Summary
Fluorescently लेबल कोशिकाओं के मल्टिप्लेक्स छवि आधारित विश्लेषण को सक्षम करने के लिए एक लचीला सूचना विज्ञान कार्यप्रवाह है प्रस्तुत किया। कार्यप्रवाह परमाणु और cytoplasmic मार्करों quantifies और इन डिब्बों के बीच मार्कर स्थानान्तरण गणना करता है। प्रक्रियाएं 96 अच्छी तरह स्वरूपों में अप्रत्यक्ष immunofluorescence द्वारा मार्कर का पता लगाने के लिए siRNA और विश्वसनीय पद्धति का उपयोग कोशिकाओं की गड़बड़ी के लिए प्रदान की जाती हैं।
Abstract
पक्षपाती स्तनधारी टिशू कल्चर मॉडल में कोशिकाओं के व्यवहार को नियंत्रित करने वाले नियंत्रण तंत्र को समझने के क्षेत्र में अग्रिम एकल कोशिका विश्लेषण के तरीके पर निर्भर होते जा रहे हैं। सेल आबादी से बायोमार्कर का मतलब मूल्यों को दर्शाती समग्र डेटा देने के जो तरीके का अध्ययन जैविक प्रणाली की विविधता को प्रतिबिंबित कि उप-जनसंख्या गतिशीलता खोने का खतरा। इस के साथ रखने में, पारंपरिक तरीकों से प्रतिस्थापित किया जा रहा है, या उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए विकसित सेलुलर परख की है, और अधिक परिष्कृत रूपों के साथ समर्थन किया। ये assays संभावित मालिकाना सॉफ्टवेयर संकुल के साथ द्वारा सक्षम है, जो फ्लोरोसेंट बायोमार्कर, की छवियों की बड़ी संख्या को उत्पन्न, सेल प्रति बहु पैरामीट्रिक मापन के लिए अनुमति देता है। हालांकि, अपेक्षाकृत उच्च पूंजी लागत और इन उपकरणों में से कई की overspecialization कई जांचकर्ताओं के लिए उनकी पहुंच को रोका है।
यहाँ वर्णित एक हैसबसे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से छवियों के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त व्यक्ति की कोशिकाओं के विशिष्ट subcellular क्षेत्रों से कई फ्लोरोसेंट मार्कर तीव्रता की मात्रा का ठहराव के लिए सार्वभौमिक रूप से लागू कार्यप्रवाह। इस कार्यप्रवाह की कुंजी प्रतिदीप्ति मार्कर तीव्रता इन छवियों में व्यक्ति की कोशिकाओं, परिभाषित subcellular क्षेत्रों में खंड उन्हें भेद और वितरित करने के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर एक के कार्यान्वयन के इन क्षेत्रों के लिए विशिष्ट मूल्यों है। छवि डेटा से अलग-अलग सेल तीव्रता मूल्यों की निकासी इस कार्यप्रवाह का केंद्रीय उद्देश्य है और अनुयायी मानव कोशिकाओं में G1 चौकी नियामकों के लिए एक siRNA स्क्रीन से नियंत्रण आंकड़ों के विश्लेषण के साथ सचित्र किया जाएगा। हालांकि, यहां प्रस्तुत कार्यप्रवाह सेल गड़बड़ी के अन्य साधन से डेटा का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, यौगिक स्क्रीन) इस प्रकार और प्रतिदीप्ति आधारित सेलुलर मार्करों के अन्य रूपों और प्रयोगशालाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी होना चाहिए।
Introduction
यहाँ प्रस्तुत काम व्यक्ति की कोशिकाओं और परिभाषित subcellular क्षेत्रों की पहचान करने के लिए पक्षपाती कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों के एल्गोरिथ्म निर्देशित टूटने प्रदर्शन करने के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर सेल प्रोफाइलर के उपयोग का वर्णन है। छवि विभाजन के रूप में संदर्भित यह दृष्टिकोण, प्रत्येक कोशिका या (के रूप में खंडित वस्तुओं के लिए कहा गया है) subcellular क्षेत्र के लिए स्थानीय fluorescently लेबल मार्करों बढ़ाता ने उतारी कोशिकाओं के बाद बहु पैरामीट्रिक विश्लेषण की अनुमति देता है। इस कार्यप्रवाह उच्च सामग्री विश्लेषण को सक्षम करने के लिए एक आधार का गठन किया है और आगे विकसित और मल्टी पैरामीट्रिक के अनुरूप संशोधित, अलग-अलग सेल विशेष उच्च सामग्री यंत्र या मालिकाना सॉफ्टवेयर के उपयोग के बिना प्रयोगशालाओं में विश्लेषण करती जा सकता है कि एक उपकरण के रूप में सेवा करने का इरादा है। इस पांडुलिपि के साथ आपूर्ति की फाइलों में वर्णित विश्लेषण उत्पन्न करने के लिए प्रासंगिक कच्चे छवि डेटा, एल्गोरिथ्म सेटिंग और समर्थन लिपियों के एक परीक्षण सेट शामिल हैं। प्रदान की एल्गोरिथ्म सेटिंग्स चया सेल प्रोफाइलर निर्धारित उदाहरण डेटा और समायोजन अन्य अध्ययनों से छवि डेटा के उपयोग को सक्षम करने के लिए आवश्यक हो सकता है क्या चर्चा अनुभाग विवरण के लिए अनुकूलित कर रहे हैं।
मात्रात्मक डेटा सेल Profiler का उपयोग निकाला गया है एक बार, अलग प्रयोगशालाओं कच्चे डेटा में अलग-अलग सेल मूल्यों द्वारा प्रस्तुत जानकारी का उपयोग कैसे के लिए विभिन्न आवश्यकताओं को हो सकता; यहाँ दिखाया फाटकों प्रत्येक परख के लिए कच्चे डेटा को लागू कर रहे हैं जिसके द्वारा एक दृष्टिकोण है। इन फाटकों का उपयोग, डेटा गेट्स द्वारा परिभाषित प्रतिक्रिया के दौर से गुजर कोशिकाओं के उप-जनसंख्या के साथ अलग उपचार जोड़ने के रुझान के दृश्य की अनुमति, प्रतिक्रिया के द्विआधारी शर्तों के रूप में तब्दील कर रहे हैं। फाटकों प्रत्येक प्रासंगिक माप के लिए उपयुक्त नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के लिए प्राप्त आंकड़ों वितरण की टिप्पणियों के आधार पर स्थापित कर रहे हैं। फाटक के उपयोग के कच्चे, सेल आधारित माप का प्रबंधन करने के लिए कैसे की सिर्फ एक उदाहरण है। इसके अलावा यहां दिखाए गए परमाणु डीएनए तीव्रता का इस्तेमाल होता है मुझेgated डेटा के साथ संयोजन में मूल्यों का एक निरंतर रेंज के रूप में अपने कच्चे रूप में asurements। छवि विश्लेषण डेटा के प्रबंधन के दृष्टिकोण के लिए अन्य अध्ययन की प्रकृति पर निर्भर करता है, विचार किया जाना चाहिए; उप-जनसंख्या कोशिकाओं बताए के लिए फाटकों का उपयोग करने के लिए सांख्यिकीय विकल्प मापदंडों की बड़ी संख्या तीन सूचित किया गया है भर में उच्च सामग्री डेटा संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए रणनीति के 2 और व्यवस्थित तुलना सूचित किया गया है।
6 - छवि डेटा की उच्च सामग्री का विश्लेषण दवा-प्रतिक्रिया के सेलुलर पढ़ाई में उपयोग मिल गया है, आनुवंशिकी और 4 संकेत पर्यावरण के तनाव को उल्टा। उच्च सामग्री विश्लेषण की योग्यता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी डेटा की एल्गोरिथम विश्लेषण मात्रात्मक और स्थानिक मापदंडों व्यक्ति की कोशिकाओं 7 भर में एक साथ विचार किया जा करने की अनुमति देता है कि इस तथ्य से उपजा है। इस तरह, कई assays के लिए सेलुलर परिणामों परख-डी के पार संदर्भित, अंतर व्यवहार किया जा सकता हैefined सेल उप-जनसंख्या रूपात्मक चर के विचार शामिल कर सकते हैं प्रयोगात्मक शर्तों और assays के भीतर लगाया जा सकता है। रणनीतियों और विश्लेषण कार्यप्रवाह अन्य उच्च सामग्री के दृष्टिकोण के रूप में, व्यक्ति की कोशिकाओं को पार संदर्भित कर रहे हैं कि मल्टिप्लेक्स डेटा देने में सक्षम हैं, यहाँ पर चर्चा की। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप छवियों पैदा करते हैं और छवियों के हजारों के माध्यम से कम throughput के पारंपरिक प्रतिदीप्ति आधारित माइक्रोस्कोपी में उत्पादित छवियों के दसियों से लेकर डेटा का विश्लेषण करने के लिए लागू कर रहे हैं कि उच्च सामग्री के तरीकों सूट पढ़ाई स्वचालित उच्च सामग्री स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों का उपयोग कर उत्पादन किया।
