Summary
Deze methode is ontwikkeld met als doel het leveren van een constante geneesmiddeloplossing via de halsslagader, de farmacokinetiek van nieuwe geneesmiddelen evalueren muismodellen.
Abstract
Wanneer voorstelt een geneesmiddel, drug combinatie of geneesmiddelafgifte in een nieuw systeem, moet men de farmacokinetiek van het geneesmiddel in kwestie in de studie model. Aangezien het gebruik van muizenmodellen vaak een belangrijke stap in preklinische ontdekking van geneesmiddelen en ontwikkeling van geneesmiddelen 1-8, moet een systeem drugs introduceren in muizen in een uniforme, reproduceerbare wijze te ontwerpen. Idealiter zou het systeem de inzameling van bloed monsters kunnen op regelmatige tijdstippen gedurende een ingestelde tijd natuurlijk. De mogelijkheid om geneesmiddelconcentraties door massaspectrometrie gemeten, heeft onderzoekers toegestaan om de veranderingen in plasmaspiegels van het geneesmiddel in de tijd volgen individuele muizen 1, 9, 10. In deze studie werd paclitaxel in transgene muizen geïntroduceerd als een continue arteriële infusie gedurende drie uur, terwijl bloedmonsters tegelijkertijd werden genomen door retro-orbitale bloedingen op vaste tijdstippen. Halsslagader infusies een mogelijk alternatief voor halsader infusies, wanneer factoren zoalsborsttumoren of andere obstakels maken halsader infusies onpraktisch. Met deze techniek paclitaxel concentraties in plasma en weefsel bereikt hetzelfde niveau ten opzichte jugularis infusie. In deze tutorial zullen we laten zien hoe succesvol katheteriseren de halsslagader door het opstellen van een geoptimaliseerde katheter voor het individu muismodel, vervolgens laten zien hoe in te voegen en maak de katheter in de muis halsslagader en haal het uiteinde van de katheter via de rug van de muis nek en haak de muis een pomp een gecontroleerde snelheid van geneesmiddelafgifte instroom leveren. Meerdere laag volume retro-orbitale bloedingen zorgen voor de analyse van plasma concentraties van het geneesmiddel in de tijd.
Introduction
Geneesmiddel infusie via de carotis betrouwbaar en reproduceerbaar uitgevoerd door optimalisatie apparatuur en technieken. De procedure is niet ingewikkeld, maar het vereist een nauwkeurige controle en aandacht voor detail. Superieure zorg en handigheid nodig zijn halsslagader isoleren en een katheter, die in het algemeen kan worden verkregen door oefening. Chirurgie door een ervaren technicus mag niet meer dan een uur. Na succesvolle operaties dient de muis normale en gezonde verschijnen (hoewel de muis kan reageren op de werkelijke geneesmiddelinfuus) en geneesmiddel (en) kunnen in een gecontroleerde uniforme continue dosering worden toegediend. Bloedmonsters moeten worden genomen van een andere dan de halsslagader site; retro-orbitale bloedingen bleken gemakkelijk te verzamelen en bevredigende analyse van geneesmiddelconcentraties.
Katheters van optimale grootte en de vorm zijn van onschatbare waarde in het uitvoeren van een succesvolle infusie 11. We vonden de katheters beschikbaar commercially vaak te groot en / of te flexibel zijn dat gemakkelijke toegang tot de muis carotide slagader. Het bleek beter om fashion katheters uit de polyethyleen buis gebruikt om de muis aan te sluiten op het infuus spuit. Dus alle slangen, connectors en naalden waren consistente afmetingen, die Infusiesamenstel vereenvoudigd. Met deze techniek is het niet noodzakelijk om de punt van de katheter te duwen in de slagader voorbij het punt waar het nog zichtbaar, en bloedtoevoer naar de halsslagader niet hersteld nadat de katheter aanvankelijk bevestigd. Dit vermindert het gevaar van doorboren de slagader of met de katheter geduwd door de hoge druk van de bloedstroom. De katheter ontwerp hoeft hierin niet voorzien van een "bump" om het op zijn plaats houden, dus het veiligstellen van de katheter goed met hechtingen en chirurgische tape is een prioriteit.
Infusies voorkeur gemeenschappelijke iv bolus injecties, een betere nabootsing van klinische toediening vangeneesmiddelen zoals taxanen 3, 12, 13. De hier beschreven techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld om infusie toe in muismodellen waarbij toegang tot de jugulaire of femorale vene werd uitgesloten door mammaire tumorgroei en / of overmatige vascularisatie van het inbrenggebied. Deze methode kan vaak aangewezen zijn, zelfs in tumorvrije muizen: hoewel het isoleren en catheterizing de carotis wordt iets meer invasieve, vonden we het beter om de halsader, omdat de neiging van de halsader muur te rippen resulteerde in meer mislukte inserties en mislukkingen te voltooien de 3 hr tijdsverloop.
