Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Il cancro è una malattia molto complessa che è stata oggetto di studi per più secoli. Il cancro al seno è il tipo più comune di cancro; si verifica principalmente nelle donne, ma può verificarsi anche sporadicamente nei maschi ^27. La malattia è causata principalmente dalla perdita di meccanismo di controllo divisione cellulare governo che a sua volta porta ad una crescita infinita di cellule nel corpo. Questi guasti possono essere causate da diversi meccanismi: in primo luogo, le cellule sane devono segnali di crescita delle cellule circostanti per proliferare mentre le cellule tumorali fanno loro fattori di crescita e aumentano l'espressione dei fattori di crescita recettori ottenendo un tasso proliferativa superiore ^1; secondo, le cellule tumorali sono meno sensibili ai segnali anti-proliferativi ^8; terzo, per bilanciare il numero di cellule nella morte cellulare corpo è anche richiesto; Tuttavia, le cellule tumorali sfuggono dalla morte cellulare programmata, apoptosi chiamati ^14; quarto, le cellule aderiscono matrici extracellulariper sopravvivere ma le cellule tumorali possono crescere senza la necessità di attaccamento e resistenti alle anoikis ^19; Quinto, l'attivazione della telomerasi aggira il accorciamento dei telomeri e impedisce la senescenza replicativa ^21; ultimo ma non meno importante, saltando di DNA di controllo di qualità dopo i risultati mitosi nel contenuto genetico alterato ^15,16. Per identificare oncogeni o soppressori tumorali che svolgono un ruolo in questa proliferazione non regolamentati, esperimenti di crescita tumorale nei topi sono cruciali.

La crescita del tumore primario in genere non è la ragione principale della morte. La migrazione delle cellule tumorali dal sito primario a un sito secondario, chiamato metastasi, è la principale causa di morte nella maggior parte dei pazienti affetti da cancro ^22. Metastasi comporta l'invasione delle cellule tumorali, intravasation, viaggiando attraverso la circolazione, evitando immune attacco, stravaso e la crescita nel sito secondario. La transizione epitelio mesenchimale (EMT) è un processo fondamentale inmetastasi e coinvolge un interruttore in profili di espressione genica producendo cellule con maggiore motilità e l'invasività, che sono pre-requisiti per la cella metastasi ^12. Poiché il processo canceroso è la risultante di una combinazione di diverse azioni, tra cui le interazioni reciproche tra cellule tumorali, le cellule stromali e cellule pro- ed anti-infiammatorie, un approccio in vitro al cancro spesso non fornisce piena comprensione del processo canceroso. Analogamente, trattamenti antitumorali impatto ai vasi tumorali spesso non possono essere studiate in vitro, così l'uso di approcci in vivo è inevitabile.

Per studiare la progressione del cancro della mammella, sono stati sviluppati diversi metodi sperimentali. Il modello più diffuso è l'iniezione sottocutanea di cellule di carcinoma mammario in topi ^5. In questa configurazione sperimentale, il ricercatore può introdurre una vasta gamma di alterazioni di una linea cellulare di scelta in vitro (cioèupregulation, downregulation di proteine) e iniettare le cellule sotto la pelle. Anche se questo metodo è semplice e il processo di iniezione è semplice, senza necessità di eseguire un intervento chirurgico su topi, il sito in cui il tumore viene iniettato non rappresenta l'ambiente tumore mammario locale e l'assenza di questo ambiente può causare lo sviluppo del cancro al seno che differisce da quella osservata nella patologia umana. In secondo luogo, i topi geneticamente ingegnerizzati sono usati spesso come uno strumento in vivo per studiare la progressione del cancro al seno. In questo modello, oncogene (cioè PyMT, Neu) espressione è azionato da un promotore specifico tessuto mammario che porta alla formazione di spontanea del tumore mammario s. Questa configurazione sperimentale è utile per studiare l'aspetto trattamento della malattia iniettando farmaci o anticorpi, mentre il controllo del formato del tumore in tempo ^3. Tuttavia, l'allevamento di questi topi con altri ceppi di topi carenti o mutati in un gene di interesse potrebbe anche dare insiritti nel ruolo di diverse proteine ​​in crescita del tumore al seno ^24. Il rovescio della medaglia di questo modello è che è soggetta a variazioni in termini di dimensioni del tumore e il numero. Inoltre, il livello di espressione del transgene dipende dal sito di integrazione nel genoma e può cambiare da un ceppo di topi all'altro ^4. In questo modello, l'espressione del transgene può essere ottenuto da tutte le cellule con origine epiteliale che nella malattia umana, solo una sottopopolazione di cellule esprimono l'oncogene o downregulate livelli oncosoppressori ^26. Per studiare le metastasi, le cellule del cancro al seno possono essere iniettati per via endovenosa (un modello chiamato metastasi sperimentale) ^25. Tuttavia, questo approccio ricapitola solo il processo metastatico parzialmente; elude il requisito per le cellule tumorali di invadere e intravasate, e inizia dal punto in cui le cellule tumorali sono facilmente presenti nella circolazione.

