Introduction
Il rapido progresso della biologia cellulare molecolare e la costante necessità di farmaci migliorati in medicina ha creato la necessità per i biologi strutturali a guardare strutture proteiche sempre più complesse. Questi spesso possono richiedere particolari modificazioni post-traduzionali, chaperon molecolari e co-fattori per sostenere il loro ripiegamento elaborato e l'attività enzimatica. Mentre la stragrande maggioranza delle strutture presenti nel Protein Data Bank sono stati ottenuti utilizzando sistemi di espressione batterici, procarioti sono in grado di eseguire un gran numero di queste modifiche e mancano molti cofattori essenziali eucariotiche. Questo può essere un problema per lo studio di grandi complessi multi-subunità che vengono attivati da piccole molecole di segnalazione, nonché per nucleare, superficie cellulare e proteine secrete che richiedono elaborati macchinari pieghevoli. Un certo numero di E. coli sono stati progettati per superare alcune di queste limitazioni 1. Negli ultimi anni, tuttavia, l'uso di msistemi di espressione ammalian è in aumento perché affidabile producono proteine eucariotiche che sono altrimenti problematici per esprimere in altri sistemi 2. Oggi è possibile ottenere linee cellulari di espressione di mammifero stabili e transienti attraverso una varietà di tecniche che vanno dalla trasduzione virale di transfezione mediata chimica, fisica trasferimento genico come elettroporazione e iniezione diretta 3. Mentre tutti questi metodi hanno la loro propria serie di vantaggi e svantaggi, solo pochi di loro sono adatti per studi strutturali che sono troppo costosi e / o di tempo.
Qui si descrive un metodo molto semplice, veloce, poco costoso ma molto efficace per esprimere complessi proteici per la biologia strutturale in sospensione coltivato cellule di mammifero. L'approccio utilizza transitorio co-trasfezione di un embrionali umane di rene (HEK) linea cellulare (ad esempio, le cellule HEK Freestyle 293F). Queste cellule sono state derivate dalla HEK 293 cell linea, sono adattate a crescere in colture in sospensione, raggiungendo elevate densità utilizzando mezzi privi di siero (come FreeStyle 293 Expression Media). Le cellule sono poi trasfettate utilizzando una versione derivata di polietilenimmina (PEI), un reagente polimerico economico che è stato segnalato per funzionare per una vasta gamma di cellule di mammifero 4 formando complessi DNA / PEI che entrano nella cellula ospite per endocitosi 5. Questo metodo è adatto sia su piccola scala (30 ml) e su larga scala (fino a 300 ml) esperimenti e in grado di produrre alti livelli di complessi proteici purificati. È particolarmente utile per studiare le proteine che richiedono macchinari complessi pieghevoli, cofattori o particolari modificazioni post-traduzionali che non possono essere eseguite da batteri, lieviti e cellule di insetto.
In questo protocollo presentiamo l'espressione e purificazione della tre-proteina scaffold centrale dal complesso di repressione trascrizionale Sin3A. Si tratta di HistoneDeacetilasi 1 (HDAC1), soppressore di difettoso Silencing 3 (SDS3) e Switch-indipendente 3 (Sin3A). Il complesso purificato viene utilizzato per prove di cristallizzazione high-throughput.
Protocol
NOTA: Il protocollo è adatto a qualsiasi scala di espressione, quindi, i volumi e le quantità di reagenti devono essere scalati in modo proporzionale. Un adatto vettore di espressione di mammifero deve essere utilizzato per questo protocollo. Qui abbiamo utilizzato una versione modificata pcDNA 3.1 vettore di espressione che permette comodamente l'inclusione o l'esclusione di un tag di affinità in base alla scelta degli enzimi di restrizione utilizzati nella clonazione (Figura 1). Il seguente protocollo descrive un grande trasfezione scala.
1 Large Scale Cultura / trasfezione in 1 L Roller Bottiglie
Crescere e mantenere le cellule sospensione adattato HEK293F secondo protocolli standard. Tipicamente colture starter comprese tra 30 e 100 ml sono coltivati in 250 ml coniche fiasche di coltura cellulare.
- Cellule Seed a 0.5 x 10 6 cellule / ml in un volume finale di 300 ml in ogni bottiglia rullo 1 L.
NOTA: bottiglie rulli ospitare un minimo di 150 ml ad un massimo di300 ml di coltura in sospensione. Per i più grandi transfezioni scala utilizzare più bottiglie. - Incubare per 24 ore in un agitatore orbitale incubatore a 37 ° C, 120 rpm, e 5% di CO 2 fino cellule raggiungono una densità di 1,0 x 10 6 cellule / ml (cellule devono dividere approssimativamente ogni 24 ore).
- Pipettare un totale di 300 mg di DNA, sterilizzata per filtrazione (vedi metodo supplementare) in 30 ml di PBS e mescolare vigorosamente nel vortex per 3 secondi.