Hoewel de hier getoonde resultaten zijn uit C57BL / 6J (in-house gefokt) muizen, we hebben deze techniek gebruikt om met succes bezielen paclitaxel in verschillende stammen van muizen, waaronder FVB en mixed-stammen, met de farmacokinetiek bij muismodellen transgenically gemanipuleerd volgen naar down-reguleren cellulaire transporter functies. Het bloed en weefsel monsters toonde verwachte niveaus van paclitaxel, in het bereik van het niveau na halsslagader infusies 1. Deze techniek kan worden verwacht dat even goed in andere muismodellen en met andere infusievloeistoffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol is goedgekeurd door het Fox Chase Cancer Center Institutional Animal Care en gebruik Comite en door het Laboratory Animal Facility, en gevonden te worden in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor humane behandeling van dieren.
1. Voorafgaande Voorbereiding
- Bereiding van catheter: Bereid een katheter van een kort stuk polyethyleen buis, gemodificeerd om een verdunde, afgestompte uiteinde (figuur 3A) te vormen. Maak meerdere katheters op voorhand en op te slaan voor onbepaalde tijd.
- Steek een bunsenbrander, en aan te passen aan een lage stabiele vlam vestigen. Houd slangen dicht bij de vlam te polyethyleen verzachten. Wanneer slangen begint te smelten, langzaam uit elkaar trekken van de twee uiteinden van een verdunde segment van de buis, ongeveer 0,25 mm OD creëren.
- Snijd een afgeschuind uiteinde ongeveer 0,75 cm langs dunne gedeelte. Dit verzekert voldoende buis worden vastgezet in slagader, zonder een te lange katheter.
OPMERKING: Een lange dunne uiteinde op the katheter heeft een neiging tot verstoppen. Een te lange uiteinde kan ook voldoende vloeistof houden om vloeibare volume capaciteit van de katheter significant veranderen. - Blunt de afgeschuinde einde door het passeren snel door de vlam - mits goed verwarmd, het einde wordt het licht afgeronde en vergroot. De tip haken iets terug, dat helpt het verankeren van de slang bij het inbrengen in de slagader.
- Snijd de slang 6.0 cm vanaf het punt waar het begint te dun. Dit maakt een zeer beheersbaar katheter, die lang genoeg is om door draad te verlaten en de hals te houden en werken comfortabel, maar kort genoeg om te voorkomen dat de muis knagen op teveel aan slangen of die teveel extra infusievolume initiële zoutoplossing wissen .
- Bereid een spuit van ongeveer 0,2 ml heparine oplossing, overgoten met een afgestompte naald. Breng de naald in het wijde uiteinde van de katheter (Figuur 3B). Vul catheter met heparine, en voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen inde slang. Stel de heparine spuit en katheter opzij op een steriele omgeving. Steriliseer katheters met gammastraling, door het plaatsen van de katheter (s) in een petrischaal, en blootgesteld aan 20 Gy van gamma bestraling. Als u geen toegang tot een gamma stralingsbron hebben, contact op met uw dier faciliteit om andere manieren van sterilisatie, zoals gas- of chemische sterilisatie te onderzoeken. Niet in een autoclaaf, zoals polyethyleen geen warmte kan worden gesteriliseerd.
- Oprichting van een zoutoplossing lood (Figuur 3B).
- Bereid een tweede spuit van ongeveer 0,5 ml steriele zoutoplossing, let daarbij goed op een bel-vrije lijn te garanderen.
- Knip een tweede stuk slang, ongeveer 15 cm, en glijden op de afgestompte injectienaald. Bevestig een aansluitpoort het vrije uiteinde van de slang.
- Test die stroom van zoutoplossing onbelemmerd door vlot voortbewegen van een klein volume zoutoplossing door de leiding. Gebruik deze zoutoplossing leiding na inbrengen van de katheter, om de stroom door te controlerende katheter, en de lijn van bloed spoelen. Stel de zoutoplossing spuit opzij op een steriele omgeving.
- Voorafgaand aan de operatie, steriliseren apparatuur in een autoclaaf, of als alternatief door gas sterilisatie of glazen kraal sterilisatie.
- Bereid steriel chirurgisch gebied.
- Veeg bankje en microscoop oppervlakken met een ontsmettingsmiddel zoals 70% ethanol of chloordioxide. Bedek bankje en microscoop basis met een schone wegwerp, absorberend kussen.