Nel nostro lavoro, utilizziamo una iniezione ortotopicomodello di ioni per studiare il coinvolgimento dei geni di interesse nella progressione del cancro al seno ^13. Abbiamo iperespressione della proteina nelle cellule di cancro al seno umano e iniettarli nel cuscinetto adiposo mammario di NOD / SCID gamma (NSG) topi. Questo metodo è vantaggioso in molti modi: permette cambiamenti genetici molto rapidi e diverse nella linea cellulare iniettato, che copre l'intero processo di progressione del cancro al seno dalla crescita del tumore primario metastasi in siti patologicamente pertinenti, e fornisce anche un buon modello sperimentale per studiare l'impatto di trattamenti terapeutici nelle fasi precoci o tardive della malattia. Inoltre, utilizzando questo modello si può studiare il ruolo di stromale contro proteine ​​cellulari derivate da cancro in progressione della malattia utilizzando topi o cellule geneticamente modificati. Sebbene iniezioni sottocutanee sono più facili da eseguire, modelli ortotopico danno luogo ad una popolazione di cellule di cancro più tumorigenica più metastatico. Pertanto, i risultati ottenuti mediante iniezione sottocutaneas potrebbe essere falsi negativi o falsi positivi ^6,17 incoraggiare l'uso di modelli ortotopici per studiare la crescita del tumore.

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato il benessere degli animali del Leiden University Medical Center (LUMC).

1. Preparazione di cellule, Strumenti e Mice

1. Un giorno prima del funzionamento, la barba NOD / SCID gamma (NSG) topi dal quarto capezzolo alla linea mediana e pesare i topi per verificare che tutti i topi hanno pesi all'incirca comparabili.
2. Autoclave una forbice, due pinzette e due pinze zanzara rette (Figura 1A).
3. Il giorno di funzionamento, lavare l'adenocarcinoma mammario umano (MDA-MB-231) cellule che sarà iniettato una volta con tampone fosfato (PBS), pH 7,4 e trypsinize cellule. Quench la tripsina aggiungendo 10 ml di siero contenenti DMEM supporti sulla parte superiore delle cellule. Centrifugare le cellule a 1200 rpm per 7 min a RT per rimuovere il siero risospendendo cellule sia in PBS o nei mezzi senza siero. Centrifugare di nuovo per rimuovere le tracce di siero completamente. Risospendere le cellule in PBS omedia.
4. Contare le cellule con un emocitometro e calcolare la quantità di cellule. Utilizzare 500.000 cellule / topo in non più di 150 ml. Opzionale per PBS o supporti, risospendere le cellule in matrigel.
   NOTA: Determinare la quantità di cellule a seconda del tipo cellulare utilizzato.
5. Mettere le cellule in provette da microcentrifuga sterili e tenerli su ghiaccio.
6. Riempire uno 50 ml provetta da centrifuga conica con 35 ml di PBS pH 7.4 e un altro 50ml conica provetta da centrifuga con 70% di etanolo. Immergere tamponi di cotone in ogni provetta.

