La resezione ileocolica viene comunemente eseguita in diverse malattie umane; tuttavia, si sa poco riguardo all'impatto della resezione intestinale sulle malattie chirurgiche. Questo articolo fornisce istruzioni sull'esecuzione della procedura nei topi con grande successo, fornendo un mezzo per studiare gli effetti della resezione ileocolica in modelli di malattia.
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Articolo metodologico
Murini ileocolica resezione intestinale con anastomosi primaria
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le resezioni intestinali sono spesso necessarie per il trattamento di malattie che coinvolgono il tratto gastrointestinale, con il morbo di Crohn e il cancro del colon che sono due esempi comuni. Nonostante la frequenza di queste procedure, rimane una significativa lacuna di conoscenza nella descrizione degli effetti intrinseci della resezione intestinale sulla fisiologia dell'ospite e sulla fisiopatologia della malattia. Questo articolo fornisce istruzioni dettagliate per una resezione ileocolica con anastomosi primaria end-to-end nei topi, nonché aspetti essenziali della cura perioperatoria per massimizzare il successo post-operatorio. Se seguita attentamente, questa procedura produce un tasso di sopravvivenza a lungo termine del 95%, nessuna mancata crescita e riduce al minimo le complicanze post-operatorie dell'ostruzione intestinale e della perdita anastomotica. Le sfide tecniche legate all'esecuzione della procedura nei topi sono un ostacolo al suo ampio utilizzo nella ricerca. Le competenze descritte in questo articolo possono essere acquisite senza precedenti esperienze chirurgiche. Una volta padroneggiata, la procedura di resezione ileocolica murina fornirà uno strumento riproducibile per studiare gli effetti della resezione intestinale in modelli di malattia umana.
Introduzione
La resezione ileocolica (ICR) è una procedura comune eseguita sia in situazioni emergenti che elettive per una varietà di malattie. Il morbo di Crohn e i tumori del colon sono le due indicazioni più comuni per l'ICR. In entrambe le malattie, la recidiva nell'intestino nel sito dell'intervento chirurgico rappresenta un grave problema clinico. I tassi di recidiva locale per il cancro del colon rimangono un problema anche con le resezioni più aggressive1. Dopo l'ICR nella malattia di Crohn, la malattia più frequentemente (fino all'80%) si ripresenta nell'ileo neo-terminale a 1 anno dall'interventochirurgico 2. Dato l'impatto di queste due malattie e la loro recidiva dopo l'intervento chirurgico, è importante comprendere i fattori intestinali locali dopo l'ICR, che possono avere influenze intrinseche sulla storia naturale di queste malattie. Inoltre, è anche importante considerare la guarigione anastomotica dopo l'ICR. Nel primo periodo post-operatorio, le perdite anastomotiche possono avere conseguenze devastanti per i pazienti, con conseguenti interventi chirurgici ripetuti, creazione di stomia, morbilità significativa e persino mortalità3. Nonostante l'importanza di questo argomento, la nostra attuale comprensione della guarigione anastomotica rimane agli inizi come oggetto di ricerca. I modelli animali di ICR, in particolare i topi, sono un'eccellente piattaforma per studiare la guarigione intestinale e anastomotica dopo un intervento chirurgico.
Un modello murino di ICR è stato inizialmente sviluppato da Helmrath et al. per essere utilizzato come modello della sindrome dell'intestino corto4. Gli autori hanno sperimentato vari regimi dietetici e dimensioni di sutura per ottimizzare la sopravvivenza degli animali dopo l'ICR. Hanno concluso che l'alimentazione con dieta liquida nel periodo perioperatorio e l'utilizzo di suture monofilamento 9-0 hanno portato a una sopravvivenza post-operatoria ottimale dell'88%. Da questa pubblicazione iniziale, l'ICR nei topi che rimuovono il 50% dell'intestino tenue è stato utilizzato in diversi studi per esplorare le dinamiche della resezione massiva dell'intestino tenue e la risposta adattativa della crescita nel tentativo di sviluppare nuove terapie per la sindrome dell'intestino corto5,6.