कार्यप्रवाह अलग assays के परमाणु फ्लोरोसेंट मार्कर तीव्रता या क्रमशः एक फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रोटीन के परमाणु / साइटोप्लास्मिक स्थानान्तरण, या तो के संदर्भ में मापा जाता है, जिसमें से उदाहरण डेटा के साथ यहाँ सचित्र है। कार्यप्रवाह इन assays अलग से विचार या संयोजन में पूर्वी वायु कमान के आधार पर किया जा सकता है कि में लचीला हैएच अलग जांचकर्ताओं द्वारा अनुसंधान प्रश्न दिए गए। उदाहरण डेटा एक शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) प्रयोग (चित्रा 1) के हिस्से के रूप में उत्पादित कर रहे हैं। छोटे दखल शाही सेना oligonucleotides (siRNA) cyclin निर्भर काइनेज (CDK) गतिविधि के दो फ्लोरोसेंट पत्रकारों के लिए परिवर्तन में जो परिणाम HCT116 मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा कोशिकाओं में विशिष्ट प्रोटीन पछाड़ना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। सेरीन में परमाणु रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन 780 (पी-S780 RB1) की CDK6 निर्भर फास्फारिलीकरण एंटीबॉडी धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया है। एक ही कोशिकाओं में, CDK2 गतिविधि (GFP-CDK2 संवाददाता) की एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग संवाददाता CDK2 गतिविधि के अभाव में संवाददाता cytoplasm में नाभिक में और CDK2 सक्रियण शटल पर रहता है जहां cytoplasmic अनुपात करने के लिए अपने परमाणु द्वारा मूल्यांकन किया है 8। इसके अलावा, प्रत्येक कोशिका के परमाणु डीएनए एक डीएनए intercalating डाई का उपयोग दाग है, छवियों में नाभिक सीमाओं कोशिकाओं की पहचान और परिभाषित करने के लिए एक साधन के रूप में कार्य करता है जो Bisbenzimide, के रूप में अच्छी तरह से एकडीएनए बहुतायत सेल का सेल चक्र स्थिति के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने के (चित्रा 2) के सा उपाय है।
CDK6 और CDK2 की गतिविधियों सेल चक्र 5 एस चरण के लिए G1 के से कोशिकाओं को पारगमन के रूप में पहचाने जाने हैं और इस तरह, व्यक्ति की कोशिकाओं में दो पत्रकारों के बीच करीब क़बूल की उम्मीद है, के रूप में एक दूसरे को 9,10 सफल और। यहां इस्तेमाल किया प्रदर्शन डाटासेट siRNA के प्रभाव CDK6, रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (RB1) और एक गैर-लक्ष्य नकारात्मक नियंत्रण (तालिका 1) लक्ष्य एक उदाहरण के रूप में विश्लेषण करती है। CDK6 की पछाड़ना पी-S780 RB1 मिलान की कमी आई और सेल चक्र के G1 के चरण में कोशिकाओं का एक संग्रह दोनों को प्रकाश में लाना चाहिए। RB1 पछाड़ना phospho-S780 एंटीबॉडी की विशिष्टता के लिए एक अभिकर्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। Formalin से प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी छवियों fluorescently दाग HCT116 टिशू कल्चर कोशिकाओं एल्गोरिथम छवि विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, 11 तय की। जिसके परिणामस्वरूप संख्यात्मक डेटा तो करने के लिए प्रयोग किया जाता हैपार के संदर्भ पत्रकारों और विभिन्न पछाड़ना राज्यों के प्रभाव गेज।
विश्लेषण के इस प्रकार के द्वारा उत्पादित डेटा के संभावित आकार सामान्य विश्लेषण उपकरणों के लिए एक चुनौती पेश कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, अलग-अलग सेल डेटा कुछ स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर को समायोजित करेगा से भी बड़ा हो सकता है। बड़े डेटासेट के विश्लेषण में सहायता करने के लिए डेटा का सरल, उच्च दोहराव, देखरेख के प्रसंस्करण प्रदर्शन जो पर्ल स्क्रिप्ट शामिल हैं। पर्ल स्क्रिप्ट एक विशिष्ट फ़ाइल नेमिंग कन्वेंशन (चित्रा 3) के साथ छवि फ़ाइलें प्रसंस्करण जब सेल प्रोफाइलर, द्वारा उत्पादित उत्पादन फ़ाइलों के लिए विशेष रूप से लिखा है, और विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा प्रति अच्छी तरह से खेतों की चर संख्या के लिए अनुमति देते हैं। यह सेल उप-जनसंख्या 5 में प्रवृत्तियों को ट्रैक करने के लिए गेट व्यक्तिगत सेल परख डेटा को अक्सर महत्वपूर्ण है और यहाँ दिखाया प्रत्येक परख प्रकार के लिए पूर्व निर्धारित एक सेट गेट के आधार पर प्रत्येक कोशिका ध्वज को एक पर्ल स्क्रिप्ट का इस्तेमाल होता है। इसके अलावा शामिल वैकल्पिक पर्ल स्क्रिप्ट कर रहे हैंजो व्यक्ति कुओं (या शर्तों) के लिए डेटा परिणाम को संक्षेप में, वितरित: सेट गेट के भीतर कोशिकाओं और कच्चे परख स्कोर का मतलब मूल्यों का प्रतिशत। प्रतिक्रियाओं सभी या एक अच्छी तरह से भीतर कोशिकाओं के बहुमत को प्रभावित जहां डेटा को देखने के बाद, अधिक सजातीय तरह से वैध है। ऊपर चर्चा के रूप में, इस तरह के मूल्यांकन प्रतिक्रिया आबादी के भीतर कोशिकाओं के एक सबसेट तक ही सीमित है, जहां अलग-अलग सेल डेटा gating के द्वारा afforded कि कम से कम उपयोगी है।
वर्णित कार्यप्रवाह की उपयोगिता siRNA या वर्णित मार्कर assays के द्वारा गड़बड़ी करने के लिए सीमित नहीं है। अध्ययन siRNA के संयोजन, रासायनिक inhibitors और विकिरण उपचार का उपयोग कर टिशू कल्चर प्रयोगों में और CDK6 के अलावा अन्य मार्करों और CDK2 गतिविधि 5 के आकलन के लिए प्रतिक्रियाओं परख के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है।
धारणा, प्रयोगात्मक रणनीति जैविक रूप से उपयोगी subcellular क्षेत्रों की एक किस्म के लिए स्वचालित रूप से पंजीकृत होने के लिए अनुमति देता हैफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप छवियों में मौजूद व्यक्ति की कोशिकाओं में। जैसे, इस दृष्टिकोण आबादी के बजाय व्यक्ति की कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित है कि तकनीक के माध्यम से याद किया जा सकता है कि मात्रात्मक, मल्टिप्लेक्स डेटा खुलासा जैविक जानकारी प्राप्ति कर सकते हैं। मामूली संशोधनों के साथ वर्णित दृष्टिकोण और विश्लेषण कार्यप्रवाह किसी भी प्रतिदीप्ति आधारित परख outputs और सेल जैविक प्रतिक्रियाओं के लिए मात्रात्मक, अलग-अलग सेल डेटा उपज कर सकते हैं जहां डीएनए सामग्री की मात्रात्मक आकलन, परमाणु या cytoplasmic प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव या इन दोनों के बीच मार्करों के चक्कर दो डिब्बों या तो व्यक्तिगत रूप से या एक मल्टिप्लेक्स ढंग से ब्याज की है। प्रकाशन की आवश्यकताओं को तेजी से इस तरह प्रकाशित डेटा reanalyze के लिए देख प्रयोगशालाओं के लिए भी प्रत्यक्ष ब्याज की हो जाएगा यहाँ वर्णित उन के रूप में खुले तौर पर सुलभ कच्चे आंकड़ों के उपयोग और माइक्रोस्कोपी छवि विश्लेषण के लिए नि: शुल्क उपकरण के साथ परिचय प्रस्तुत करने की दिशा में करते हैं।
Protocol
रिस्पांस मार्करों के लिए 1. प्रायोगिक Perturbation और सेल लेबलिंग (रिवर्स अभिकर्मक siRNA स्क्रीन)
- एक बाँझ टिशू कल्चर हुड पिपेट में एक बाँझ, सादा 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में 1x siRNA के बफर में 200 एनएम siRNA के 70 μl। सीरम मुक्त DMEM मीडिया के 40 खंडों में अभिकर्मक लिपिड पतला और प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त siRNA में 105 μl बांटना।
नोट: सीरम मुक्त DMEM के 10.5 मिलीलीटर में 262.5 μl लिपिड गिराए प्रति अच्छी तरह से लिपिड की 2.6 μl पहुंचाने siRNA के एक पूरे 96 अच्छी तरह से थाली के लिए उपयुक्त एक मास्टर मिश्रण पैदावार। इस चरण में 200 एनएम siRNA शुरू करने एकाग्रता का प्रयोग 1.3 चरण में 20 एनएम के एक काम एकाग्रता वितरित कर देगा, लेकिन प्रक्रियाओं के अनुसार समायोजित शुरू करने एकाग्रता (यानी 50 एनएम) के साथ, 5 एनएम के लिए नीचे सांद्रता काम करने के लिए काम करेंगे। वे पर लक्ष्य प्रतिक्रिया की भयावहता को कम कर सकते हैं, हालांकि निचले काम कर रहे एकाग्रता पर targe की वृद्धि करने के लिए अग्रणी, बंद लक्ष्य झूठी सकारात्मक स्कोर को कम कर सकते हैंझूठी नकारात्मक दरों टी। - कमरे के तापमान पर दस मिनट के लिए कोमल कंपन से थाली मिलाएं। तीन 50 μl में जिसके परिणामस्वरूप 175 μl उप-विभाजित एक पारदर्शी आधार के साथ 96 अच्छी तरह से थाली में इलाज एक अपारदर्शी, टिशू कल्चर पर लक्ष्य प्रति replicates।