- Bereid een chirurgische bord door ze met twee lagen van schoon, absorberend papier, stevig vastgemaakt met plakband.
- Leg alle chirurgische benodigdheden (zoals die worden genoemd in Materials List), zodat ze gemakkelijk bereikbaar.
- Snijd drie lengtes van steriel hechtmateriaal, 8 cm per stuk, en opzij gezet met andere benodigdheden. Plaats een poort waar het gemakkelijk beschikbaar zijn (Figuur 3B).
2. Chirurgie
- Bereiding van het dier
- Anesthetize muis door blootstelling aan 2-3% isofluraan in anesthesie kamer verbonden met precisie vaporizer. Trekken muis uit de kamer, en scheren haar van de muis zijn nek / bovenlichaam, en onder het rechter oor (site van de katheter exit). Dien veterinaire vaseline oogzalf voor de ogen tot droog te voorkomen terwijl ze onder narcose. Verzekeren het dier niet wakker tijdens chirurgische preparaten doordat muis voldoende tijd inhalatiekamer voor prep (minimaal twee minuten), of door toediening isofluraan muis via een neuskegel tijdens prep. Keer terug muis om anesthesie kamer.
- Wanneer de muis is voldoende inert, te verplaatsen naar steriele chirurgische gebied, plaatst anesthesie neuskegel op neus en mond van de muis, en af te leiden van de stroom van isofluraan neuskegel. Bevestig de juiste verdoving door knijpen poot met een pincet; wanneer de muis niet reageert, ga dan naar de volgende stap.
- Plaats de muis op de rug, met de kop gericht naar deonderzoeker. Bevestig de oren, voorpoten en achterpoten-poten naar chirurgische bord met plakband of andere begrenzers apparaat om de muis stil te houden. Reinig de incisie met povidon-jodium en 70% ethanol.
- Isolatie van halsslagader
- Maak een 1 cm gesneden lengterichting enigszins rechts van de middellijn van de hals. Tang om vet en spier om de trachea (figuur 4A) bloot te scheiden. Zoek de halsslagader die parallel loopt aan de luchtpijp (Figuur 4B).
- Zorgvuldig gebruik een tang om aparte fascia bovenop de slagader (Figuur 4C). Lichtjes trek de nervus vagus afgezien van de halsslagader, en steek een tang in de ruimte tussen. Voorzichtig geopend tang om een gat in de fascia creëren, en zorgvuldig weg te trekken van de zenuw van de slagader, uit de vork in de slagader in de buurt van het strottenhoofd (voorste einde), up (posterior) zo ver mogelijk (minimaal 3 mm) ( figuur 4D).
- Opruimen elke reresterende fascia totdat de slagader is goed geïsoleerd (Figuur 4E). Voeg een druppel zoutoplossing om de operatie gebied af weefsel vochtig en dus minder bros en minder gevoelig voor scheuren willekeurig houden.
- Hechtdraad plaatsing en slagader voorbereiding katheterinsertieplaatsen (figuren 4, 5).
- Gebruik een tang om een zijden hechtdraad te trekken onder de slagader. Bind een stevige knoop aan het afsluiten van de slagader zo ver in de richting van de voorste mogelijk (Figuur 4F).
- Teken een tweede draad onder de slagader. Bind een intrekbare knoop om tijdelijk afsluiten van de slagader zo ver in de richting van het achterste mogelijk (Figuur 4F).
- Opneming van een derde draad onder de slagader. Das een zeer losse knoop tussen de eerste twee hechtingen, te worden gebruikt om snel de katheter na plaatsing (figuur 4G) veilig te stellen.
- Houd uiteinden van alle hechtingen uit de weg door ze te bevochtigen met een beetje van 70% ethanol.
- Met de hechtdraad, pak de onderste knoop te trekken de slagader licht gespannen. Nick de slagader boven, maar zeer dicht bij, de voorste hechtdraad (figuur 4H). Wees voorzichtig niet te diep te snijden, maar check de gleuf om te controleren of de opening niet verstopt is.
- Verwijder-heparine gevuld katheter uit spuit naald, in een poging te voorkomen dat er grote luchtbellen aan beide uiteinden. Manipuleren van de katheter om schuine positie met comfortabele hoek, over het algemeen naar beneden, en iets naar rechts (voor rechtshandigen).