La prima applicazione del modello murino ICR alla malattia di Crohn ha utilizzato il modello murino IL-10-/-, che sviluppa spontaneamente la colite7. Gli autori hanno scoperto che dopo l'ICR questi animali hanno sviluppato un'infiammazione nell'ileo neo-terminale simile a quella osservata nei pazienti con malattia di Crohn post-operatoria e che questa infiammazione dipendeva dalla presenza di batteri7. Più recentemente, questo modello è stato utilizzato per esplorare i cambiamenti batterici indotti dall'ICR. Nella malattia di Crohn c'è una disbiosi associata con relative diminuzioni di batteri noti per avere proprietà antinfiammatorie e aumenti di specie invasive di batteri8,9. L'associazione vale nei casi di recidiva post-operatoria10. Due studi hanno cercato di identificare i cambiamenti microbici derivanti dall'ICR. Il primo ha utilizzato topi privi di IL-10 ed ha eseguito l'elettroforesi su gel denaturante per confrontare la somiglianza batterica tra l'intestino tenue e il colon dopo ICR11. Questo studio ha dimostrato che le popolazioni batteriche sono diventate simili nell'intestino tenue e nel colon dopo l'ICR. Uno studio successivo ha utilizzato topi wild type e pirosequenziamento 16s per la classificazione filogenetica delle specie batteriche post-operatorie. Questo studio ha dimostrato un marcato cambiamento nelle specie batteriche derivante dalla sola chirurgia, con le specie di Clostridium che diventano dominanti, nonché un aumento dei Υ-proteobatteri. I risultati hanno anche confermato i risultati dello studio precedente con popolazioni simili trovate nell'intestino tenue e nel colon dopo l'ICR12.
ICR è una procedura comune per i pazienti con cancro del colon che coinvolge il cieco e il colon ascendente, e sta diventando sempre più riconosciuto che la risposta dell'ospite alla chirurgia probabilmente contribuisce alla recidiva del tumore sia locale che a distanza13. Nonostante questa osservazione, i modelli di ICR non sono stati utilizzati per lo studio del cancro del colon-retto e della recidiva post-operatoria. Comprendere i cambiamenti immunologici sistemici e locali derivanti dall'ICR sarà importante per studiare le terapie future. I potenziali percorsi coinvolti nella recidiva del cancro dopo ICR includono la regolazione dei fattori di crescita, che possono salvare le cellule dall'apoptosi e stimolare la proliferazione, la distruzione meccanica del tumore con la perdita di cellule e la perdita della sorveglianza immunitaria attraverso l'immunosoppressione post-operatoria13,14.
I modelli murini di ICR hanno il potenziale per essere un potente strumento per lo studio della sindrome dell'intestino corto, del morbo di Crohn e del cancro del colon. Possono anche fornire lezioni su come prevenire le complicanze anastomotiche post-operatorie precoci definendo ulteriormente i percorsi cellulari e biochimici coinvolti nella guarigione dell'anastomosi di nuova costruzione. Uno dei principali ostacoli all'utilizzo del modello ICR murino è la difficoltà tecnica. L'anastomosi intestinale richiede l'uso di 8-0 o sutura 9-0, un microscopio operatorio e formazione in tecniche microchirurgiche. L'obiettivo di questo articolo è fornire istruzioni chiare su come eseguire l'ICR nei topi con l'obiettivo di utilizzare questa procedura nei modelli di malattia.
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Protocollo
Protocolli di uso animale sono stati approvati dal comitato Health Science cura degli animali e l'uso presso l'Università di Alberta.
1. Preparazione degli strumenti, Animali e Setup Operativo
- Trasferire animali ad una nuova, pulita gabbia assente di tutto solido cibo 24 ore prima della procedura. Essi possono avere libero accesso all'acqua e dieta liquida ad lib fino al momento della procedura.
- Autoclavare tutti gli strumenti necessari per la procedura. Superficie operativo pulito e anestetico cono con il 70% di etanolo.
- Impostare la superficie operativa con il microscopio operatorio, macchina anestetica e forniture in un modo che è comodo per il chirurgo. I gomiti del chirurgo dovrebbe essere permesso di riposare comodamente sul tavolo operatorio, con le mani e le braccia non ostruite dalle attrezzature. Strumenti, suture, tamponi di cotone, e una siringa da 10 ml devono essere collocati in una posizione che consenta un facile accesso durante la procedura.
- Impostarelampade di calore aeree per fornire sia calore per l'animale durante la procedura e la luce per la superficie operativa.
- Riempire un tubo da 50 ml con soluzione fisiologica 0,9%, e una provetta da 1,5 ml con vaselina e posto vicino alla superficie operativa.