NOTA: Utilizzare un totale di 1 mg di DNA per milione di cellule trasfettate. Se due o più plasmidi devono essere co-trasfettate ridurre la quantità di ciascun modo che il rapporto di DNA di cellule rimane costante. - Aggiungere 1,2 ml di 0,5 mg / ml, sterilizzata per filtrazione PEI alla soluzione PBS / DNA e vortex vigorosamente per 3 sec.
- Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 min.
- Aggiungere il DNA / PEI miscela alle cellule - che dovrebbe essere ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml (passo 1.3).
- A seguito di co-trasfezione, incubare le cellulein un incubatore agitatore orbitale per un ulteriore 48 ore a 37 ° C, 120 rpm, e 5% di CO 2.
- Harvest proteine intracellulari mediante centrifugazione cellule a 3.000 xg per 5 min e immagazzinare il pellet a -80 ° C.
NOTA: In alternativa, usare uno standard (non-CO 2) che agita incubatrice, se l'atmosfera sopra la coltura viene sostituito con il 5% di CO 2 e il coperchio della bottiglia è sigillata. L'atmosfera dovrà essere sostituita ad ogni passaggio (normalmente ogni 2 giorni).
2.-Protein complesso Purificazione da estratto cellulare totale
Questo protocollo è ottimizzato per la purificazione dei complessi nucleari che utilizzano proteine bandiera-tag.
- Scongelare pellet di cellule in ~ 40 ml di tampone di lisi pre-raffreddata (100 mM acetato di potassio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolo, 0,3% Triton X-100, inibitori della proteasi) per l di cultura.
- Risospendere il pellet pipettando su e giù parecchie volte (per evitare la formazione di schiuma, non fare vortex). Accuratamente risospendere le cellule utilizzando un omogeneizzatore di vetro. Sonicare per 3 cicli (15 sec a 15 sec, off). Centrifugare a 30.000 xg per 25 min a 4 ° C e conservare il surnatante.
- Equilibrare 1,25 ml di anti-bandiera ricco di resina di agarosio per litro di coltura da lavare tre volte con tampone di equilibrazione resina (acetato di potassio 100 mM, 50 mM Tris pH 7.5).
- Incubare l'estratto cellulare tutto dal punto 2.3 con la resina di affinità in uno o più di 50 ml provette e ruotare delicatamente il campione per 30-120 minuti a 4 ° C.
- Centrifugare a 3000 xg per 1 min a 4 ° C, il surnatante scarti.
- Lavare la resina con 45 ml di tampone di pre-refrigerati 1 (100 mM acetato di potassio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolo, 0,3% Triton X-100). Centrifugare a 3000 xg per 1 minuto e scartare il surnatante.
- Ripetere il punto 2.7 utilizzando tampone di sale (acetato di potassio 300 mM, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolo), seguito da buffer di basso contenuto di sale (acetato di potassio 50 mM, 50 mM Tris pH 7.5, 5% glicerolo) e TEV Decolleté Buffer (50 mM acetato di potassio, 50 mM Tris pH 7.5, TCEP 0,5 mM).
NOTA: Assicurarsi che ogni lavaggio è breve cioè, sufficiente a pieno risospendere la resina e non più. - Raccogliere un campione di 10 ml di resina e diluire in 1 volume di 2x tampone di proteine di carico per l'analisi (controllo legato alle proteine). Non utilizzare agenti riducenti al fine di evitare di rilasciare l'anticorpo dalla resina.
- Risospendere la resina in 8-10 ml di pre-raffreddata buffer di TEV scissione e trasferimento in una provetta da centrifuga 15 ml.
- Aggiungere ~ 40 mcg di TEV proteasi (da magazzino a 1 mg / ml) per L di cultura originale e mescolare bene pipettando su e giù parecchie volte.
- Sostituire atmosfera tubo con il 100% di N 2 gas per prevenire l'ossidazione delle proteine.
- Ruotare delicatamente O / N a 4 ° C.
- Centrifugare a 3000 xg per 10 min. Trasferire il surnatante in un filtro ultra centrifugo con un adeguato peso molecolare di cut-off e concentrarsifino a 500 microlitri.
- Raccogliere un campione di 10 microlitri della proteina concentrato e diluire a 1 volume di tampone 2x proteina caricamento per analisi. (TEV controllo eluato).
- Raccogliere un campione di 10 ml di resina e diluire a 1 volume di tampone 2x proteina caricamento per analisi. Non utilizzare agenti riducenti per evitare rilasciando grandi quantità di anticorpi dalla resina. (Controllo di resina post-TEV).
- Equilibrare la colonna cromatografia ad esclusione dimensioni, con buffer di gel filtrazione (acetato di potassio 50 mM, 50 mM Tris pH 7.5, TCEP 0,5 mM).