- 50 μl लिपिड siRNA के परिसरों पर सीधे 10% सीरम युक्त 150 μl DMEM में अच्छी तरह से प्रति 8000 कोशिकाओं का वितरण द्वारा उल्टा transfect। इस्तेमाल की HCT116 मानव कोलोरेक्टल कोशिकाओं stably CDK2 गतिविधि 5,8 रिपोर्टिंग एक GFP टैग मार्कर व्यक्त। आगे कोई मिश्रण आवश्यक है। आर्द्रता नियंत्रण और प्लेट 'किनारे-प्रभाव' को रोकने के लिए और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर एक humidified इनक्यूबेटर में थाली जगह के लिए एक बाँझ, चिपकने वाला सांस झिल्ली के साथ थाली सील।
- मीडिया के एक छोटे से अवशिष्ट राशि कुओं में रहता है कि मीडिया में इस तरह के aspirate। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 4% बफर formaldehyde के 100 μl जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें और कमरे में टी पर 10 मिनट के लिए एक धूआं हुड में सेतेemperature।
- थाली aspirating द्वारा फिक्सिंग समाधान निकालें। या तो इस बिंदु पर थाली तो 100 μl फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और के साथ तीन बार धोने से प्रयोग बंद एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में पीबीएस के 100 μl के तहत, सील, या के साथ आगे बढ़ना दुकान कोशिकाओं के permeabilization के।
नोट: हम निर्धारण के बाद जितनी जल्दी हो सके प्रसंस्करण प्लेटों की सलाह देते हैं, और आम तौर पर पूरी तरह से संसाधित प्लेटों के भंडारण पसंद करते हैं। ऐसे थिमेरोसाल, सोडियम azide, या वाणिज्यिक विकल्प के रूप में biocidal संरक्षक micoroganismal वृद्धि को रोकने के लिए जोड़ा जा सकता है। फॉस्फेट inhibitors के अलावा phospho-epitopes को संरक्षित करने में मदद करता है, और अन्य साधनों प्रासंगिक परख संदर्भों में उपयोगी हो सकता है प्रोटीन संशोधन राज्यों को संरक्षित करने के लिए - थाली से पीबीएस निकालें और permeabilization के समाधान के 100 μl जोड़कर कोशिकाओं permeabilize। मिलाते हुए बिना कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। एक multich का उपयोग कर permeabilization के समाधान Aspirateannel पिपेट। इस चरण में तीन बार दोहराएँ।
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति 100 μl ब्लॉक समाधान जोड़कर कोशिकाओं को अवरुद्ध करें। फिर कमरे के तापमान पर अंधेरे में 2 घंटे के लिए ब्लॉक समाधान में 500 गुना पतला विरोधी पी-S780 RB1 एंटीबॉडी के 50 μl के साथ जांच, थाली aspirating द्वारा ब्लॉक समाधान निकालें।
- 5 मिनट के लिए हर बार की थाली पर समाधान छोड़ने, 100 μl प्लेट धोने के समाधान के साथ थाली तीन बार धोएं। क्रोमेटिन विशिष्ट डीएनए डाई Bisbenzimide के 2 माइक्रोन के साथ पूरक ब्लॉक समाधान में 50 μl fluorescently टैग माध्यमिक एंटीबॉडी पतला 1000 गुना से 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर अंधेरे में थाली जांच। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 100 μl पीबीएस के तहत पहले और दुकान सील के रूप में थाली तीन बार धोएं। छवि दो सप्ताह के भीतर थाली।
2. इमेजिंग और छवि विभाजन
- अलग लेने के लिए एक 20x उद्देश्य के साथ एक confocal या कताई डिस्क प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग 16-bit, डीएनए डाई, GFP और इम्युनो-धुंधला fluorophores के लिए इसी तीन चैनलों में greyscale झगड़ा छवियों। गैर अतिव्यापी छवि सेट बहुत से, अच्छी तरह से प्रति छवि के लिए, फ्रेम के रूप में करने के लिए यहाँ लगभग 1,000-2,000 कोशिकाओं संदर्भित कब्जा है।
- प्रत्येक फ़ाइल नाम 'प्रयोग का नाम', 'अच्छी तरह से पता', इस क्रम में 'फ्रेम संख्या' और 'चैनल पहचानकर्ता', (चित्रा 3) की एक अद्वितीय संयोजन है कि इतने व्यवस्थित ढंग से छवि फ़ाइलों को नाम दें। उदाहरण के डेटा सेट "ब्लू" (क्रोमेटिन डीएनए धुंधला) या "ग्रीन" (GFP) या "लाल" चैनल पहचानकर्ता के रूप में (इम्युनो से सना हुआ फ्लोरोफोरे) का उपयोग करता है। अच्छी तरह से पता है, फ्रेम संख्या और चैनल पहचानकर्ता आगे पर छवि मेटाडाटा के रूप में करने के लिए भेजा जाता है। भ्रामक अच्छी तरह से और फ्रेम मेटाडाटा से बचने के लिए अंडरस्कोर प्रतीक का उपयोग करें।
- निर्दिष्ट क्रम में इन मेटाडाटा तत्वों के साथ फाइल का नाम। यह बाद में सॉफ्टवेयर चरणों corre है कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैविश्लेषण के लिए छवियों के ctly समूह सेट।
- फ्रीवेयर सेल प्रोफाइलर डाउनलोड और स्थापित करें, सक्रिय पर्ल समुदाय संस्करण, आर सांख्यिकीय प्रोग्रामिंग वातावरण और RStudio। स्थापना के दौरान सभी डिफ़ॉल्ट विकल्प स्वीकार करते हैं; सक्रिय पर्ल स्थापित करने पीसी उपयोगकर्ताओं के लिए प्रेरित किया, जहां पथ, फ़ाइल एक्सटेंशन एसोसिएशन और स्क्रिप्ट मैपिंग से संबंधित सभी विकल्पों को लागू करना चाहिए। सक्रिय पर्ल मैक उपयोगकर्ताओं के लिए वैकल्पिक है, लेकिन वे अन्यथा टर्मिनल कमांड लाइन से 3.2 कदम के बजाय आइकन को क्लिक का उपयोग करने में पर्ल स्क्रिप्ट चलाने की आवश्यकता होगी।
- 'फ़ाइल से' 'फ़ाइल' तो, 'आयात पाइपलाइन' पर क्लिक करें, सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर खोलें और फ़ाइल 3_channels_pipeline.cppipe (आंकड़े S1A और S1B) का चयन करें। फ़ाइल वर्णित फ़ाइल नाम सम्मेलन से छवि फ़ाइल मेटाडाटा व्याख्या करने के लिए सॉफ्टवेयर के लिए आवश्यक निर्देश शामिल हैं। सेल प्रोफाइलर अब वें से परमाणु डीएनए और एंटीबॉडी तीव्रता के अर्क, छवियों संबंधितese और प्रत्येक कक्ष के लिए पता लगाया (आंकड़े 4 और 5) कोशिका द्रव्य तीव्रता बनाम परमाणु के अनुपात की गणना के लिए GFP चैनल का उपयोग करता है।
- सेल प्रोफाइलर विंडो के निचले बाएँ कोने में बटन 'देखें उत्पादन सेटिंग्स' पर क्लिक करें। नए स्क्रीन के शीर्ष पर 'डिफ़ॉल्ट इनपुट फ़ोल्डर' और 'डिफ़ॉल्ट उत्पादन फ़ोल्डर' लेबल पाठ बक्से रहे हैं। एक समय में, इन बक्सों के अधिकार के लिए फ़ोल्डर माउस को क्लिक करें और (S1C चित्रा) क्रमशः निकाले डेटा, के लिए विश्लेषण के लिए छवि फ़ाइलों का स्थान और गंतव्य का चयन करें।
- सेल प्रोफाइलर के निचले बाएँ कोने में 'विश्लेषण छवियां' बटन दबाकर छवि विश्लेषण शुरू। स्क्रीन के नीचे पर डेटा निष्कर्षण, 'बंद करो विश्लेषण' और 'रोकें' बटन के लिए शेष समय का पालन। यदि आवश्यक हो उपयोगी है, जो किसी भी समय, पर 'रोकें' बटन का चयन करके विश्लेषण थामनेछवियों को देख विश्लेषण किया जा रहा है जब (2.8 कदम में वर्णित)।
- वैकल्पिक रूप से, कार्यक्रम खिड़की (चित्रा S1D) की बाईं चरम पर पैनल में आंख माउस को क्लिक करके छवि विश्लेषण के किसी भी कदम के लिए खिड़कियां खुली। सेल Profiler में वर्तमान सेटिंग्स छवि विभाजन उपयुक्त हैं प्रदर्शन (इन सेटिंग्स को संशोधित करने के बारे में सलाह के लिए चित्रा 1 और चर्चा देखें) करने के लिए है कि जांच करने के लिए 'IdentifyPrimaryObjects' विंडो 'और' माध्यमिक 'और' तृतीयक वस्तुओं 'के लिए उन लोगों को ध्यान से देखें।
- विश्लेषण पूरा हो गया है जब प्रकट होता है कि संदेश बॉक्स में 'ठीक' पर क्लिक करें। परिणाम के साथ सभी डेटा फ़ाइलों को अल्पविराम से अलग-मूल्य (.csv) फ़ाइलें (चित्रा S2A) के रूप में सहेज कर रहे हैं जहां स्थान 'डिफ़ॉल्ट उत्पादन फ़ोल्डर' करने के लिए जाओ।
3. डेटा निष्कर्षण
- बीच में शामिल किया जाता है जो नई फ़ाइल 'Nuclei.csv', का पता लगाएंसेल प्रोफाइलर से उत्पादन। इस फ़ाइल में फ्लोरोसेंट परमाणु एंटीबॉडी तीव्रता, परमाणु डीएनए तीव्रता और GFP-CDK2 संवाददाता अनुपात मूल्यों (आंकड़े 6A और S2A) के लिए अलग-अलग सेल डेटा शामिल हैं।