NOTA: Sterilizzare tutti gli strumenti e le forniture chirurgiche. Poiché l'intestino viene sezionato, la procedura stessa non è sterile. E 'considerata pulita-contaminata. Adottare misure per evitare l'introduzione di fonti esogene di infezione.
2. ileocolica resezione con anastomosi
- Indurre l'anestesia con la somministrazione di 4% isoflurano con un tasso di flusso di ossigeno di 2 L / min con cono dal vaporizzatore isoflurano fino a quando la frequenza respiratoria animali rallenta a circa 30-40 atti / min. Applicare una pressione moderata per il piede posteriore del mouse per garantire che non vi è alcuna risposta al dolore prima di iniziare la procedura. A questo punto, abbassare isoflurano al 2% e il flusso di ossigeno di 0,5 l / min. Intermittentecontrollare la risposta al dolore durante la procedura e regolare flusso isoflurano conseguenza.
- Applicare vaselina per gli occhi contro l'essiccamento durante l'intervento chirurgico, e immobilizzare il mouse nella posizione supina con gli arti fissati con del nastro trasparente.
- Pulire l'addome con la soluzione povodine / di iodio, e cambiare in nuovi guanti sterili.
- Fare un incisione cutanea 1,5 centimetri sulla linea mediana superiore dell'addome con punta acuminata dissezione forbici per esporre la fascia e del peritoneo. Aprire lo strato fasciale / peritoneale in modo simile attraverso la linea alba per esporre il contenuto peritoneale.
- In contrasto con gli esseri umani, il cieco del mouse si trova in genere nel quadrante superiore sinistro dell'addome. Una volta identificato, afferrare delicatamente il cieco con una pinza e consegnarlo attraverso l'incisione. Usare tamponi di cotone inumiditi a ventaglio di circa 3 cm di ileo terminale estende dal cieco su una garza sterile drappeggiato sulla superficie addominale (Figura 1A).Assicurarsi che l'intestino esposto è tenuto umido con 0,9% di soluzione salina durante l'interezza della procedura.
- Identificare l'arteria ileocecale dirama l'arteria mesenterica superiore lungo il colon (Figura 1A) utilizzando il microscopio operatorio. Sezionare i tessuti avascolari adiacenti all'arteria ileocecale, circondare e legare l'arteria con una cravatta di seta 5-0. Quindi, individuare l'apporto di sangue regionale per l'ileo terminale e scegliere un punto transection 1,5-2 cm prossimalmente alla giunzione ileocecale. Legare i rami a questa sezione di ileo come sopra. Dividere le arterie con micro dissezione forbici.
- Dividere le porzioni ischemici di ileo e del colon di assicurare un adeguato apporto di sangue alle estremità sezionati (Figura 1B). È spesso utile spatolate ileo dividendolo con un angolo di 30 gradi per aumentare il diametro del lume modo che corrisponde più strettamente il colon. Una volta che la porzione di intestino ileocecale è stato rimosso, allineare laestremità sezionati di ileo e del colon sulla garza, assicurando i confini di ogni mesenterici sono allineati.
- Costruire l'anastomosi approssimando la fine transected dell'ileo alla fine transected del colon mediante interrotto 8-0 suture in polipropilene (Figura 1C). Il primo punto è posto al confine mesenterica, con suture successive poste ogni 0,5 mm, fino anastomosi ileocolica è a tenuta stagna. Quando si passa l'ago di sutura attraverso l'ileo e colon, in modo che il bordo tagliato non viene arrotolata, e morsi di aghi sono mm 0,5 dai bordi tagliati dell'intestino. Una anastomosi tipico richiede da 14 a 16 punti staccati. Verificare l'integrità e la pervietà delle anastomosi al termine tirando un tampone di cotone prossimale a distale sopra l'ileo per forzare i contenuti attraverso l'anastomosi. Piccoli contenuto intestinale dovrebbero passare liberamente nel colon senza perdite anastomotica.
- Sciacquare l'intestino esposto con 3-4 ml di soluzione fisiologica 0,9% dalla siringa da 10 mlper lavare via feci dalla superficie delle viscere, e fornire dell'intestino nella cavità peritoneale. Utilizzo di 2 ml di soluzione salina allo 0,9% sciacquare la cavità peritoneale, e poi drenare il liquido applicando una leggera pressione alla parete addominale laterale.
