Articolo metodologico

Generazione e Purificazione di umani INO80 rimodellamento della cromatina Complessi e Sottocomplessi

DOI:

10.3791/51720

⸱

23 ottobre 2014

 ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry & Molecular Biology, Kansas University Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive una procedura per la generazione e purificare wild type e mutanti versioni del complesso rimodellamento della cromatina INO80 umana. Epitopi tagged versioni di subunità INO80 sono stabilmente espressi in cellule HEK293 e complessi completi e complessi privi di specifici gruppi di subunità sono purificati mediante cromatografia di immunoaffinità.

Abstract

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INO80 complessi di rimodellamento della cromatina regolano le dinamiche nucleosoma e l'accessibilità del DNA catalizzando ATP-dipendente rimodellamento nucleosoma. Complessi INO80 umani sono composti da 14 subunità proteiche tra cui INO80, un SNF2-come ATPasi, che serve sia come la subunità catalitica e il patibolo per l'assemblaggio dei complessi. Funzioni delle altre subunità ei meccanismi attraverso i quali essi contribuiscono alla cromatina attività rimodellamento del complesso del INO80 rimangono poco conosciuti, in parte a causa della sfida di generare sottoinsiemi INO80 nelle cellule umane o sistemi di espressione eterologhi. Questo protocollo JOVE descrive una procedura che permette la purificazione di INO80 cromatina Sottocomplessi rimodellamento umani che mancano di una subunità o un sottoinsieme di subunità. N-terminale epitopo FLAG tagged INO80 cDNA vengono stabilmente introdotte nel rene embrionale umano (HEK) 293 linee cellulari con ricombinazione Flp-mediata. Nel caso in cui un sottoinsieme di subunità del complesso INO80 è abe cancellato, si esprime invece le proteine ​​mutanti INO80 che non hanno la piattaforma necessaria per il montaggio di queste subunità. Nel caso in cui un individuo subunità deve essere impoverito, uno transfects di targeting siRNA questa subunità in una linea cellulare HEK 293 che esprimono stabilmente FLAG taggati INO80 ATPasi. Estratti nucleari sono preparate, e FLAG immunoprecipitazione viene effettuata per arricchire frazioni proteiche contenenti derivati ​​INO80. Le composizioni di Sottocomplessi INO80 purificati possono poi essere analizzati utilizzando metodi quali immunoblotting, colorazione argento, e spettrometria di massa. I Sottocomplessi INO80 e INO80 generati in base a questo protocollo possono essere ulteriormente analizzati utilizzando vari saggi biochimici, che sono descritte nel protocollo JOVE accompagnamento. I metodi qui descritti possono essere adattati per lo studio delle proprietà strutturali e funzionali di ogni mammifero multi-subunità rimodellamento della cromatina e complessi modificano.

Introduzione

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Evolutivamente conservata di famiglia SNF2 complessi di rimodellamento della cromatina sono regolatori chiave di organizzazione della cromatina e l'accessibilità del DNA 1. Questi complessi di rimodellamento comprendono sempre una centrale SNF2-come ATPasi subunità, che, in alcuni casi, assembla con diverse proteine ​​accessorie e forma macro-molecolare assiemi multi-subunità. Per studiare i dettagli molecolari del processo di rimodellamento della cromatina ATP-dipendente, è importante comprendere i contributi di determinati sottoinsiemi di subunità e / o strutture di dominio per le attività dei complessi. Tali analisi richiedono la capacità di generar....

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Protocollo

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1 Generazione e Cultura HEK293 linee cellulari stabili che esprimono versioni mutate di FLAG Figura intera o epitopi-tagged INO80 o altre subunità INO80 Complex

  1. Clone cDNA codificante intera lunghezza o mutante umano INO80 ATPasi o un'altra subunità INO80 nel vettore di espressione di mammifero pcDNA5 / FRT con un morsetto N tag epitopo FLAG in-frame.
  2. Confermare la sequenza dei cDNA inserito dal sequenziamento del DNA prima di procedere.
  3. Per eseguire la trasfezione, crescere Flp-In cellule HEK293 in 10 centimetri piastre di coltura dei tessuti in un mezzo contenente DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), 5% glutammina, e il 10% FBS (sie....

