La migrazione dei neuroni è regolata da numerosi fattori autonomi e non cellulari. Questo protocollo mostra come l'elettroporazione in utero possa essere utilizzata per determinare se un fenotipo in un topo transgenico è dovuto all'interruzione di un meccanismo intrinseco cellulare o alla compromissione dell'interazione tra il neurone e il suo ambiente.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
L'induzione di proteine Cancellazione Through In Utero Elettroporazione per definire deficit in migrazione neuronale in modelli transgenici
In questo articolo
Sommario
Abstract
Delezione genetica utilizzando il sistema Cre-Lox in linee di topi transgenici è un potente strumento utilizzato per studiare la funzione della proteina. Tuttavia, salvo in modelli molto particolari Cre, la cancellazione di una proteina in tutta una popolazione di tessuti o cellule, spesso conduce a fenotipi complessi derivanti da molteplici meccanismi che interagiscono. Determinare se un fenotipo risultati di interruzione di un meccanismo autonomo cella, che è intrinseco alla cella in questione, o da un meccanismo autonomo non cellule, che risulterebbe dal deterioramento dell'ambiente di quella cella, possono essere difficili da distinguere. Per ottenere una visione in funzione delle proteine in un contesto in vivo, in utero elettroporazione (IUE) consente di eliminare gene in un piccolo sottogruppo di cellule all'interno della corteccia in via di sviluppo o di qualche altra regione del cervello selezionata. IUE può essere utilizzato per indirizzare specifiche aree cerebrali, tra cui il telencefalo dorsale, telencefalo mediale, ippocampo, o eminenza gangliare. Questo facilita l'osservazione of conseguenze della cella gene delezione autonoma nel contesto di un ambiente sano. Lo scopo di questo protocollo è quello di mostrare come IUE può essere utilizzato per analizzare un difetto nella migrazione radiale in una linea di topi transgenici floxed, con un'enfasi sulla distinzione tra le cellule effetti autonomi autonomi e non cellulari di delezione della proteina. Confrontando il fenotipo risultante dall'eliminazione gene nell'intera corteccia contro gene delezione IUE mediata in una popolazione di cellule limitata, una maggiore comprensione della funzione delle proteine nello sviluppo cerebrale può essere ottenuto che utilizzando due tecniche in isolamento.
Introduzione
Migrazione Radial è un processo fondamentale per primo sviluppo corticale. Essa dipende da una varietà di fattori cellulari autonomi, come uscita corretta mitosi e la differenziazione neuronale, polarità cellulare, regolazione della dinamica del citoscheletro e l'espressione dei recettori transmembrana, così come non-cellulari fattori autonomi, come la formazione del ponteggio gliali radiali e secrezione di orientamento migratorio molecole 1-3. Poiché rottura di uno di questi meccanismi può compromettere migrazione neuronale in un modello di topo transgenico 4-8, determinare la causa di fondo di un difetto di migrazione può essere un process....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla University of Animal Care comitato etico di Ottawa, aderendo alle linee guida del Consiglio canadese Animal Care.
Preparazione 1. Pre-chirurgici e materiali
- Plasmidi Preparazione:
- Preparare plasmidi usano il Qiagen MegaPrep secondo il protocollo del produttore. Inoculare almeno 400 ml di brodo LB con batteri trasformati per garantire una resa elevata DNA e incubare durante la notte.
- Risospendere plasmide in 100-200 microlitri TE ad una concentrazione finale di almeno 5 mg / mL. Aliquota DNA e conservare a -20 ° C. Se la concentrazione è troppo bassa, non ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Diverse regioni del cervello possono essere bersagliate mediante elettroporazione variando l'orientamento degli elettrodi a paletta sulla testa dell'embrione (Figura 2). Per tutte le parti del proencefalo, il plasmide viene iniettato nel ventricolo laterale (il romboencefalo può essere bersagliato iniettando nel quarto ventricolo). In generale, posizionare gli elettrodi in modo che la linea retta tra di essi passi attraverso la regione di interesse, con il DNA che migra verso l'elettrodo positivo. Per be.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Due delle principali sfide in svolgimento in electroporations utero sono 1) la prevenzione embrione letalità e 2) riduzione della variabilità tra electroporations. Uno dei fattori più importanti nella prevenzione letalità è la qualità ago, come aghi smussati infliggere più danni per l'embrione. Quando si taglia l'ago, mantenere la punta più a lungo possibile, pur consentendo una gocciolina visibile di 0,1-0,2 ml di fluido apparire dopo una pompa del paddle piede (Figura 1J). Se.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Ringraziamenti
Siamo in debito con Pierre Mattar e Freda Miller per la loro assistenza con l'elettroporazione in utero e con Noel Ghanem e Bensun Fong per la creazione di diagrammi. Ringraziamo Linda Jui e Jason G. MacLaurin per l'eccellente assistenza tecnica. L'attrezzatura è stata supportata dal Centro per il recupero dall'ictus.
Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio da HSFO e OGS a D.S.S. e da una sovvenzione CIHR a R.S.S.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ECM 830 Elettroporatore a onda quadra | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | Solo elettroporatore - acquistare i cavi separatamente (45-0204) |
| 1250FS Interruttore a pedale per ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0211 | La paletta del piede è necessaria per l'elettroporazione a mani libere |
| Pinzetta | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 (5 mm) 45-0488 (7mm) | Elettrodi a pinza in platino |
| Femtojet | Eppendorf | 920010504 | Microinjector |
| Griphead 0 | Eppendorf | 920007414 | Contiene l'ago tirato |
| Supporto capillare universale | Eppendorf | 920007392 | Collega la testa di presa al tubo |
| Tubo di iniezione | Eppendorf | 920007431 | Collega il supporto capillare al Femtojet |
| Comando a pedale | Eppendorf | 920005098 | Pedale per iniezione a mani libere |
| Punte per microloader | Eppendorf | 930001007 | Punte per il caricamento dei tubi capillari estratti |
| Plasmid Mega Kit | Qiagen | 12181 | 5 QIAGEN-tip 2500, Reagenti, Tamponi |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Colorante |
| atossico Extra Fine Bonn Forbici | scienza fine | 14084-08 | Per tagliare gli aghi |
| Forbici per lo strabismo di Bonn | Strumenti per la scienza fine | 14084-09 | |
| Pinze Graefe | Strumenti per la scienza fine | 11050-10 | |
| Divaricatori Colibri | Strumenti per la scienza | 17000-03 | |
| Cucitrice per | per la scienza | 12031-07 | Per clip |
| da 7 mmCastroviejo Porta-aghi Strumenti | medici | SNH-6737 | Dritto, con blocco |
| Estrattore per aghi | Narishige | PC-10 | Per l'estrazione di microcappillari |
| Microcapillari Drummond | 1-000-800 | 0,4 mm di diametro interno tubi capillari in vetro |
Riferimenti
- Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neur....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