- Chiudere l'incisione con una corsa 3-0 seta sutura, e interrompere il flusso di isoflurano. Somministrare 0,1 mg / kg di oppiacei lunga durata d'azione per via sottocutanea -buprenorphine- per il controllo del dolore post-operatorio.
- Osservare gli animali sotto la lampada di calore fino a quando non sono mobili poi trasferirli in una gabbia continuamente riscaldato.
3. Cura post-operatoria e monitoraggio
- Monitorare animali in gabbia continuamente riscaldato per segni di sofferenza per il resto della giornata. Di trasferire gli animali torna alla casa di cura degli animali in una nuova gabbia sterile con accesso a dieta liquida e acqua ad lib. Gli animali possono essere inseriti in gruppi di 3-4.
- Eseguire un controllo sugli animali post-operatorie la mattina seguente,garantire gli animali non appaiono in difficoltà. Alimentare solo dieta liquida. Se appaiono a disagio (ad esempio, la postura ingobbita o attività minima) somministrare un'ulteriore dose di buprenorfina per via sottocutanea. Controllare gli animali ancora una volta nel pomeriggio del giorno post-operatorio 1.
- La mattina del giorno post-operatorio 2 gli animali dovrebbero apparire pienamente recuperato. La prova dei consumi alimentari e stooling sono segnali positivi di ripresa. Ora, riprendere una dieta solida chow per gli animali.
NOTA: Segnali di pericolo includono postura ingobbita, povero governare, e l'attività minima. Se i segni di sofferenza sono importanti gli animali devono essere sacrificati. - Euthanize gli animali inducendo profonda anestesia con isoflurano 4% ad un tasso di O 2 flusso di 2 L / min fino a quando gli animali non rispondono alla pressione del piede. Eseguire dislocazione cervicale, e osservare i segni di una corretta euthanization.
- Linee guida variano, in modo da fare riferimento alle raccomandazioni delle istituzioni in materia di indicazionie metodi appropriati di euthanization nei topi.
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Risultati
I tassi di mortalità e il cambiamento di peso dopo l'intervento.
I tassi di mortalità seguenti ICR in 129S1 topi wild type sono in genere ~ 5%. La causa più comune della moralità è occlusione intestinale al anastomosi. Altre cause di mortalità comprendono l'deiscenza anastomotica ed ernia interna per occlusione intestinale.
La perdita di peso può essere visto fino a 14 giorni dopo l'intervento, ma è generalmente non significativa. I topi tendono a riacquistare completamente pes...
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Discussione
Il murino ICR è un modello potente che può essere usato per studiare gli effetti della chirurgia nelle malattie intestinali. Questo articolo descrive un metodo per l'esecuzione di ICR nei topi con un tasso di successo del 95% e nessun problema con difetto di crescita, come risulta da pesi stabili fino a 28 giorni dopo la procedura. Le sfide più importanti per il successo ICR includono evitare ostruzioni intestinali al anastomosi e perdite anastomotiche.
Elementi tecnici per l'interve...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere i contributi di finanziamento del Canadian Surgical Research Fund, dell'Edmonton Civic Employees Research Assistance Fund, e dell'Alberta IBD Consortium attraverso una sovvenzione di Alberta Innovates.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| LD101 dieta liquida per roditori | testdiet.com | ||
| 0,9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Microscopio operatorio salino di qualità per iniezione |
| Ziess | |||
| Vaporizzatore anestetico isoflurano | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurano | Abbott | 05260-05 | |
| Lastra | di vetro Per piano operatorio | ||
| Cotton fioc | |||
| Micro Castroviejo Porta aghi, curvo | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo forbici dritte | Precision Instruments | 555530S | |
| Forbici da dissezione | World Precision Instruments | 15922 | |
| Pinze per medicazione x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| suture pretagliate in seta 5-0 | Ethicon | A182H | Per legatura dei vasi |
| 8-0 Prolene su ago BV130-5 | Ethicon | 8732H | Per anastomosi |
| 3-0 Seta su aghi FS-2 | Ethicon | 8665G | Per la chiusura della parete addominale |
| Vaselina | |||
| Siringa da 10 ml | BD biosciences | ||
| Povidone-iodio 7,5% scrub chirurgico | betadine.com | ||
| Lampade termiche | |||
| buprenorfina 0,3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
Riferimenti
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