- Terwijl het vasthouden aan de hechtdraad om de slagader te houden resterende licht gespannen, breng dan katheter in gleuf (Figuur 4I). Gebruik de tang om de voorste hechtdraad te houden en trek de slagader naar beneden over katheter (omhoog te duwen overdreven met de katheter kan de afgeschuinde einde veroorzaken aan de slagader punctie). Zorgvuldig de katheter en anterior hechtdraad los.
- Bevestig de katheter vast door de knoop van de middelste hechtdraad, bij de ingang van de katheter in de slagader. Maak een strakke driedubbele knoop, maar zeker zo strak niet te trekken als om de stroom door de katheter belemmeren. Verder de katheter beveiligen door binden hem met de voorste hechtdraad, onder de ingang van de slagader.
- Bevestig de zoutoplossing leiden tot de katheter via de stekker opnieuw proberen voorkomen dat er luchtbellen in de lijn.
- Pak de uiteinden van de achterste hechtdraad en trek om de knoop los te maken. Manoeuvreren de hechtdraad beneden de slagader, over het uiteinde van de katheter (niet verwijderen van de draad). Bloed moet vloeien in de katheter; als er geen bloedstroom voorzichtig wiebelen katheter proberen de vernauwing te verwijderen.
- Wanneer stroom lijkt vrij, gebruik maken van de laatste draad (van het achterste hechtdraad) om een extra knoop, iets boven het midden hechtdraad.
- Met een tang in elke hand, gebruik een pincet vasthouden aan de katheter juist onder de voorste hechtdraad, en de andere, op een knik in de katheter zodat het gemakkelijk buigt opzij. Herhalen om een tweede knik maken. Hierdoor kan het vrije uiteinde van de katheter wordt getrokken naar het achterhoofd van de muis, zonder dat de punt van de katheter zijdelings tegen de wand van de slagader draaien.
- Zet de muis op de (linker) kant, het bijhouden van de neuskegel geplaatst over de mond en neus, en het reinigen van de incisie gebied met 70% ethanol en povidonjood. Maak een kleine incisie (ongeveer 4 mm) onder en achter het rechter oor. Gebruik een tang om de open klep van de huid te houden, tijdens het werken de stompe holle sonde onder de huid om een kanaal te creëren door middel van de wang, om de holte in de nek. Het is raadzaam om de sonde rond de speekselklier brengen, in plaats van te proberen te gaan tussen het drukstuk en de huid. Gebruik een tang om voorzichtig te bevrijden van een ruimte voor de sonde om af te sluiten.
- Rijg poort plug / katheter door sonde om af te sluiten in de nek. Niet te hard trekken; Zorg ervoor dat de katheter niet breken of vernauwen de bloedvaten of organen.
- Dien actueel pijnstillende om borst incisie, en dicht wond met zijde of nietjes.
- Verwijder de muis uit narcose, en laat dier te herstellen in een schone, verwarmde ruimte (plaats kooi op de top van een verwarmingselementof onder een warmtelamp) gedurende ten minste 30 min.
3. Infusion
- Aliquots van 5 mg / ml oplossing van paclitaxel / methanol.
- Meet 50 mg paclitaxel in een 15 ml centrifugebuis. Voeg 10 ml steriel methanol. Cap buis. Draai met de hand of op een roterende schudinrichting bij kamertemperatuur totdat poeder wordt opgelost.
- Aliquot 500 pi oplossing in 20 kleine, vriezer veilig buizen, en bewaar bij -20 ° C.
- Dooi individuele portie bij kamertemperatuur of 37 ° C waterbad, onmiddellijk voor de infusie.
- Bereid de infusiepomp (Figuur 6).
- Een lang lengte van polyethyleen buis van ongeveer 40 cm. Bevestig een stompe naald aan één uiteinde, en een aansluitpoort voor de andere.
- Opstellen geneesmiddel in een injectiespuit met een bekende inwendige diameter (grootste programmeerbare pompen de diameter van de injectiespuit vereisen teneinde de snelheid va berekenene pomp arm). Bevestig de naald aan de spuit en laad het geneesmiddel door de naald en slangen.
- Situeren de spuit in de pomp volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Prime de pomp zodanig dat het geneesmiddel wordt soepel stroomt uit de connector plug, en het is klaar voor infusie.
- Bevestig de muis om te pompen.
- Houd de muis gestage en gebruik de hemostaat om katheter, dicht bij de haven plug klem. Stekker en vervangen door de connector aan de spuit en slang.
OPMERKING: Blood kan beginnen terug te stromen door buizen. - Snel toedienen snelle pomp om het volume van de catheter te verwijderen (empirisch berekend door waarnemen van de hoeveelheid van 6 cm buis), dan onmiddellijk naar het gewenste infusiesnelheid.