- Filtrare la proteina attraverso un filtro da 0,22 micron
- Caricare il campione nella colonna e raccogliere le frazioni.
- Campioni Eseguire passi da 2.9, 2.15 e 2.16 e le frazioni di filtrazione gel dal punto 2.19 su un SDS-PAGE e colorazione Coomassie per l'analisi.
NOTA: Si consiglia di eseguire un SDS-PAGE di campioni da gradini 2.9, 2.15 e 2.16 prima di gel filtrazione per confermare espressione della proteina bersaglio.
Representative Results
Qui vi mostriamo un 2 L (8 x 250 ml culture) transitoria co-trasfezione e purificazione della HDAC1, SDS3, Sin3A complesso ternario. HDAC1 e SDS3 interagiscono con Sin3A attraverso il dominio HDAC-interazione (HID) di Sin3A. Un tipico rendimenti di depurazione fino a 1 mg di complesso per litro di coltura.
Figura 1 Schema del pcDNA 3.1 vettore di espressione modificato. Il plasmide è stato digerito con EcoRV e EcoRI per includere l'affinità-tag e il sito scissione TEV sul terminale amino di Sin3A. Per clonare le versioni senza tag di HDAC1 e SDS3, il vettore è stato digerito con EcoRI e KpnI.
Figura 2 SDS-PAGE mostra la prima fase della purificazione. La corsia "proteina legata" indica il complesso legato alla resina di affinità. Dopo TEV digestione, l'etichetta presente sul Sin3A-HID viene scissa spento e il complesso viene eluito dalla resina, come mostrato nella seconda e terza corsie del gel.
Figura 3 Cromatogramma della purificato mediante cromatografia di esclusione dimensione proteina-complesso. Notare che il complesso puro diluito in volume vuoto perché forma un dimero in soluzione.
Figura 4. SDS-PAGE mostra le frazioni del gel filtrazione mostrato in Figura 3.
Figura 5 Trypan Blue-macchiato cellule HEK 293F a 2.3x10 6 cellule / ml pronto per essere transfettate. Cellule devono essere presenti come cellule singole o divisione solo, mentre il cluster di grandi dimensioni possono essere suddivisi nel vortex vigorosa per circa 25 sec.
| Problema | Possibili cause | Azione |
| Bassa resa di proteine. | Basso numero di cellule transfettate. | Assicurarsi densità cellulare è di circa 1.0 x 10 6 prima di aggiungere la miscela di reazione trasfezione alla cultura. |
| Le cellule possono essere stati reinoculate troppe volte. | Utilizzare le cellule ceppo dopo circa 90 passaggioetà. | |
| DNA può essere rallentata o hanno una quantità elevata di impurità. | Assicurarsi che il DNA plasmidico utilizzato ha un rapporto di 260/280 tra 1,8 e 2,0. Esecuzione del DNA su un gel di agarosio è consigliabile valutare la qualità. | |
| Protein (s) espressi non sono stabili o abbastanza solubile. | Prova diversi costrutti in piccola scala prima di up-scalare le trasfezioni. Assicurarsi che i tag non interferiscono con la struttura della proteina (s) di interesse. | |
| Cellule guardare nuvoloso e hanno un colore e / o odore insolito. | Le cellule sono infette da batteri o lieviti. | Buona tecnica sterile deve essere utilizzato in ogni momento. Fumigazione le cappe a flusso laminare e UV-disinfezione della camera di coltura cellulare in caso di infezione aiuta contenente il problema. |
| Le cellule hanno una bassa redditività. | PH errato nei media. | Assicurarsi che le culture sono coltivate al 5-8% di CO 2in ogni momento. |
| Le cellule sono state coltivate fino ad una densità sopra 3.0x10 6 cellule / ml. | Le cellule non devono essere coltivate fino a densità superiore a 2,5 x 10 6 cellule / ml subito prima di un trasfezione e mai superiori a 3,0 x 10 6 cellule / ml. | |
| Purificazione per affinità non ha funzionato | Protein (s) non viene espresso. | Vedi sopra. |
| Condizioni di depurazione potrebbe essere sbagliato. | Regolare le condizioni di buffer (ad esempio, sale alto, basso contenuto di sale, il pH.) |
Tabella 1 Risoluzione dei problemi.
| Sistema | Vantaggi | Svantaggi |
| E. coli |
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| P. pastoris |
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| Espressione di Baculovirus in cellule di insetto |
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| Bioreattori con sistemi di mammiferi |
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| Cellule in sospensione HEK 293F |
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Tabella 2. Vantaggi e svantaggi dei principali sistemi di espressione.