2. iniezione ortotopico

1. Eseguire l'intervento in una cappa sterile per mantenere un'atmosfera sterile. Anestetizzare il mouse sottocutanea iniettando mix Xylazin / ketamina alla dose di 10 mg / kg, rispettivamente 100 mg / kg di peso corporeo. Fissare il mouse su una piastra elettrica. Confermare il successo di anestesia per la mancanza di reazione al pizzico punta.
   NOTA: Se uno non è molto familiare con procedure chirurgiche, la chirurgia può richiedere più tempo. Organizzarele anestesia dosaggio di conseguenza.
2. Applicare pomata oftalmica sugli occhi di topi, per evitare gli occhi secchi.
3. Pulire la zona rasata utilizzando il batuffolo di cotone imbevuto in etanolo preparato al punto 1.6. Alternando scrub con betadine e alcol tre volte in modo circolare rotante di distanza dal sito di incisione pianificata deve essere eseguita. In alternativa, utilizzare ionoforo come disinfettante.
4. Fai una piccola incisione tra il quarto capezzolo e la linea mediana, con una forbice e fare una tasca inserendo il tampone di cotone inumidito con PBS pH 7.4.
5. Utilizzare una pinzetta per esporre il cuscinetto adiposo mammario. Osservare il cuscinetto di grasso per il suo colore bianco.
6. Spremere il cuscinetto adiposo con l'altra pinzetta dalla sua base; così facendo, esporre completamente il cuscinetto di grasso (Figura 1B) per eseguire iniezioni facilmente.
7. Omogeneizzare la miscela di cellule pipettando su e giù. Aspirare delicatamente 50 ml di sospensione cellulare in una siringa da insulina e iniettare inil cuscinetto adiposo mammario tenendo l'ago in senso orizzontale. Confermare iniezione di successo controllando per rigonfiamento del cuscinetto adiposo.
8. Rilasciare il cuscinetto adiposo delicatamente.
9. Suturare l'incisione utilizzando un driver ago. Effettuare tre combinazioni ruotando la sutura intorno al conducente ago in senso orario, in senso antiorario e in senso orario. Dovrebbero essere utilizzati due nodi per sutura.
   NOTA: Assicurarsi che i nodi sono stretti altrimenti topi possono aprire i punti di sutura.
10. Dopo l'intervento chirurgico, iniettare un analgesico, come Temgesic a 0,05-0,1 mg / kg di peso corporeo, per via sottocutanea al fine di alleviare il dolore.
11. Non lasciare gli animali incustoditi fino guadagnano coscienza e mantenere prona sternale. Mettere tutti gli animali in diverse gabbie fino a quando non sono completamente recuperati.
12. Per mantenere la sterilità, utilizzare gabbie autoclave e acqua. Modificare le gabbie ogni tre giorni per mantenere l'ambiente pulito.

3. prelievo di organi per l'analisi

1. Allagiorno della raccolta, 8 settimane dopo l'impianto delle cellule, riempire 15 ml provette coniche con 3 ml di soluzione di Bouin per ogni mouse. Inoltre, utilizzare due 15 ml tubi riempiti con 5 ml di soluzione di formalina per topo.
2. Anestetizzare gli animali iniettando Xylazin / ketamina, alla dose di 10 mg / kg a 100 mg / kg di peso corporeo per via sottocutanea. Attendere che l'animale perde punta ritiro pizzico reflex.
3. Fissare l'animale con aghi su una base. Fare un lungo, verticale mediana un'incisione con le forbici. Fare due incisioni orizzontali proprio sotto la gamba anteriore e al di sopra della gamba posteriore. Esporre il tumore da appuntare la pelle alla base. Misurare il volume del tumore usando un calibro.
4. Dissociare il tumore della pelle con le forbici. Snap congelare una parte del tumore in azoto liquido per l'isolamento dell'RNA. Posizionare l'altra parte, nel tubo da centrifuga conica riempita di formalina per eseguire immunoistochimica seguente embedding di paraffina.
5. Prendere delicatamente i polmoni. Posizionare ilpolmone sinistro nella soluzione di Bouin. Mantenere il polmone in soluzione per 3 giorni. Osservare superficiale foci metastatici chiaramente all'occhio nudo. Facoltativamente, inserire il polmone destro in formalina di verificare micrometastasi con ematossilina e eosina (H & E) colorazione.
   NOTA: Anche se, metastasi polmonari osservati frequentemente nel cancro al seno, si potrebbe anche voler raccogliere ossa, fegato, cervello e milza analizzare metastasi. Le cellule presso l'area metastatico sono più densi e morfologicamente diverso e quindi possono distinguere facilmente dal tessuto polmonare.
6. Un giorno dopo il raccolto, aspirare la soluzione di formalina da 15 ml tubi e sostituire con il 70% di etanolo. Incorpora i tessuti in paraffina e condurre studi di immunoistochimica.
7. Per l'analisi del sangue, aprire la cavità toracica con le forbici. Prelevare 450 ml di sangue tramite puntura cardiaca. Porre il campione di sangue in una provetta contenente 50 ml di 3,2% di sodio citrato. Dopo il sangue viene raccolto, facendo girare a 2.000 g per 10 kmn. Conservare i campioni di plasma a -20 ° C fino all'utilizzo.
   NOTA: Ci sono diverse altre tecniche di raccolta del sangue comunemente utilizzati nella pratica ²⁰ e la tecnica che deve essere utilizzato dipende apparato sperimentale e la scelta dello scienziato. Se non è richiesta campione di sangue, eutanasia animale in base al protocollo animali o secondo le linee guida dell'istituzione.