- Houd de muis gestage en gebruik de hemostaat om katheter, dicht bij de haven plug klem. Stekker en vervangen door de connector aan de spuit en slang.
- Doorgaan Paclitaxel infusie gedurende drie uur de tijd natuurlijk.
- Monitor slangen af en toe te controleren op lekkage op kruispunten want dit is vaak een teken van een blokkade in de stroom naar de muis.Let op de muis voor verwachte of onverwachte reacties op de infusie (lusteloosheid of hyperactiviteit, tekenen van ongemak).
- Afhankelijk van de lengte en de aard van de infusie, kan de muis niet eten of drinken, maar zorg ervoor dat de toegang tot voedsel en water te voorzien volgens de vastgestelde beleid van de instelling. Wees je bewust van de mogelijkheden voor het drogen van de muis via het verzamelen van grote hoeveelheden bloed.
- Blijf de kooi warm te houden met een verwarmingselement of lamp, tenzij de muis lijkt te verlangen om te ontsnappen aan de hitte te blijven. Wanneer het dier niet wordt gedood binnen enkele uren na de operatie, voeren programma voor post-operatieve behandeling van dieren, waaronder steriele huisvesting en behandeling van postoperatieve pijn.
- Houd goed in de gaten op de muis, vooral in de eerste paar minuten, om het te verzekeren niet trek de slang door hyperactiviteit, of irritatie van de buis (wat een teken van een slechte inbrengen kan zijn). Als de muis is niet over-actief, constant monitoring is misschien niet nodig, maar controleer de muis regelmatig om zeker te zijn het dier niet verstrikt raken in de slang. Harnas en tuiersysteem zijn commercieel verkrijgbaar, maar het gebruik valt buiten het bestek van dit protocol.
- Het verzamelen van monsters.
- Verzamel bloedmonsters periodiek door submandibulaire of retro-orbitale bloedingen (Als protocol geen gebruik van borstkanker modellen, beschouwen bloedafname via een jugulaire katheter tegelijkertijd de halsslagader katheter). Wees voorzichtig niet te trekken aan de infuuslijn. Als het verzamelen van retro-orbitale bloedingen, licht verdoven van de muis met een inhalatie-anestheticum (bv methoxyfluraan) dus men hoeft niet te grijpen door het nekvel om de muis te beveiligen.
- Spin bloed in hemocrit centrifuge bloedcellen gescheiden van plasma. Gebruik een file of diamant-tip pen naar de buis te scoren op het gezicht van fasescheiding. Breken buis en het verzamelen van plasma alleen, in kleine, diepvries-safe buis. Bewaar bij -80 ° C tot analyse.
OPMERKING: Indien een hemocrit centrifuge is niet beschikbaar, overdragen bloedmonster in micro-centrifugebuis en rotatie in een micro-centrifuge met hoge snelheid bloedcellen gescheiden van plasma. Verzamelen plasma in een tweede buis, en bewaren bij -80 ° C. - Euthanaseren muis door CO 2 stikken. Verzamel materiaal (ongeveer 20-50 mg) van de organen van de rente en flits bevriezen in vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 ° C tot analyse.
4. Sample Analysis
OPMERKING: Alle monsters voor dit protocol werden geanalyseerd door middel van een extern laboratorium met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC - MS / MS), die berekende de paclitaxel concentraties als volgt:
- Uittreksel paclitaxel uit monsters. Homogeniseer weefselmonster in 0,1% azijnzuur, 50% methanol voor extractie. Extract paclitaxel door vloeistof / vloeistof extractie met methyl-tert-butylether (MTBE) versterkt met een interne analoge (docetaxel) standaard. Verwijder MTBE en droge monsters. Resuspendeer in 50% acetonitril, 0,1% azijnzuuroplossing.
- Bereid kalibratiestandaarden. Voeg een bekende concentratie van paclitaxel C57BL / 6 matrix dient een uiteindelijke reeks standaarden te verkrijgen (van 1 tot 20.000 ng / ml voor plasmamonsters van 0,1 tot 5000 ng / ml voor weefselmonsters). Extract normen in tweevoud, volgens dezelfde methode als voor de proefmonsters hierboven. Meet paclitaxel piek in monsters met behulp van HPLC / MS / MS met behulp elektrosprayionisatie.
- Bereken concentratie met de oppervlakteverhouding van paclitaxel interne standaard. Gebruik kalibratiestandaarden een standaardcurve en geïnterpoleerd proefmonsters maken door geschikte op de curve. Normaliseren concentratie van onderzoek monsters door het gewicht vanaf monster voor homogenisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Paclitaxel distributie op voorspelbare patronen tijdens een 3 uur doseringsschema van 15 min snelle infusie, gevolgd door 165 min langzame infusie.