Discussion
Abbiamo sviluppato un metodo efficace semplice ed economico (costa PEI molto meno disponibili in commercio reagenti di trasfezione lipofile) per esprimere e purificare grandi quantità di proteine ricombinanti e complessi multi-subunità da cellule di mammifero. Trasfezione ottimale e l'efficienza di espressione possono essere raggiunti se il DNA plasmidico altamente puro (260/280 tra 1,8 e 2,0) viene utilizzato in combinazione con PEI come descritto nella sezione del protocollo. Le cellule devono essere coltivate in mezzi sierica- e senza antibiotici, quindi, una tecnica sterile è strettamente necessario per passaging e le cellule trasfezione per evitare infezioni costose e che richiede tempo. La vitalità cellulare dovrebbe essere del 90% o superiore e culture non dovrebbe essere cresciuto fino a densità superiori a 2,5 x 10 6 cellule / ml immediatamente prima di un transfezione, in quanto così facendo si riduce la resa di proteine. Per la trasfezione di successo, le colture devono contenere solo le celle singole o divisione. I cluster possono essere interrotte da vigorevortex ous 20 a 30 secondi (Figura 5). Il rapporto di ciascun plasmide usato nella co-trasfezione può essere variata dall'utente secondo la stechiometria dell'essere complesso studiato. Espressione efficienza può essere ottimizzato per la proteina di interesse, in modo che una volta espressione adatto può essere stabilita. Purificazione deve essere eseguita mantenendo il freddo campione proteico in ogni momento a ridurre il rischio di indesiderati degradazione proteolitica. La scelta delle variabili e buffer di purificazione è critica, in quanto possono interferire con elementi strutturali o siti attivi di alcune proteine, spesso con conseguente ridotta solubilità e / o perdita di attività enzimatica. Trasfezioni piccole dimensioni sono particolarmente utili per testare diversi costrutti per la purificazione di grandi complessi proteici.
Oggi, una grande varietà di metodologie alternative sono disponibili per l'espressione di proteine ricombinanti eucariotiche (Tabella 2). Ad esempio, Baculovirus espressione in cellule di insetto è ampiamente utilizzato per la sua elevata efficienza di trasduzione e la sua mancanza di citotossicità in confronto ad altre specie virali 6. Tuttavia, il processo di rendere il virus è in termini di tempo e la sua instabilità non consente al virus di essere immagazzinato per lunghi periodi. D'altro canto, sistemi di espressione di lievito offrono la possibilità di coltivare cellule di densità molto elevate nelle culture fermentatori, con conseguente alte rese di proteine 7. Ma non hanno ancora la piena varietà di modificazioni post-traduzionali necessarie per le proteine eucariotiche piegare correttamente e interagire con i loro partner proteici. HDAC3, per esempio, è espresso ma non si piega in E. coli. Tuttavia, quando espresso in cellule 293F, siamo stati in grado di purificare un enzima attivo nel complesso con la sua co-repressore (SMRT) e una molecola di inositolo tetrafosfato (IP4) 8, che non si trova nelle cellule procariote. Questo metodo ci ha anche permesso di purificare e risolvere il cristallo structure di HDAC1 interagire con MTA1 nel complesso nurd, che allo stesso modo viene attivato da IP4 9. Idealmente, vorremmo sempre esprimere proteine eucariotiche nel loro ambiente naturale, fisiologico. Sistemi di espressione di mammifero che impiegano cellule HEK 293-EBNA1 in bioreattori 10-12 sono stati descritti e produrre livelli molto alti di proteine, ma questi possono essere complessi da utilizzare.
Il nostro metodo è una semplice e accessibile alternativa ai sistemi di espressione in batteri, lieviti e bioreattori. Il metodo di espressione è veloce e non richiede l'impiego di attrezzature costose, soprattutto se l'atmosfera bottiglia rullo o pallone viene sostituito con il 5% di CO 2 e vengono utilizzati incubatori stringono standard. Abbiamo usato questi protocolli di co-trasfezione più plasmidi e purificare complessi con un massimo di cinque proteine con rese di> 1 mg / L di cultura. È interessante notare che, il sistema aiuta l'individuazione di stabili complessi ben educati. Per esempio, expressione del complesso binario di HDAC1 e Sin3A ha rese limitate di proteine, ma l'aggiunta di SDS3 portato a 5 volte maggiori quantità e quindi guida il biologo strutturale nella scelta dei costrutti adatti e complessi stabili per la cristallizzazione.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dr. Xiaowen Yang (servizio di clonazione PROTEX) per la preparazione dei costrutti di espressione utilizzati per questo lavoro e l'Università di Leicester core Biotecnologia Servizi. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio BBSRC, il Programma Fiducia Wellcome e sovvenzioni Senior Investigator WT085408 & WT100237 e BBSRC concedono RM31G0224.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
| Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
| Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
| Polyethylenimine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4ºC |
| Mammalian expression vector | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
| 15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
| Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |
References
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