Saggi biochimici per le attività di analisi ATP-dipendente rimodellamento della cromatina Enzimi

Sommario

Qui descriviamo saggi biochimici che possono essere utilizzati per caratterizzare gli enzimi di rimodellamento della cromatina ATP-dipendenti per le loro capacità di 1) catalizzare lo scorrimento dei nucleosomi ATP-dipendente, 2) interagire con i substrati nucleosomici e 3) idrolizzare l'ATP in modo nucleosoma-dipendente o DNA-dipendente.

Abstract

I membri della famiglia SNF2 di ATPasi spesso funzionano come componenti di complessi di rimodellamento della cromatina multi-subunità che regolano la dinamica dei nucleosomi e l'accessibilità del DNA catalizzando il rimodellamento dei nucleosomi ATP-dipendente. La dissezione biochimica dei contributi delle singole subunità di tali complessi alla reazione di rimodellamento della cromatina ATP-dipendente richiede l'uso di saggi che monitorano la produzione di prodotti di reazione e misurano la formazione di intermedi di reazione. Questo protocollo JOVE descrive saggi che consentono di misurare le attività biochimiche di complessi o sottocomplessi di rimodellamento della cromatina contenenti varie combinazioni di subunità. Il rimodellamento della cromatina viene misurato utilizzando un saggio di scorrimento del nucleosoma ATP-dipendente, che monitora il movimento di un nucleosoma su una molecola di DNA utilizzando un metodo basato su un saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA). L'attività di legame dei nucleosomi viene misurata monitorando la formazione di mononucleosomi legati al complesso di rimodellamento utilizzando un metodo simile basato su EMSA, e l'attività dell'ATPasi DNA- o nucleosoma-dipendente viene analizzata utilizzando la cromatografia su strato sottile (TLC) per misurare il tasso di conversione dell'ATP in ADP e fosfato in presenza di DNA o nucleosomi. Utilizzando questi saggi, è possibile esaminare le funzioni delle subunità di un complesso di rimodellamento della cromatina confrontando le attività del complesso completo con quelle prive di una o più subunità. Il complesso di rimodellamento della cromatina umana INO80 viene utilizzato come esempio; Tuttavia, i metodi qui descritti possono essere adattati allo studio di altri complessi di rimodellamento della cromatina.

Introduzione

SNF2 complessi di rimodellamento della cromatina famiglia includono un centro SNF2-come ATPasi subunità ^1,2. Alcune funzioni ATPasi SNF2-come come enzimi singole subunità, mentre altri funzionano come la subunità catalitica di grandi complessi multi-subunità. Chiarire i meccanismi molecolari attraverso i quali ciascuna delle subunità dei complessi di rimodellamento della cromatina contribuiscono alla loro attività richiede la capacità di effettuare saggi biochimici che sezionano il processo di rimodellamento.

ATP-dipendente rimodellamento dei nucleosomi dal complesso INO80 umano e di altri enzimi rimodellamento della cromatina ....

Protocollo

1 ATP-dipendenti nucleosoma ritocca saggi

Per misurare ATP-dipendente attività nucleosoma rimodellamento, immunopurified INO80 o Sottocomplessi INO80 vengono incubati con ATP e un substrato mononucleosomal, che contiene un singolo nucleosoma posizionato ad una estremità di un frammento di DNA di 216 bp, ³² P-marcato. I prodotti di reazione vengono quindi sottoposti ad elettroforesi in gel di poli-acrilammide native.

1. Per generare il P-marcato, '601' frammento di DNA ^32, amplificare da pGEM-3Z-601 ⁴ un frammento di DNA 216 bp contenente un 601 nucleosoma sequenza di posizionamento finale i....

Risultati

Le figure mostrano risultati rappresentativi di saggi biochimici utilizzati per caratterizzare attività INO80, tra cui nucleosoma scorrevole (figura 1) e vincolante (Figura 2) saggi e DNA o saggi ATPasi nucleosoma-dipendente (Figura 3).

L'esperimento mostrato in Figura 1 confronta la capacità di complessi INO80 intatti purificato attraverso FLAG-Ies2 o FLAG-INO80E e INO80 Sottocomplessi purificato attraverso sia FLAG-Ino80ΔN.......

Discussione

Per garantire che il rimodellamento dei nucleosomi e le attività ATPasi che osserviamo nei test dipendono l'attività catalitica di complessi INO80, e non sulla contaminazione di rimodellamento e / o enzimi ATPasi, abbiamo nucleosomi regolarmente test rimodellamento e l'attività ATPasica di versioni cataliticamente inattive di complessi INO80, purificata in parallelo con wild type INO80 utilizzando la stessa procedura. Una reazione di controllo negativo manca ATP dovrebbe essere eseguita quando saggiando l'at.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cocktail di inibitori della proteasi Sigma		P8340
10x tampone di reazione PCR	Roche Scienze Applicate
Roche Taq DNA polimerasi	Roche Scienza applicata
Colonne di spin NucAway senza nucleasi	Ambion	Cat. # AM10070
ATP ultrapuro	USB/Affymetrix	77241 25 UM
albumina sierica bovina	Sigma	A9418
40% Acrilammide/Bis 37,5:1	Amresco	0254-500ML
DNA di sperma di salmone sonicato	GE Healthcare	27-4565-01
10% persolfato di ammonio (APS)	Thermo Scientific	17874
benzonasi	Novagen	Cat. No. 70664
dCTP, [α-32P]- 6.000 Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
PCR termociclatore PTC 200	MJ Research	PTC 200
Hoefer unità di elettroforesi verticale Hoefer		SE600X-15-1,5
provette per microcentrifuga lubrificate da 1,5 ml	Costar	3207
Schermo al fosforo di stoccaggio	Molecular Dynamics	63-0034-79
3MM carta da filtro	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon PhosphorImager	Software GE Healthcare	8600
ImageQuant	TLC GE Healthcare	ver2003.02
PEI-Cellulosa F	Millipore	5725-7
Membrana di trasferimento Immobilon-FL 7 x 8,4	Millipore	IPFL07810
Misuratore di rilevamento per uso generale con finestra terminale o pancake Sonda GM (Geiger-Mueller)	Biodex	Modello 14C