Figuur 1 toont een vergelijking van halsader-infusie plasma paclitaxel concentraties en halsslagader-infusies. De paclitaxel concentraties dalen snel in de eerste 15 min na een eerste hoog volume infusie, en daarna afvlakken in de komende 150 min. Ter vergelijking, paclitaxel niveaus in een slechte infusie beginnen relatief lage en zweven boven en beneden gehele test. Dit werd waarschijnlijk veroorzaakt door een verstopping in de regel begin van de infusie. Registraties van de test tonen de muis had weinig tot geen externe reactie op de infusie bevestigende het idee van inferieure toediening van het geneesmiddel. Figuur 2 toont de relatieve niveaus van paclitaxel in de lever en hersenweefsel, en bloedplasma, eind de 3 uur infusie.
jove_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 1:. Plasma paclitaxel niveaus tijdens de halsslagader en halsader infusies Curves vertegenwoordigen plasma paclitaxel concentraties in individuele muizen. Elke muis ontving een bifasisch infusie uit een initieel hoge snelheid, 15 min infusie van 0,42 mg / kg / min, onmiddellijk gevolgd door een langzame, 165 min infusie van 0.021mg / kg / min. De oppervlakte onder de curve (AUC) voor carotis infusie was ongeveer 59 pg / ml ∙ min versus AUC voor halsader infusie van ongeveer 37 pg / ml ∙ min. De halfwaardetijd van paclitaxel berekend uit de carotis gegenereerd voor infusie krommen was 10 min en jugulaire infusie was 11 min. Carotis infusie toont ongeveer gelijk niveau van concentratie van het geneesmiddel in vergelijking met jugularis infuus. Continu lage concentraties, of concentraties die cyclus op en neer, vaak represent een slechte infuus.
Figuur 2:. Paclitaxel concentratie weefsel Onmiddellijk na de 3 uur paclitaxel infusie en verzamelen van het laatste bloedmonster werd de muis gedood en lever en hersenen weefselmonsters werden verzameld. Paclitaxel concentratie in plasma en weefsels werden verworven door massa-spec analyse. Deze gegevens vertegenwoordigen monsters verzameld van de halsslagader Infusion-Mouse in figuur 1.
Figuur 3: Chirurgische parafernalia. (A) Katheter Productie: Trekken de eigen katheters blijft beneden materiële kosten, terwijl de rezoeker op maat grootte en vorm van de katheter om de muis leeftijd en grootte (B) Bereid voor de operatie:. Drie (3) zijden hechtingen, ongeveer 8 cm per stuk; Steriele poort plug; Saline spuit en lood; Katheter, verbonden aan heparine injectiespuit.
Figuur 4: Bereiding van halsslagader en de katheter inbrengen. (A) Snijd door de huid, bewegen opzij klieren en een tang om grove aparte vet aan spier bloot. (B) Gebruik een tang om voorzichtig aparte spier naar de rechterkant van de luchtpijp bloot. Halsslagader wordt zichtbaar als grootste, dikwandige schepen geworden, dat parallel loopt aan de luchtpijp. (C) Break fascia rond slagader. (D) Aparte nervus vagus van de halsslagader. (E) Ga door het verwijderen van fascia tot carotid wordt volledig geïsoleerd langs holte. (F) Hechting permanente knoop in voorste uiteinde, en misstapknoop bij posterior extremiteit. (G) Derde hechtdraad wordt schroefdraad onder de halsslagader en zeer losjes geknoopt. (H) Artery is gejat net boven anterior hechtdraad. ( I) Plaats katheter in nick in slagader. Pak anterior hechtdraad met een tang om slagader naar beneden trekken via katheter. (J) Secure katheter in de halsslagader met alle drie hechtingen.
Figuur 5:.. Hechting plaatsing Schematische weergave van operatieplaats voor en na katheter installatie A correspondeert met foto figuur 4G, met toevoeging van een inkeping in de slagader, zoals in figuur 4H.
