingWOD1003
SiringaSaline Baxter281321
10 ml (Luer-Lok)Siringa Beckton-Dickinson309604
1 ml (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309628
Clippers con lama #40Oster 78005-314
Nastro chirurgico transporoso3MMM 15271
Puralube unguento veterinarioPharmadermnon disponibile
Ordine tempo reale Leica personalizzato

Riferimenti

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