नोट: विभिन्न प्रयोगशालाओं के लिए अपने स्वयं assays के स्वभाव के अनुरूप करने के लिए डेटा की इस प्रकार की प्रक्रिया करने के लिए चाहते हो जाएगा। एंटीबॉडी डेटा प्रदान की और पर्ल स्क्रिप्ट '2_gate_classifier.pl' का उपयोग GFP-CDK2 संवाददाता मूल्यों के अनुसार प्रत्येक उपचार हालत से कोशिकाओं के gating के मौजूदा डेटा के लिए है का सुझाव दिया। - 'Nuclei.csv' डाटा फाइल (चित्रा S2A) के रूप में एक ही फ़ोल्डर में प्रदान की पर्ल स्क्रिप्ट फ़ाइल '2_gate_classifier.pl' की नकल। डबल-क्लिक करें पर्ल स्क्रिप्ट के लिए चिह्न और, जब प्रेरित, कोशिकाओं एंटीबॉडी के लिए अंत में गेट मूल्यों gated और जा रहे हैं जिसमें फ़ाइल के लिए एक '.csv' फ़ाइल नाम नाम से पीछा डेटा फ़ाइल का पूरा नाम टाइप करेंप्रतिदीप्ति और GFP-CDK2 संवाददाता डेटा।
नोट: मुख्य गेट सेटिंग्स का निर्धारण और आंकड़ों के विश्लेषण के लिए इन लागू करने के लिए कैसे प्रतिनिधि डेटा अनुभाग और चित्रा 6 में नीचे चर्चा कर रहे हैं (डेटा उपलब्ध कराई उपयोग '.004' और क्रमशः '1.5', विश्लेषण करने के लिए)। मैक उपयोगकर्ताओं टाइपिंग द्वारा टर्मिनल कमांड लाइन से पर्ल स्क्रिप्ट चलाना चाहिए: 'पर्ल 2_gate_classifier.pl'। - हर अच्छी तरह से प्रत्येक कोशिका दोनों फाटकों (चित्रा 6C) के खिलाफ प्रदर्शन करती है कि शो कैसे उप जनसंख्या लेबल के साथ मूल सेल प्रोफाइलर डेटा से कच्चे व्यक्तिगत सेल परख मूल्यों को जोड़ती है जो नव निर्मित फाइल का निरीक्षण करें।
- RStudio सॉफ्टवेयर खोलने के द्वारा अलग-अलग सेल उप-जनसंख्या लेबल का उपयोग कर प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए डेटा प्लॉट। , 'फ़ाइल' और 'ओपन फाइल' पर क्लिक करें तो उपलब्ध कराई 'analysis.r' फ़ाइल का चयन करें। आंकड़े 6B साजिश करने के आदेशों को ध्यान से देखें,
(चित्रा S2B) के ऊपरी बाएँ विंडो में टुनिशिया> 7 और 8। ऊपरी बाएँ विंडो में, लाइनों 5 और 6 पर दोहरे उद्धरण प्रतीकों के बीच, gated डेटा वाले फ़ोल्डर का कंप्यूटर पता टाइप करें। (": / विश्लेषण फोल्डर / विश्लेषण उत्पादन सी 'और' nuclei_gated.csv" उदाहरण के लिए,) ड्राइव अक्षर और क्रमशः ही फाइल का नाम शामिल करें।
नोट: RStudio एक भी कंप्यूटर पर पहली बार के लिए प्रयोग किया जाता है, तो आर ग्राफिक्स पैकेज 'ggplot2' पहली बार स्थापित करने की आवश्यकता होगी। यह इस कदम निरर्थक हो जाता है, जिसके बाद RStudio की नई स्थापना के लिए एक बार ही कदम है। 'Ggplot2' स्थापित करने के लिए, RStudio के निचले सही कोने में खिड़की के ऊपर 'पैकेज' नामक टैब पर क्लिक करें इस नीचे दिखाई देता है कि 'स्थापित करें संकुल' बटन पर क्लिक करें। एक नई विंडो दिखाई देगा। 'पैकेज' एस में टाइप 'ggplot2' (omitting कोटेशन)इस नए विंडो में गति और अंत में कदम 3.6 से जारी रखने के लिए, खिड़की के पास आवश्यक ggplot2 कार्यों को स्थापित करने और मुख्य RStudio खिड़की पर लौटने के लिए 'स्थापित करें' बटन पर क्लिक करें। - RStudio के ऊपरी बाएँ विंडो में 17 के माध्यम से हाइलाइट लाइनों 1, तो 'भागो' बटन पर क्लिक करें। यह आर (चित्रा S2C) में प्रयोगात्मक डेटा, दहलीज मूल्यों और अच्छी तरह से स्थान का विवरण दर्ज करेंगे। आर अब अस्थायी रूप से साजिश रचने के लिए प्रासंगिक डेटा का आयोजन करेगा।
- रेखा 17 के नीचे शेष कोड के अलग-अलग ब्लॉकों पर प्रकाश डाला और पहले के रूप में 'भागो' बटन पर क्लिक करके इसी भूखंडों पैदा करते हैं। RStudio के निचले सही कोने में खिड़की में भूखंडों का निरीक्षण करें और 'निर्यात' बटन (चित्रा S2D) पर क्लिक करके स्वरूपों की संख्या बचाने के लिए।
- RStudio बंद करते समय, जब प्रेरित 'नहीं बचा है' पर क्लिक करें। इस अन्यथा डेटा का आयोजन करेगा जो RStudio की अगली उपयोग करते हैं, पर भ्रम से बचाता हैपिछले सत्र से।
Representative Results
छवियों के सेट उदाहरण के लिए तैयार किया गया है रिवर्स अभिकर्मक siRNA स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न होता है और सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया। जिसके परिणामस्वरूप संख्यात्मक कच्चे डेटा हर कोशिका को व्यक्तिगत रूप से मिल वापस अपनी छवि को और अच्छी तरह से मूल के, का प्रतिनिधित्व किया और कई प्रतिदीप्ति तीव्रता मानकों (चित्रा 6A) के लिए मापा जाता है कि इस तरह की है। पी-S780 RB1 एंटीबॉडी और डीएनए डाई परिभाषित परमाणु मास्क के लिए एकीकृत डीएनए तीव्रता के लिए मतलब परमाणु प्रतिदीप्ति तीव्रता की पहचान की प्रत्येक कोशिका के लिए निर्धारित कर रहे हैं। प्रत्येक कोशिका के नाभिक और कोशिका द्रव्य क्षेत्रों के लिए GFP तीव्रता मूल्यों मतलब भी GFP-CDK2 रिपोर्टर के cytoplasmic प्रतिदीप्ति बनाम परमाणु की गणना की इजाजत दी दर्ज हैं। इन एल्गोरिथम प्रतिदीप्ति तीव्रता माप का उपयोग के बहाव दो assays के, परमाणु एंटीबॉडी धुंधला और GFP-CDK2 रिपोर्टर के लिए फाटकों को परिभाषित करने के इन अलग-अलग सेल डेटा से बना है। वें पर कोशिकाओं के बाद एनोटेशनपरख परिणाम और विशिष्ट उप-जनसंख्या सक्षम करने के लिए इन लेबलों के उपयोग की ई आधार आगे वर्णन किया गया है एक तिहाई माप (परमाणु डीएनए सामग्री) द्वारा विशेषता किया जाना है।
प्रत्येक परख के लिए एकत्र हुए कच्चे प्रतिदीप्ति तीव्रता डेटा के हिस्टोग्राम भूखंडों सेल उप-जनसंख्या अलग अलग परिस्थितियों में कैसे व्यवहार का आकलन करने के लिए एक प्रभावी तरीका है। चित्रा 6B में histograms के प्रत्येक आरएनएआई पछाड़ना हालत के लिए तीन प्रतियों कुओं से अलग-अलग सेल डेटा की जनसंख्या वितरण दिखा। बाईं करने के लिए परमाणु एंटीबॉडी तीव्रता के लिए और सही पर डेटा GFP-CDK2 रिपोर्टर के लिए इसी डेटा कर रहे हैं। पी-S780 RB1 एंटीबॉडी डेटा कोशिकाओं को मोटे तौर पर इस बाद translational संशोधन के संबंध में और S780 पर phosphorylated RB1 के नुकसान के साथ कि सेल आबादी के साथ दो आबादी में मौजूद समृद्ध है जो परमाणु तीव्रता का एक बाएं हाथ के चोटी के रूप में प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि पता चलता है CDK6 siRNA से नीचे गिरा दिया जाता है। यह एक ही बाएं हाथ की चोटीRB1 खुद प्रोटीन और इस तरह पी-S780 RB1 धुंधला की एकमुश्त हटाने को दर्शाती है, आरएनएआई लक्ष्य है जब देखा जाता है। इसके विपरीत, एक ही कोशिकाओं के लिए एक ही प्रयोगात्मक शर्तों, GFP CDK2 संवाददाता परख के माध्यम से मनाया है, जब व्यक्ति सेल डाटा में एक अलग गतिशील दिखा। एक सतत वितरण केवल एक ही चोटी के साथ मनाया जाता है, लेकिन सेल चक्र (siCDK6) परेशान है और (है कि वितरण के दाएँ हाथ के कंधे का एक विस्तार में G1 चरण परिणामों में संचय का कारण बनता है जो siRNA यानी एक दिखा कोशिकाओं की बढ़ी उपस्थिति का संकेत परमाणु / कोशिका द्रव्य GFP के अनुपात में वृद्धि हुई है,) एक्स अक्ष पर साजिश रची है।
चित्रा 6B के histograms परख डेटा के दोनों सेट के वितरण के आधार पर चुना जाता है कि फाटक मूल्यों (ऊर्ध्वाधर सलाखों) कर रहे हैं पर भी दिखाया गया। अधिकतम चौड़ाई स्थिति मुख्य के बाएं कंधे पर: पी-S780 RB1 एंटीबॉडी डेटा के लिए इस्तेमाल शासन आधी ऊंचाई के रूप में गेट स्थिति को परिभाषित करने के लिए हैनकारात्मक नियंत्रण सेल डेटा पर जब (दाएं) शिखर (siRNA गैर लक्षित कर)। डाटा लाल इस गेट से पहचाना जाता है जो कम है और अनुपस्थित पी-S780 RB1, साथ कोशिकाओं रहे हैं पर प्रकाश डाला। अनुपात मूल्य वितरण के विपरीत कंधे पर तैनात एक समान गेट GFP-CDK2 रिपोर्टर के लिए प्रयोग किया जाता है। कमी है या सुविधा कम CDK2 गतिविधि जो परिणामस्वरूप उच्च अनुपात उप-जनसंख्या कोशिकाओं, हरे रंग में दिखाया गया है। दो assays के मल्टिप्लेक्स विश्लेषण वर्णन करने के लिए चित्रा 6C नीचे एनोटेट फ़ाइल में कच्चे डेटा (चित्रा 6A) कन्वर्ट करने के लिए 2_gate_classifier.pl पर्ल स्क्रिप्ट का उपयोग करते हुए दोनों गेट मूल्यों के कार्यान्वयन से पता चलता है। इस नई फ़ाइल (क्रमशः इस्तेमाल किया गया, एंटीबॉडी के डेटा के लिए 0.004 और GFP-CDK2 रिपोर्टर के लिए 1.5 से इस मामले फाटकों में) प्रत्येक कक्ष के लिए वर्ग लेबल का एक नया स्तंभ और उन्हें अलग करने के लिए इस्तेमाल किया दो गेट मूल्यों के साथ मूल डेटा शामिल ।