Figuur 6:. Schema van infusieset-up Spuit is gevuld met drugs, en afgedekt met een stompe naald. Polyethyleen lijn hecht spuit om carotis katheter. Pomp langzaam comprimeert spuit, op een uniforme dosering leveren rechtstreeks in de bloedbaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Halsslagader infusie is een belangrijke techniek in dit onderzoek van paclitaxel farmacokinetiek. Halsslagader infusie is een methode om snel de gehele bloedsomloop 14 verdelen drug. De 3 uur infusie is een dichter nabootsing van klinische toediening van geneesmiddelen zoals taxanen dan bolus injecties. De operatie betrouwbaar kan worden uitgevoerd door een enkel individu, chirurgie is relatief kort, en rendement zijn> 75%. Na monsters worden verzameld, moeten ze worden geanalyseerd door de geschikte methoden. We gebruikten massaspectrometrie paclitaxel in plasma en weefselmonsters bepalen. Om deze techniek verder te valideren, stuurden we bloed- en weefselmonsters om een onafhankelijk laboratorium voor analyse. Deze data werd uitgezet als individuele plasma-paclitaxel concentratiecurven voor elk dier getest (figuur 1), en de verdeling van paclitaxel werd vergeleken in verschillende weefsels (Figuur 2). In elk geval is imlangrijk om de beste methode overwegen drugdistributie en / of metabolisme te analyseren, afhankelijk van het geneesmiddel en systeem plaats. Andere mogelijkheden voor het meten van verschillende geneesmiddelen kunnen omvatten HPLC-UV of immunoassays 2.
Twee primaire factoren die essentieel zijn voor een succesvolle carotis catheterisatie zijn goed ouderwets katheters en superieure slagader isolement. Fashioning katheters volgens de grootte van het muismodel voorop. Als de katheter diameter te dik, zal het inbrengen in de slagader al moeilijk, terwijl een te dun katheter moeilijker te beveiligen en waarschijnlijk verstoppen voor of tijdens de infusie is. De hoek en de scherpte van de kathetertip moet ook in een matige bereik; een tip dat te scherp is kan de vaatwand doorboren, terwijl een tip dat is te saai zal het moeilijk zijn om in te voegen in de slagader. De metingen die hier gegeven werden afgeleid met behulp van tien weken oude C57BL / 6J muizen, ongeveer 20 g, als een model template. De metingen moeten worden geschaaldomhoog of omlaag empirisch aan individuele modellen aan te passen.
Isolatie van de halsslagader moet gevoelig, specifieke behandeling onnodige beschadiging aan weefsel te voorkomen en grootschalige bloeden te voorkomen. Onderhuidse vet kan in het algemeen gemakkelijk worden gescheiden met een lage tot medium scherpe tang. Spierweefsel de halsslagader moet normaal tot fijn getipt tang over de diagonaal van de spiervezels gescheiden. Als een uitgebreidere kloof is nodig, moet de technicus uiterst voorzichtig om te voorkomen dat de kleine bloedvaten scheuren zijn. Zodra de halsslagader zichtbaar is, zal er nog steeds een behoorlijke hoeveelheid fascia die moet verwijderd worden tweezed van de slagader met fijne getipt tang zijn. Tenslotte moet de nervus vagus worden gescheiden van de halsslagader zonder schade aan ofwel. Wanneer de carotis goed geïsoleerd, moet het mogelijk zijn om de tang eronder in, met een lege ruimte aan weerszijden van de slagader (zie figuur 4e).
Wanneer trouble schieten slechte infusies, beginnen met de herziening van de instructies op de pomp om zeker te zijn dat de onderzoeker de juiste wijze is geprogrammeerd de pomp om de verwachte dosering te leveren. Daarna zorgvuldig overwegen het volume dat zal de invoering in het proefdier veranderen. De verdunning van het geneesmiddel moet worden berekend, zodat de dosering volume is het geval: het volume moet niet te groot zijn voor het dier te tolereren, en idealiter zal geen significante invloed op de bloeddruk zijn; maar het volume moet groot genoeg zijn voor de pomp om betrouwbaar te leveren, en zal een gestage stroom aan klompen op knooppunten vermijden creëren. Als klompen uitgegroeid tot een regelmatig voorkomen, overwegen over te schakelen naar een kleinere gauge (grotere diameter) naald en slangen. Verder, als plasma gehalte geneesmiddel niet verwachte niveau bereikt, moet de onderzoeker controleren de muizen post-mortem te bepalen of de catheter blijft goed geplaatst in de slagader en vrij vloeiend, en wijzigen de vorm / grootte van katheter nodig.
De usefulness van deze werkwijze kan worden beperkt door factoren zoals de grootte en algemene gezondheid van de patiënt en de beoogde duur van de infusie. De operatie en de infusie een reeds noodlijdende onderwerp belasten. Zelfs in een gezond dier, halsslagader katheter is slechts geschikt voor korte termijn infusies, gewoonlijk enkele uren tot enkele dagen. Bedenk wat methoden pijnstiller wordt gebruikt als muizen vertonen ongemak in reactie op het geneesmiddel infusie, zoals herhaaldelijk aanbrengen van topische anesthesie plaatsen wond of preventief systemische analgetica. Het zal nodig zijn om alle dierlijke werk van de lokale dierlijke regulerende organisatie of IACUC goedgekeurd te hebben, om de juiste machtigingen te verkrijgen om deze procedure uit te voeren. Indien het noodzakelijk is een langere infusie, of de muis overleven infusie gedurende langere tijd moet infusie alternatieve methoden onderzocht.