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Risultati

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La figura 1 mostra un diagramma di flusso che riassume le procedure utilizzate per generare, purificarsi, e caratterizzare INO80 ATP-dipendenti complessi di rimodellamento della cromatina umani.

Secondo quanto illustrato nelle figure 2 e 3, tali procedure consentono la generazione di entrambe le tipo INO80 e INO80 Sottocomplessi selvatici che mancano varie subunità, consentendo così successive analisi biochimiche del contributo di tali subun.......

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Discussione

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Studi strutturali e funzionali di multi-subunità complessi di rimodellamento della cromatina mammiferi da eucarioti superiori sono stati ostacolati dalla difficoltà di preparare biochimicamente quantità utili di tali complessi contenenti subunità mutante o privi di alcune subunità del tutto. Ci sono una serie di ostacoli tecnici: In primo luogo, la manipolazione genetica in cellule di mammifero è stato tecnicamente impegnativo e richiede tempo. A differenza delle cellule di lievito, il cui genoma può essere facilmente m.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Lavoro in laboratorio degli autori è supportata da una sovvenzione da parte del National Institute of scienze mediche generali (GM41628) e da una sovvenzione all'Istituto Stowers per la ricerca medica da Helen Nelson Medical Research Fund presso la Greater Kansas City Community Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dulbecco's Modified Eagle Medium Cellgro10-013-CV
Glutamax-I (glutammina stabilizzata)Life Technologies35050-079
Siero fetale bovinoSAFC12176C
Reagente di trasfezione FuGENE6PromegaE2312
Igromicina B, sterile in PBSAG ScientificH-1012-PBS
pcDNA5/FRT vettorialeLife TechnologiesV6010-20
Flp-In HEK293 celluleLife TechnologiesR780-07
pOG44 Flp-Recombinasi Vettore di espressione LifeTechnologiesV600520
EZview Rosso ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaF2426
siero per vitelliSAFC12138C
TARGETplus Pool SMARTsiRNADharmacon / Thermo Scientificvari
5x tampone di risospensione siRNADharmacon / Thermo Scientific#B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAXLife Technologies13778
Opti-MEM Siero ridotto MediumLife Technologies51985-091
PBSCellgro45000VWR
TrypLE (tripsina)Life Technologies12604
1x FLAG PeptideSigmaF3290
Colonna per cromatografia Micro Bio-SpinBio-Rad737-5021
Dispositivo di filtro ultra centrifugo Amicon (50k MWCO)AmiconUFC805024Fisher Scientific
Colonne di desalinizzazione ZebaThermo Scientific89882
Anticorpo Anti-FLAG M2, topoSigmaF3165
Anticorpo Anti-FLAG M2, coniglioSigmaF7425
Inibitore della proteasi CocktailSigmaP8340
benzonasiNovagen70664<
Rotore JS-4.2 in una centrifuga J6Rotore Beckman-Coulter339080
JA-17Beckman-Coulter369691
tubi in policarbonato da 10 mlBeckman-Coulter355630
flaconi in policarbonato da 70 mlBeckman-Coulter355655
rotore tipo 45 TiBeckman-Coulter339160
rotore tipo 70.1 TiBeckman-Coulter342184
BD Clay Adams Nutator MixerBD Diagnostics15172-203VWR
Glas-Col Rotatore per provette/fialeGlas-Col099A RD4512
PCR termociclatore PTC 200MJ ResearchPTC 200
MembranaBellco biotechnology353348
Immobilon-FL 7 x 8,4MilliporeIPFL07810
provette per microcentrifuga lubrificate da 1,5 mlCostar3207
td colspan="4">Attrezzatura Incubatore per bottiglie a rulli di trasferimento

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
  2. Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-r....

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Complesso INO80Immunoprecipitazione FLAGPreparazione dell estratto nucleareDeplezione delle subunitAnalisi Western BlotColorazione all argentoCellule HEK 293Agarosio Anti FlagUltracentrifugazione

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