च व्यक्ति की कोशिकाओं में वर्गीकृत करने के बादROM यह परख डेटा के भूखंडों का एनोटेशन सहायता करने के लिए इन वर्ग के लेबल का उपयोग करने के लिए अब संभव है दो assays के आधार पर प्रत्येक पछाड़ना हालत। 7 से पता चलता है पी-S780 RB1 और GFP- के लिए अलग-अलग सेल डेटा के भूखंडों को तितर बितर चित्रा सभी तीन आरएनएआई स्थितियों के लिए निर्धारित उदाहरण डेटा से CDK2 assays के। Scatterplots पर चतुर्भागों annotating नंबर कि पछाड़ना संदर्भ के लिए पूरा करने के लिए प्रत्येक gated उप-जनसंख्या के सापेक्ष प्रतिशत दिखाने के और ऊपर वर्णित वर्ग लेबल का उपयोग कर अनुसंधान में उत्पन्न कर रहे हैं। इन भूखंडों siRNA (चित्रा 7B), siCDK6 साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को एक शुद्ध डेटा वितरण से पता चलता है गैर-लक्ष्य के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की तुलना में (सेरीन 780 में RB1 फास्फारिलीकरण के अभाव का संकेत है) और सही करने के लिए वाई अक्ष पर नीचे दोनों स्थानांतरित कर दिया, पता चलता है कि एक्स-अक्ष पर (चित्रा 7C, कम CDK2 गतिविधि का संकेत है)। इन बदलावों के दोनों इस लक्ष्य की पछाड़ना के लिए उम्मीद कर रहे हैं। सर से इस के विपरीत, डेटाबी 1 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं GFP पर कोई बड़ा प्रभाव है, सुझाव siRNA गैर-लक्ष्य के साथ ट्रांसफ़ेक्ट नियंत्रण की तुलना में CDK2 रिपोर्टर के लिए डेटा वितरण में (चित्रा 7A) मिलान के नुकसान के साथ ध्यान में रखते हुए एंटीबॉडी धुंधला का एक नुकसान दिखाने के लिए, लेकिन थोड़ा प्रभाव -CDK2 संवाददाता RB1 पछाड़ना से उठता है।
आगे व्यक्तिगत सेल डेटा, उप-जनसंख्या वर्गीकरण और परख बहुसंकेतन 8 चित्रा के इस्तेमाल का पता लगाने के लिए एकीकृत डीएनए तीव्रता के लिए चित्रा 7C के साथ बनती हिस्टोग्राम प्रोफाइल से siCDK6 डेटा के लिए तितर बितर साजिश को दर्शाता है। histograms के जोड़े एंटीबॉडी तीव्रता (scatterplot का अधिकार) या GFP-CDK2 संवाददाता अनुपात मूल्यों (scatterplot ऊपर) या तो के आधार पर विभाजित संपूर्ण जनसंख्या का विरोध हिस्सों, से संबंधित हैं। इन आबादियों के लिए परमाणु डीएनए तीव्रता की मात्रा क्रमश: छोड़ दिया और सही चोटियों के रूप में 2N और 4N डीएनए सामग्री की विशेषता दो चोटियों को दर्शाता है। मेँआंकड़े में दिखाया गया फाटकों की ntentions 6, 7 और 8 कोशिकाओं पी-S780 RB1 के लिए के रूप में कम पहचान की है कि इस तरह के हैं (लेबल: पी-S780-) या GFP-CDK2 संवाददाता से एक उच्च अनुपात मूल्य के साथ (लेबल: G1) होगा सेल चक्र के G1 के चरण में होना। दरअसल, इन assays के साथ या तो पहचान उप-जनसंख्या के लिए डीएनए प्रोफ़ाइल histograms मुख्यतः 2N डीएनए सामग्री के साथ कोशिकाओं के होते हैं। विपरीत gated आबादी के डीएनए प्रोफाइल (लेबल: पी-S780 + या गैर-G1) 2N से 4N से लेकर वितरण के साथ सेल शामिल हैं, इस तरह की कोशिकाओं सेल चक्र की एक श्रृंखला को गोद लेने के साथ रखने में पोस्ट-G1 के चरण पदों।
यहाँ ध्यान पीढ़ी और fluorescently दाग छवियों से अलग-अलग सेल डेटा का विश्लेषण किया गया है, यह प्रतिकृति और प्रदर्शन के बीच परिवर्तनशीलता नजर रखने के लिए इन आंकड़ों लेने के लिए और एक अच्छी तरह से अच्छी तरह से आधार पर प्रत्येक परख संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए सक्षम होने के लिए भी उपयोगी है डेटा की एक पूरी थाली भर में एक दिया परख के लिए सभी कुओं की।
चित्रा 1:। मात्रात्मक fluorescently लेबल माइक्रोस्कोप छवि डेटा का विश्लेषण करने के लिए कार्यप्रवाह में दिए चरणों का अवलोकन कार्यप्रवाह चार चरणों के रूप में यहाँ का प्रतिनिधित्व किया है (ए) के पहले यह प्रयोगात्मक फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए आवश्यक है।। यहाँ वर्णित उदाहरण एक का हैsiRNA इलाज पक्षपाती मानव ट्यूमर कोशिकाओं को एक 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट पर, 48 घंटे के लिए उगाया तय की और दाग रहे हैं, जिसमें स्क्रीन। विभिन्न आरएनएआई शर्तों प्लेट के भीतर अलग कुओं में तीन प्रतियों में मौजूद हैं। प्रकोष्ठों एक डीएनए डाई, CDK4 पर phosphorylated RB1 और 6 चुनिंदा लक्ष्य साइट सेरीन-780 (पी-S780 RB1) के लिए विशिष्ट एक एंटीबॉडी के साथ दाग और वे भी stably G1 के सेल चक्र से बाहर निकलें रिपोर्टिंग, एक GFP-CDK2-रिपोर्टर व्यक्त कर रहे हैं। सामूहिक रूप से इन फ्लोरोसेंट जांच दो assays के अलग-अलग कार्यप्रवाह के भीतर का मूल्यांकन का गठन। (ख) प्रत्येक फ्लोरोसेंट जांच (चैनल) के लिए समानांतर माइक्रोस्कोप छवियों और उत्पन्न छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर डेटा को व्यवस्थित कर सकते हैं जिसके द्वारा विवरण शामिल करने के रूप में इस तरह के नाम हैं। (सी) छवि फ़ाइलों एल्गोरिदम तीन फ्लोरोसेंट जांच का पता लगाने के लिए तीव्रता माप से बेदखल करने से पहले व्यक्ति की कोशिकाओं और नाभिक एसोसिएटेड जोड़े और कोशिका द्रव्य को दिखाता है जो सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर में लोड कर रहे हैंप्रत्येक में एड। (डी) अंत में, एक पर्ल स्क्रिप्ट उत्पादित कच्चे मात्रात्मक डेटा को व्यवस्थित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस कदम को प्रभावी ढंग से पता लगाया और जिरह, प्लॉट किया जा सकता है, जो उप-जनसंख्या में कोशिकाओं, binning, प्रत्येक कक्ष के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता के आंकड़ों के फाटकों पर लागू होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: प्रयोगात्मक डेटा छवि विश्लेषण द्वारा प्राप्त किया जा करने के लिए तय, siRNA इलाज, fluorescently लेबल कोशिकाओं imaged और इसी तीव्रता माप सेल प्रति उठाए गए थे निर्धारित उदाहरण डेटा से।। प्रतिनिधि छवि डेटा छवि विश्लेषण के दौरान दर्ज की गई प्रत्येक पैरामीटर के लिए दिखाए जाते हैं (ए) परमाणु डीएनए तीव्रता:। परमाणु डीएनए डाई का धुंधला की तीव्रता के लिए प्रयोग किया जाता है नाभिक प्रति डीएनए का एक उपाय उपज (बी) phospho-RB1 न्यूक्लियर तीव्रता:। इम्यूनो-धुंधला एक प्राथमिक (काला) एंटीबॉडी का उपयोग और fluorescently माध्यमिक एंटीबॉडी (लाल) में चिह्नित में RB1 फास्फारिलीकरण के एक तीव्रता माप सक्षम पी-S780 RB1 के लिए विशिष्ट । नाभिक प्रति S780 (सी) GFP-CDK2 रिपोर्टर: stably सेल चक्र के साथ एक सेट पैटर्न में नाभिक और कोशिका द्रव्य के बीच translocates कि एक GFP टैग संवाददाता प्रोटीन व्यक्त इस्तेमाल किया कोशिकाओं। प्रत्येक कक्ष के लिए बनती परमाणु और cytoplasmic GFP तीव्रता के दोहरे माप सेल चक्र के बाकी हिस्सों से G1 के चरण भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सेल प्रति एक अनुपात की गणना की अनुमति देता है। तीन siRNA लक्ष्य विश्लेषण वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा; एक नकारात्मक नियंत्रण siRNA गैर लक्षित कर; RB1 फास्फारिलीकरण और कोशिका चक्र प्रगति perturbing में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में CDK6 siRNA; RB1 siRNA एंटीबॉडी विशिष्टता स्थापित करने के लिए।कश्मीर "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: संगठन की छवि की छवि विश्लेषण करने से पहले फाइलें टिशू कल्चर प्लेट से लिया छवियों छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर वापस मूल प्रायोगिक संदर्भ के लिए छवि डेटा संबंधित करने के लिए अनुमति देने के लिए योजनाबद्ध तरीके से नाम हैं।। यह जानकारी प्रत्येक छवि के लिए फ़ाइल नाम के भीतर रखा जाता है। (ए) में अच्छी तरह से प्रयोग थाली पर प्रत्येक के रूप में विभिन्न आरएनएआई लक्ष्य या उपचार, फ़ाइल नाम की अच्छी तरह से पता रूपों भाग के अनुरूप कर सकते हैं। (बी) के फ्रेम संख्या फ़ाइल नाम का हिस्सा है । प्रत्येक अच्छी तरह से कई, गैर अतिव्यापी फ्रेम (सी) इकट्ठा करने के लिए imaged है के रूप में प्रत्येक फ्रेम से फ्लोरोसेंट जांच अलग से imaged कर रहे हैं; फलस्वरूप फ़ाइल नाम भी प्रत्येक छवि से संबंधित है जो चैनल को प्रतिबिंबित करने की जरूरत है।