Na de knie halsslagader perfusies in de studievan de farmacokinetiek van paclitaxel, we zijn van plan om deze techniek te gebruiken in de toekomst om de effecten van andere drugs, en Abcc10 modulators in de C57BL / 6J en FVB muizen en andere muismodellen onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag de FCCC Laboratory Animal Facility erkennen voor hun steun aan dit project. Wij danken Wolfe Laboratories, Inc. voor hun hulp bij het analyseren van paclitaxel in plasma en weefsel. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health verleent K01CA120091 aan EHB, en CA06927 aan Fox Chase Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene tubing 0.024” OD X 0.011” ID | Braintree Scientific, Inc. | PE10 | |
| 3 Blunted needles (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | NB-30 | |
| Stainless steel port plug (28 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | PP-28 | Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal. |
| 2 Stainless steel connector plugs (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | C-30 | |
| Three 1 cc syringes | Becton, Dickinson and Co. | 309659 | |
| Sterile 0.9% Saline solution | Hospira | 0409-7984-37 | |
| Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution | Braintree Scientific, Inc. | HGS | |
| Silk suture | Braintree Scientific, Inc. | SUT-S 113 | |
| Vanna Scissors (micro-scissors) | World Precision Instruments | 14122 | This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well. |
| Hartman Mesquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501705 | |
| Betadine Swabsticks | Perdue Products L.P. | BSWS1S | |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1160-01 | May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia. |
| Paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Micro Capillary Tube Sealant | Fisher Scientific | 02-678 | |
| C57BL/6J mice | Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred | ||
| API 4000 Q-Trap mass spetrometer | Applied Biosystems |
References
- Gallo, J. M., Li, S., Guo, P., Ma Reed, K., J, The Effect of P-Glycoprotein on Paclitaxel Brain and Brain Tumor Distribution in Mice. Cancer Research. 63 (16), 5114-5117 (2003).
- Sonnichen, D. S., Relling, M. V.
- Gianni, L., et al. Nonlinear Pharmacokinetics and Metabolism of Paclitaxel and Its Pharmacokinetic / Pharmacodynamic Relationship in Humans. Journal Clinical Oncology. 13 (1), 180-190 (1995).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Nonlinear Pharmacokinetics of Paclitaxel in Mice Results from the Pharmaceutical Vehicle Cremophor EL. Cancer Research. 56 (9), 2112-2115 (1996).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Determination of paclitaxel and metabolites in mouse plasma, tissues, urine and faeces by semi-automated reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 664, 383-391 (1995).
- Bradshaw-Peirce, E. L., Eckhardt, S. G., Gustafson, D. L. A Physiologically Based Pharmacokinetic Model of Docetaxel Disposition: from Mouse to Man. Clinical Cancer Research. 13, 2768-2778 (2007).
- Eiseman, J. L., et al. Plasma Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Paclitaxel in CD2F1 Mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 34 (6), 465-471 (1994).
- Schinkel, A. H., et al. Normal Viability and Altered Pharmacokinetics in Mice Lacking mdr1-type (drug-transporting) P-glycoproteins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 4028-4033 (1997).
- Fraser, I. J., Dear, G. J., Plumb, R., L’Affineur, M., Fraser, D., Skippen, A. J. The Use of Capillary High Performance Liquid Chromatography with Electrospray Mass Spectrometry for the Analysis of Small Volume Blood Samples from Serially Bled Mice to Determine the Pharmacokinetics of Early Discovery Compounds. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 13 (23), 2366-2375 (1999).
- Bateman, K. P., et al. Reduction of Animal Usage by Serial Bleeding of Mice for Pharmacokinetic Studies: Application of Robotic Sample Preparation and Fast Liquid Chromatography – Mass Spectrometry. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 754 (1), 245-251 (2001).
- Berndt, K., Vogel, J., Buehler, C., Vogt, P., Born, W., Fuchs, B. A new method for repeated drug infusion into the femoral artery of mice. J. Am. Assoc. Lab Animal Sci. 51 (6), 825-831 (2012).
- Fergusson, G., Ethier, M., Zarrouki, B., Fontés, G., Poitout, V. A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat. J. Vis. Exp. (78), (2013).