Applicazione di successo del "modello di cancro al seno ortotopico" si basa su una corretta iniezione di cellule nel cuscinetto adiposo mammario. Errori sperimentali come inoculo imprecisa di cellule o perdite potrebbero portare a variazioni nelle dimensioni del tumore o addirittura l'assenza di un tumore che porta alla formazione di una struttura simile alla ricerca di un pad grasso mammario iniettato con un buffer di controllo (Figura 2A). Il tasso di crescita del tumore dipende dalla natura della linea cellulare iniettato e, in generale, può essere osservata attraverso la pelle dei topi (Figura 2B). Diversamente esperimenti in vitro, il tasso di crescita delle cellule tumorali non sia costante nel tempo in vivo (Figura 2C). A causa di ipossia e mancanza di nutrienti, aree necrotiche possono formare e queste aree influenzeranno il tasso di crescita del tumore (Figura 2D). Inoltre, il gene di interesse può influenzare una certa fasedi progressione del cancro (precoce o tardiva), quindi sulla seconda configurazione sperimentale, crescita tumorale potrebbe iniziare veloce ma rallenta alla fine o viceversa.

Prestare attenzione durante la procedura di rimozione del tumore; gestione rigorosa può influenzare la struttura del tumore e porta a problemi di analisi immunoistochimica. L'area intorno al tumore può visualizzare grandi navi che sorgono dal rimodellamento vascolare. Questi vasi hanno un ruolo cruciale nella rimozione dei rifiuti prodotti e fornire il tessuto tumorale con sostanze nutritive e ossigeno agevolando in tal modo la crescita del tumore (Figura 2B). La formazione di neovasi (angiogenesi) può essere indagato dalla colorazione del tumore per i marcatori neovessel (cioè CD31, CD34).

Raccolta dei polmoni in soluzione di Bouin aiuta a visualizzare superficiale foci metastatici sui polmoni (Figura 3A). Il foci può essere distinto dal tessuto polmonare mediante l'un colore pallidod sono facili da rilevare 18. Metastasi può essere espresso come il numero di foci formate sulla superficie del polmone. Tuttavia, la formazione di foci è dipendente dalla linea cellulare; cellule non aggressivi provocano micrometastasi solo o nessuna metastasi affatto. Micro metastasi può essere facilmente identificato con una colorazione ematossilina / eosina in paraffina tessuto polmonare (Figura 3C).

Figura 1:. Materiali e Metodi (A) apparecchiature chirurgiche necessarie per l'iniezione di cellule di cancro al seno nel cuscinetto adiposo mammario (B) immagine Rappresentante che mostra l'esposizione del cuscinetto adiposo mammario..

Figura 2:. Panoramica del seno crescita tumorale ortotopica in topi di controllo (A) di media o (C) del volume del tumore è stata misurata con un calibro utilizzando la seguente formula:.. Il volume del tumore = 0.5 x Lunghezza x Larghezza x Larghezza (D) la morfologia complessiva del tumore viene analizzato con H & E colorazione. I sta per cellule infiltrate, T indica le cellule tumorali e N sta per zona necrotica. (Bar Scala = 200 micron)

Figura 3: metastasi tumorali ai polmoni (A) I polmoni di topi che sono stati iniettati ortotopicamente con cellule tumorali (MDA-MB-231).. L'incubazione dei polmoni in soluzione di Bouin espone il foci metastatici su polmoni. (B) polmoni di topi di controlloche ha subito l'iniezione ortotopico di mezzi di controllo. Come si vede chiaramente, questi polmoni controllo non presentano metastasi macroscopiche. (C) H & E colorazione mostra la regione metastatico nel tessuto polmonare. L'inserto mostra una bassa panoramica di ingrandimento del tessuto polmonare contenente focolaio metastatico. Il rettangolo tratteggiato nero l'inserto è rappresentato nel grande pannello. Le cellule tumorali sono indicati dalla linea tratteggiata bianco; nota dei nuclei più grandi e più densi. (Barra della scala nero = 100 micron, bar scala bianco = 20 micron)

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.