चित्रा 4:। सेल प्रोफाइलर का प्रयोग परमाणु डीएनए और एंटीबॉडी धुंधला मापने के लिए प्रदान पाइपलाइन फ़ाइल में सेटिंग (3_channels_pipeline.cppipe), परमाणु डीएनए और के लिए सेल प्रोफाइलर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर उपायों प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं से संबंधित एंटीबॉडी बाध्यकारी । (ए) के नाभिक दाग डीएनए के 'ब्लू' चैनल की छवि में पहचाने जाते हैं। (बी) < / Strong> के डीएनए दाग नाभिक के पदों पर अस्थायी रूप से एक 'नाभिक नकाब' में आयोजित की जाती हैं। नाभिक मुखौटा तो (सी) का मुखौटा के साथ ओवरलैप है कि छवि क्षेत्रों से नीले और लाल चैनल छवियों (क्रमश: डीएनए और एंटीबॉडी प्रतिदीप्ति डेटा,) और प्रतिदीप्ति मूल्यों प्रत्येक पहचान सेल के खिलाफ दर्ज कर रहे हैं पर मढ़ा है। अलग पड़ोसी नाभिक के सफल पहचान नेत्रहीन नाभिक नकाब की उपस्थिति में मूल्यांकन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह मुखौटा छवि में परिक्रमा दिखाया गया है, एल्गोरिथ्म के लिए चुना सेटिंग्स एक एकल नाभिक के रूप में गलत पहचान पड़ोसी नाभिक है, जहां उदाहरण हैं। चर्चा खंड में पेश किया जाता है कि इन घटनाओं को कम करने के लिए एल्गोरिथ्म सेटिंग्स समायोजित। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 5: का प्रयोग सेल प्रोफाइलर के परमाणु और cytoplasmic GFP तीव्रता को मापने के लिए GFP टैग CDK2 संवाददाता कोशिकाओं के कोशिका चक्र की स्थिति के संबंध में नाभिक और कोशिका द्रव्य के बीच translocates।। सेल प्रोफाइलर सेल प्रति डीएनए और एंटीबॉडी परमाणु तीव्रता गणना करता है कि एक ही समय (चित्रा 4) में, यह भी प्रत्येक कोशिका के लिए GFP तीव्रता के cytoplasm अनुपात करने के लिए परमाणु गणना करता है। (ए) प्रत्येक छवि के लिए डीएनए डाई डेटा उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक नाभिक मुखौटा। (बी) सेल प्रोफाइलर नाभिक प्रत्येक कोशिका की स्थिति बीज के लिए GFP-CDK2 रिपोर्टर से GFP छवि के साथ संयोजन के रूप में मुखौटा का उपयोग करता है और उसके बाद प्रत्येक कोशिका के पूरे पदचिह्न अनुमान लगाने के लिए प्रत्येक कोशिका की परिधि के लिए फैलता है। यह नाभिक मुखौटा सेल नकाब से घटाया जाता है एक नया, 'सेल मुखौटा'। (सी) बन जो कोशिका द्रव्य की एक डोनट की तरह श्रृंखला की रूपरेखा, उपज के लिए हो जाता है'कोशिका द्रव्य मुखौटा'। (डी) नाभिक मुखौटा और कोशिका द्रव्य मुखौटा परमाणु और cytoplasmic GFP के मूल्यों के जोड़े को मापने के लिए सेल प्रोफाइलर द्वारा किया जाता है। ये बनती मूल्यों तो सेल चक्र में प्रत्येक कोशिका की स्थिति के रूप में सूचित जो अनुपात, गणना करने के लिए सेल प्रोफाइलर द्वारा किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6:। डाटा निकासी - परख मूल्यों पर फाटक लगाने से कच्चे व्यक्तिगत सेल डाटा प्रोसेसिंग एंटीबॉडी धुंधला और GFP-CDK2 संवाददाता assays के लिए अलग-अलग सेल डेटा से जैविक प्रवृत्तियों निकाले gated डेटा का उपयोग कर रहे हैं। कच्चे डेटा की histograms उपयुक्त गेट मूल्यों की पहचान सकें। ये तो एक पर्ल स्क्रिप्ट के साथ लगाया जाता है। (ए)सेल प्रोफाइलर के लिए प्रदान की सेटिंग्स के साथ छवि फ़ाइलों का विश्लेषण करने के अंत उत्पाद अल्पविराम से अलग-मूल्य (.csv) फाइल कर रहे हैं। विभिन्न उप सेलुलर क्षेत्रों में से प्रत्येक के लिए संबंधित व्यक्ति के सेल डेटा ontain इन फ़ाइलों सी। फ़ाइल 'Nuclei.csv' नाभिक मुखौटा के उपयोग से संबंधित सभी चयनित माप होता है। इन मापों परमाणु एंटीबॉडी तीव्रता, परमाणु डीएनए तीव्रता और GFP अनुपात (नाभिक / कोशिका द्रव्य) शामिल हैं। परमाणु एंटीबॉडी तीव्रता (बाएं) और GFP-CDK2 संवाददाता अनुपात (दाएं) प्रत्येक siRNA पछाड़ना हालत के लिए अलग-अलग सेल डेटा से साजिश रची (बी) Histograms । प्रदर्शित histograms पर सलाखों इन assays के लिए वांछित गेट पदों पर दिखाते हैं। Histograms पर रंग डेटा gated उप-जनसंख्या का संकेत मिलता है। (सी) बी में सचित्र दो assays के लिए फाटकों पर्ल स्क्रिप्ट '2_gate_classifier.pl' का उपयोग कच्चे डेटा को लागू कर रहे हैं। लिपिबाद में साजिश रचने की सहायता के लिए मूल सेल प्रोफाइलर निर्गम (Nuclei.csv) फ़ाइल का एक संशोधित प्रतिलिपि बनाता है। दो गेट मूल्यों नई (यहाँ रंग में प्रकाश डाला) फ़ाइल और एक नया 'लेबल' कॉलम जोड़ा गया है में दर्ज हैं। लेबल बिन प्रत्येक कक्ष के लिए दो gated परख मूल्यों पर आधारित चार संभव उपसमूहों में से एक में प्रत्येक कोशिका। इन लेबलों प्रत्येक उप-जनसंख्या के साथ ही सेल Profiler में उत्पन्न अतिरिक्त मापदंडों के पार संदर्भित के योगदान की गणना जो सुविधा बाद में भूखंडों में उपयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7:। व्यक्ति की कोशिकाओं और फाटक के पदों के लिए कच्चे डेटा चित्रण प्रत्येक siRNA हालत के लिए तितर बितर भूखंडों व्यक्तिगत के भूखंडों तितर बितरsiRNA स्थितियों के लिए सभी छवियों से दोहरी सेल डेटा संकेत दिया: (ए) siRB1, (बी) siNon-लक्ष्य नकारात्मक नियंत्रण, (ग) siCDK6। विरोधी पी-S780 RB1 धुंधला से परमाणु प्रतिदीप्ति के मूल्यों वाई-कुल्हाड़ियों के खिलाफ हैं साजिश रची है। एक्स-कुल्हाड़ियों के खिलाफ साजिश रची GFP-CDK2 रिपोर्टर से गणना की इसी अनुपात मान रहे हैं। लाल और हरे रंग की सलाखों क्रमश: पी-S780 RB1 फाटक के लिए फाटक और GFP-CDK2 संवाददाता फाटकों की स्थिति से संकेत मिलता है। दो फाटकों चार उप-जनसंख्या में कोशिकाओं के विभाजन और जिसके परिणामस्वरूप चतुर्भागों से अधिक संख्या में इनमें से प्रत्येक से कोशिकाओं के प्रतिशत संख्या में हैं। A के लिए कुल्हाड़ियों के चारों ओर एनोटेशन 2_gate_classifier.pl पर्ल स्क्रिप्ट से प्रत्येक कोशिका के लिए लागू चार संभव लेबल-तत्वों का संकेत मिलता है। इन लेबलों उनके संबंधित परख गेट के संबंध में दिखाया जाता है और 6, 7 आंकड़े में भूखंडों उत्पन्न करने के लिए आर-लिपि (analysis.r) में किया जाता है और
चित्रा 8: दो G1 के पारगमन assays के द्वारा परिभाषित सेल उप-जनसंख्या परख परिणाम के साथ ध्यान में रखते हुए 2N और 4N डीएनए प्रोफाइल दिखाने siCDK6 कोशिकाओं के लिए डेटा के तितर बितर साजिश चित्रा 7C से दोहराया है।। तितर बितर साजिश आसपास के आबादी के सबसेट से संबंधित एकीकृत परमाणु डीएनए तीव्रता के लिए histograms हैं। Scatterplot उन लोगों के ऊपर GFP-CDK2 संवाददाता परख से संबंधित हैं। Scatterplot का सही करने के लिए उन अकेले परमाणु phospho-RB1 एंटीबॉडी माप से संबंधित हैं। रंग फाटक लाइनों histograms के लिए उनके संबंध दिखाने के लिए बढ़ा रहे हैं। सेल डेटा इन अतिरिक्त भूखंडों के लिए चयन किया गया है जिसके द्वारा गेट लेबल भी दिखाए जाते हैं। (कम CDK2 गतिविधि का संकेत) सेरीन 780 (पी-S780-) या cytoplasmic अनुपात करने के लिए एक उच्च GFP-CDK2 संवाददाता परमाणु के साथ उन पर phosphorylated RB1 के नुकसान के साथ कोशिकाओं के प्रत्येक संबंधित परख के लिए उनके विपरीत समकक्षों, जबकि मुख्य रूप से 2N की तरह डीएनए प्रोफाइल दिखाने 2N और 4N, कोशिकाओं के एक मिश्रित, बाद में G1 चरण जनसंख्या की विशेषता का वितरण दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा: 9। Gated (ए) के पी-S780 RB1 डेटा और प्रत्येक siRNA पछाड़ना हालत के लिए तीन प्रतियों कुओं से (बी) GFP-CDK2 डेटा के प्रत्येक siRNA हालत सारांश डेटा भूखंडों के लिए gated परख मूल्यों का सारांश भूखंडों। मूल्यों का उपयोग कच्चे सेल प्रोफाइलर निर्गम (Nuclei.csv) से गणना की गईपर्ल स्क्रिप्ट, 'antibody_fluorescence_summary.pl' (ए) या 'G1assay_summary.pl' (बी)। साजिश रची मूल्यों प्रत्येक परख करने के लिए लागू गेट के भीतर प्रतिशत कोशिकाओं के साधन हैं। बार्स तीन प्रतियों कुओं से गणना की मानक त्रुटियों से संकेत मिलता है। पी <0.001 (**) और पी <0.05 (*)। जहां siRNA गैर-लक्ष्य की तुलना में प्रत्येक पछाड़ना हालत के लिए unpaired, homoscedastic टी परीक्षण पी मूल्यों साजिश रची डेटा के ऊपर दिखाए जाते हैं कृपया यहाँ क्लिक करें इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए आंकड़ा।
चित्रा एस 1। छवि विश्लेषण के लिए सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर की स्थापना। सेल प्रोफाइलर (ए) स्क्रीनशॉट किसी भी छवि विश्लेषण सेटिंग्स प्रवेश कर रहे हैं पहले। (बी) के स्क्रीनशॉट सेल प्रोफाइलर की '3_channels_pipeline.cppipe' में निहित एल्गोरिथ्म विवरण लोड किया गया है के बाद। उच्च ऊपरी बाएँ कोने में रोशन टैब इस स्क्रीन विश्लेषण के 'LoadImages' चरण के लिए मानकों से पता चलता है कि इंगित करता है। इस नीचे दी गई सूची के अन्य भागों पर क्लिक विश्लेषण में बाद के चरणों के लिए विवरण प्रकट होगा। इनपुट फ़ोल्डर और फ़ोल्डर में प्रवेश किया आउटपुट के लिए विवरण के साथ सेल प्रोफाइलर (सी) स्क्रीनशॉट। (डी) सेल प्रोफाइलर का स्क्रीनशॉट के बाद 'का विश्लेषण करें छवियों 'बटन विश्लेषण शुरू करने के लिए क्लिक किया जा चुका है। विश्लेषण के तहत छवियों से सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न एल्गोरिदम का उत्पादन मास्क illustrating तीन नए विंडो आरोपित कर रहे हैं। इन खिड़कियों मुख्य सेल प्रोफाइलर विंडो के ऊपरी बाएँ कोने में, अगले विश्लेषण में प्रासंगिक कदम के लिए खुले स्थान के लिए 'नज़र' माउस को क्लिक करके पहुँचा रहे हैं। इन विचारों कंफ़ेद्दी रंग मास्क पैदा करने सेटिंग्स उनके साथ, मूल, greyscale डेटा के साथ सहमत हैं कि क्या उपयोगकर्ता को सत्यापित करने के लिए मदद करते हैं।
ईएनटी "> गेट व्यक्तिगत सेल के आंकड़ों के पर्ल और RStudio चित्रा S2 है। उपयोग और साजिश जिसके परिणामस्वरूप सेल उप-जनसंख्या। (ए) सही पैनल सेल प्रोफाइलर विश्लेषण से उत्पादन .csv फ़ाइलें (हरे आइकन) प्राप्त करने के लिए चुना फ़ोल्डर से पता चलता है। पांडुलिपि (नीले रंग के आइकन) के साथ प्रदान की पर्ल स्क्रिप्ट इस फ़ोल्डर में नकल कर रहे हैं। प्रकाश डाला डबल क्लिक किया बाएं पैनल में संवाद बॉक्स का उत्पादन करने के लिए माउस के साथ किया गया है जो '2_gate_classifier.pl' पर्ल स्क्रिप्ट है। दिखाए जाते हैं तुरंत 'analysis.R' स्क्रिप्ट लोड करने के बाद RStudio के गेट 'Nuclei.csv' फ़ाइल से अलग-अलग सेल डेटा के लिए आवश्यक संकेत देता है और टाइप इसी जवाब। (बी) के स्क्रीनशॉट। प्रकाश डाला में एक से gated डाटा अपलोड करने के लिए आदेश कर रहे हैं पूर्व लाइनों 5 और 6 में नोट विवरण (साजिश रचने के लिए सॉफ्टवेयर gated डेटा गणना पर स्थित है, जहां के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होगीविश्लेषण के लिए इस्तेमाल आर)। (RStudio की सी) स्क्रीनशॉट डेटा अपलोड किया गया है एक बार। (RStudio दिखाने का डी) स्क्रीनशॉट निचले सही खिड़की में दिखाया साजिश का उत्पादन करने के लिए आवश्यक कोड के ब्लॉक पर प्रकाश डाला। प्रत्येक भूखंड के लिए कोड्स रिक्त लाइनों के द्वारा अलग और साजिश के प्रकार से वर्गीकृत किया है।| siRNA लक्ष्य | प्लेट अच्छी तरह से पतों |
| गैर-लक्ष्य-निर्धारण (एनटी) | E5, करें F5, G5 |
| रेटिनो ब्लास्टोमा (आरबी) | E7, F7, G7 |
| Cyclin निर्भर काइनेज 6 (CDK6) | बी 2, सी 2, डी 2 |
तालिका 1: खैर पते और निर्धारित उदाहरण डेटा में प्रयोग किया जाता है इसी siRNA शर्तों।
Discussion
वर्णित कार्यप्रवाह siRNA, बाद में मार्कर का पता लगाने का उपयोग कोशिकाओं की multiwell perturbance के लिए एक प्रक्रिया का गठन किया और अंत में जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों से मात्रात्मक डेटा की निकासी की सुविधा के लिए सॉफ्टवेयर-समर्थित कदम की एक श्रृंखला का उपयोग करें। दृष्टिकोण कई सेल आधारित अनुप्रयोगों में व्यापक व्यावहारिक आवेदन किया है जो व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए परमाणु और cytoplasmic तीव्रता मूल्यों के वितरण पर ध्यान केंद्रित कर रहा है। यहां इस्तेमाल उदाहरण डेटा G1 के चरण सेल चक्र पारगमन के लिए दो फ्लोरोसेंट assays के परीक्षण किया और वापस परमाणु डीएनए सामग्री का एक और अधिक प्रत्यक्ष biophysical उपाय करने के लिए सहसंबद्ध होते हैं जिसमें एक siRNA स्क्रीन स्थापित करने में उत्पन्न किया गया।
यह व्यक्ति की कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है और जिसके परिणामस्वरूप 'नाभिक मुखौटा' इसी cytoplasmi की पहचान करने के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में कार्य करता है के रूप में छवि परमाणु डीएनए के लिए एक फ्लोरोसेंट डीएनए दाग का उपयोग छवि विभाजन की प्रक्रिया में एक अनिवार्य कदम हैसी क्षेत्रों के। Stably कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जो GFP टैग CDK2 संवाददाता, अभी तक इस डिब्बे चित्रित किया जा सकता है जिसके द्वारा कोशिका द्रव्य में पृष्ठभूमि संकेत से लगातार उच्च एक चर देता है। एक ही विश्लेषण पाइपलाइन अन्य उपयुक्त प्रतिदीप्ति से जुड़े पत्रकारों और perturbance करने के लिए उनकी प्रतिक्रिया का उपयोग कर प्रोटीन स्थानान्तरण की घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जाना चाहिए। इसके अलावा, कोशिका द्रव्य-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंगों के साथ GFP-CDK2 संवाददाता प्रतिस्थापन इस एल्गोरिथ्म के वैकल्पिक उपयोग कोशिका द्रव्य के आयामों और छवियों में कोशिकाओं के सापेक्ष आकार को मापने के लिए अनुमति होगी।
यहाँ वर्णित छवि विभाजन की रणनीति में एक और डिजाइन को ध्यान डीएनए मात्रा का ठहराव के लिए एकीकृत तीव्रता मूल्यों देने के लिए सेल प्रोफाइलर का इस्तेमाल होता है। तीव्रता का एकीकरण धुंधला डेटा नाभिक आकार में संभव रूपांतरों के लिए अनुमति परमाणु डीएनए के लिए मूल्यों, और देखा मात्रा का ठहराव प्रोफाइल के लिए एक करीबी मैच का प्रतिनिधित्व करता हैके लिए propidium आयोडाइड दाग FACS के डेटा। हालांकि, एकीकृत तीव्रता प्रतिजन प्रतिदीप्ति का मतलब तीव्रता द्वारा उदाहरण औसत एकाग्रता, और अधिक जैविक रूप से एक सेल डिब्बे के भीतर प्रोटीन (और संबद्ध प्रतिदीप्ति) की एकीकृत कुल राशि से अधिक प्रासंगिक है, जहां प्रोटीन समारोह का आकलन करने के लिए एक उपयुक्त साधन प्रदान नहीं कर सकते। इसलिए तीव्रता मूल्यों पी-S780 RB1 और GFP डेटा के लिए इस्तेमाल किया गया है मतलब है। विकल्प सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर की 'ExportToSpreadsheet' पैनल पर पाया जाता है दो मोड (मतलब या एकीकृत) के आंकड़ों के मूल्यांकन के बीच परिवर्तन करने के लिए।
3_channels_pipeline.cppipe फ़ाइल में विश्लेषण सेटिंग्स उदाहरण डेटा सेट में छवियों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल के साथ नए छवियों सेट के विश्लेषण फ़ाइल नाम नामकरण परंपरा से ऊपर (चित्रा 3) में वर्णित अपनाने की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, संवेदनशीलता पृष्ठभूमि के लिए परमाणु डीएनए धुंधला और थ्रेसहोल्ड की चमक को सूट करने के मूल्योंनई छवि सेटों में तीव्रता सेल प्रोफाइलर सेटिंग्स के भीतर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। डीएनए धुंधला विभिन्न छवि विभाजन मास्क के निर्माण के लिए धारण महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए इस चैनल के लिए सही संवेदनशीलता सेटिंग्स के आवेदन सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर के साथ नई छवि डेटा के सफल विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। प्रदान की सेल प्रोफाइलर सेटिंग फ़ाइल (3_channels_pipeline.cppipe) नए आंकड़ों के विश्लेषण के अनुकूल ढालने के लिए सबसे अक्सर उपयोगी मानकों पर नोट्स हैं। इन नोटों सेल प्रोफाइलर मुख्य विंडो में स्क्रीन के शीर्ष पर टेक्स्ट बॉक्स में हैं और संवेदनशीलता सेटिंग्स बदल रहा है और चैनलों की संख्या का विश्लेषण किया जा करने के लिए समायोजन पर मार्गदर्शन शामिल हैं। नई छवि डेटा के लिए सेटिंग्स का परीक्षण करने के लिए प्रोटोकॉल खंड 2.8, में आरोपित के रूप में यह (चित्रा S1D '... पहचानें' वस्तुओं में से प्रत्येक के लिए 'नज़र' माउस को खुला क्लिक करके प्रोटोकॉल चरणों छवि विश्लेषण के दौरान छवि विभाजन का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक हो सकता है
सेल प्रोफाइलर से अलग-अलग सेल डेटा के कच्चे उत्पादन अन्य अध्ययनों की आवश्यकताओं के अनुरूप करने के तरीके अलग में विश्लेषण किया जा सकता है। यहाँ दिखाया गया डेटा एक से जैविक प्रवृत्तियों निकालने की सहायता करने के क्रम में सेल प्रति मापा मापदंडों के दो फाटकों लागू करने के लिए एक पर्ल स्क्रिप्ट का इस्तेमाल होता हैअतिरिक्त माप के साथ की पहचान की उप-जनसंख्या के डी परमिट पार संदर्भित। यह सेल प्रोफाइलर के ढांचे के भीतर gating के तत्वों को शामिल करने के लिए समान रूप से संभव है, यहां इस्तेमाल वैकल्पिक मार्ग बड़े डेटा सेट का मूल्यांकन करने की आवश्यकता है विशेष रूप से करते हैं, तो अधिक से अधिक लचीलापन और गति प्रदान करता है। मौजूदा प्रोटोकॉल के बाद छवि अधिग्रहण चरणों में धीमी चरण सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर के चल रहा है। अगर जरूरत सेल प्रोफाइलर यहाँ अलग गेट मूल्यों के साथ iteratively, और अधिक जल्दी बाद पर्ल स्क्रिप्ट के साथ reanalyzed किया जा सकता है जो एक संयुक्त राष्ट्र-गेटेड कच्चे डेटा सेट का निर्माण करने के फाटक लगाने के बिना चला जाता है। नहीं सभी अध्ययनों से इस रूप में उपयुक्त गेट मूल्यों संभावित समय के साथ डेटा के किसी भी सेट पर अभिकर्मकों के साथ बदलती हैं, और हो सकता है अग्रिम में पता चल जाएगा। यह इसलिए, उपयुक्त गेट valu की पहचान करने के क्रम में सकारात्मक नियंत्रण और नकली परेशान कोशिकाओं के लिए सेल प्रोफाइलर से प्राप्त कच्चे डेटा वितरण चित्रण histograms उत्पन्न करने के लिए सिफारिश की हैब्याज के मापदंडों के लिए तों।
पर्ल स्क्रिप्ट सेल प्रोफाइलर से डेटा की एक सख्ती से परिभाषित स्तंभ संरचना को स्वीकार करने के लिए लिखा जाता है और एक उपयोगकर्ता ExportToSpreadsheet 'सेटिंग्स का उपयोग सेल प्रोफाइलर द्वारा मापदंडों उत्पादन की संख्या को संशोधित अगर काम करना बंद कर सकते हैं। नोटों पर्ल स्क्रिप्ट फ़ाइलों के भीतर शामिल किए गए हैं सेटिंग्स के संशोधन को लागू करने में मदद करने के लिए। ये एक पाठ संपादक में स्क्रिप्ट दृश्य देखने के लिए, अधिमानतः एक प्रोग्रामर के पाठ संपादक (जैसे, http://www.activestate.com/komodo-edit) रंग कोड पर्ल तत्वों के लिए निर्धारित किया है। डेटा स्वरूप में बदलाव के लिए अनुकूल करने के लिए स्क्रिप्ट को समायोजित करने के लिए जहां ये नोट से संकेत मिलता है। पर्ल स्क्रिप्ट के लिए इसी प्रकार, छवि विश्लेषण डेटा से आंकड़ों की साजिश रचने के लिए निर्देश युक्त प्रदान की आर-कोड फ़ाइल (analysis.r), उपयोग और अनुकूलन पर अतिरिक्त नोटों को देखने के लिए एक पाठ संपादक या RStudio सॉफ्टवेयर में पढ़ा जा सकता है। इन नोटों को नियमित अभिव्यक्ति और पर्ल <पर विवरण के साथ पूरक किया जा सकता हैसमर्थन> 12 और डेटा, पढ़ा एनोटेट और क्रमश: साजिश रची है कैसे के लिए आधार के रूप में, जो दोनों के आर, के लिए ggplot2 13 पैकेज।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर नए अध्ययन के रूप में अच्छी तरह से खुला स्रोत प्रकाशनों के साथ जमा कच्चे डेटा ऐसे में यहाँ वर्णित उन के रूप में विश्लेषण के तरीकों के लिए उत्तरदायी हैं। उच्च सामग्री डेटा का स्वभाव किसी भी पर्यवेक्षक के अनुसंधान के हितों के आधार पर अलग विश्लेषणात्मक emphases साथ पुनरावर्ती विश्लेषण करने के लिए उधार देता है। डेटा के लिए कहा जा सकता है कि सवालों मूल रूप से प्रयोग किया जाता जांच द्वारा सीमित कर रहे हैं, छवि डेटा अक्सर सार्थक उन्हें उत्पन्न जो पढ़ाई के दायरे से परे reanalyzed जा सकता है।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है
Acknowledgments
इस काम अनुदान CRUK 15,043 और CRUK 14,251 द्वारा समर्थित किया गया।
हम तकनीकी सहायता और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डैनियल Wetterskog और का केई हो धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AllStars negative control siRNA | Qiagen | 1027280 | Negative control siRNA. |
| CDK6 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU |
| RB1 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT |
| 5x siRNA buffer | Thermo Scientific | B-002000-UB-100 | To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water. |
| Nulcease-free water (non-DEPC) | Applied Biosystems | AM9937 | For dilution of siRNA buffer. |
| Hiperfect | Qiagen | 301705 | Transfection lipid. |
| DMEM | Life Technologies | 41966052 | Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media. |
| 96 well tissue culture plate | Falcon | 3072 | Plain, 96 well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes. |
| Packard Viewplate | Perkin Elmer LAS | 6005182 | 96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates. |
| Breathable membrane | Alpha Labs | LW2783 | Sterile, gas-permeable, adhesive membrane. |
| Neutral buffered formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT5012-1CS | 10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100PC | Non-ionic detergent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | For plate wash solution. |
| Anti-P-S780 RB1 antibody | Abcam | ab32513 | Rabbit monoclonal |
| AlexaFluor647 Anti-rabbit | Invitrogen | A21245 | Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody. |
| Hoechst 33342 (Bisbenzimide) | Sigma-Aldrich | B2261 | Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye. |
| Permeabilization solution | NA | NA | 0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0. |
| Plate wash solution | NA | NA | Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20. |
| Block solution | NA | NA | 5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies. |
| Cell Profiler 2.1 | Broad Institute | http://www.cellprofiler.org/download.shtml | |
| Active Perl Community Edition | ActiveState | http://www.activestate.com/activeperl/downloads | |
| R programming environment | The R Foundation | http://www.r-project.org | |
| Rstudio | Rstudio | http://www.rstudio.com/ |
References
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