Isolamento e arricchimento di Human derivate da tessuto adiposo cellule stromali di Osteogenesi avanzata

Sommario

L'eterogeneità trascrizionale all'interno delle cellule stromali umane di derivazione adiposa può essere definita a livello di singola cellula utilizzando marcatori di superficie cellulare e geni osteogenici. Descriviamo un protocollo che utilizza la citometria a flusso per l'isolamento di sottopopolazioni cellulari con aumentato potenziale osteogenico, che può essere utilizzato per migliorare la ricostruzione scheletrica craniofacciale.

Abstract

Le cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BM-MSC) sono considerate il gold standard per le applicazioni di ingegneria tissutale basate su cellule staminali. Tuttavia, il processo mediante il quale devono essere prelevati può essere associato a una significativa morbilità del sito donatore. Al contrario, le cellule stromali di derivazione adiposa (ASC) sono più facilmente abbondanti e più facilmente raccolte, il che le rende un'alternativa interessante alle BM-MSC. Come le BM-MSC, le ASC possono differenziarsi in cellule del lignaggio osteogenico e possono essere utilizzate in applicazioni di ingegneria tissutale, come la semina su scaffold per l'uso in difetti scheletrici craniofacciali. Le ASC sono ottenute dalla frazione vascolare stromale (SVF) del tessuto adiposo digerito, che è una miscela eterogenea di ASC, cellule endoteliali vascolari e murali, cellule muscolari lisce, periciti, fibroblasti e cellule circolanti. L'analisi citofluorimetrica ha dimostrato che il profilo dei marcatori di superficie per le ASC è simile a quello per le BM-MSC. Nonostante diversi rapporti pubblicati stabiliscano marcatori per il fenotipo ASC, c'è ancora una mancanza di consenso sui profili che identificano le cellule osteoprogenitrici in questa popolazione eterogenea. Questo protocollo descrive come isolare e utilizzare una sottopopolazione di ASC con una maggiore capacità osteogenica di riparare difetti calvari di dimensioni critiche.

Introduzione

La natura eterogenea delle popolazioni di cellule staminali non è ancora completamente compresa e rimane un grave ostacolo allo sviluppo di applicazioni terapeutiche clinicamente efficaci basate sulle cellule staminali. Uno dei modi più comuni per caratterizzare una popolazione eterogenea di cellule staminali è quello di impiegare un metodo di selezione cellulare, come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), per separare le cellule in base ai loro profili di espressione dei marcatori di superficie. Man mano che i metodi di smistamento diventano più complessi, diventa possibile identificare sottopopolazioni funzionali di cellule più distinte. Le tecnologie basate sulla microfluidica stanno diventando sempre più frequentemente utilizzate nell'analisi dell'espressione genica a livello di singola cellula. La reazione a catena quantitativa della polimerasi multiplexata (qPCR) all'interno di un chip microfluidico consente un'analisi trascrizionale efficace e affidabile ad alta risoluzione su singola cellula. ^1-5

In uno studio precedente che utilizzava il profilo trascrizionale di una singola cellula di 48 geni, è stata osservata una notevole eterogeneità trascrizionale tra gli ASC. ⁶ Tuttavia, la distribuzione dei geni MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 ha mostrato una forte associazione con un gruppo di cellule che possiedono profili trascrizionali altamente osteogenici. Per isolare le cellule in base a questo profilo di espressione genica osteogenica, i modelli di espressione dell'antigene di superficie sono stati correlati con i modelli di trascrizione e successivamente è stato scoperto che l'espressione del marcatore di superficie dell'endoglina (CD105) è strettamente correlata con l'aumentato potenziale di differenziazione osteogenica degli ASC. Indipendentemente dall'espressione di CD105, l'espressione del recettore di superficie Thy-1 (CD90), una proteina di membrana legata al glicosil-fosfatidilinositolo precedentemente dimostrato da Chen et al. essere associata alle cellule osteoprogenitrici, era anche correlata con l'espressione genica osteogenica. ^6,7 Questi risultati offrono l'opportunità di isolare in modo prospettico sottopopolazioni all'interno del più ampio pool eterogeneo di ASC con maggiore capacità osteogenica per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo basate su cellule.

Protocollo

NOTA: Tutti i campioni dei pazienti sono stati ottenuti con il consenso informato, e protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati da Stanford University Institutional Review Board (protocollo # 2188 e # 9999).

1. Isolamento delle cellule e Cultura:

1. Ottenere tessuto adiposo sottocutaneo umano da pazienti di sesso femminile sani sottoposti a lipoaspirazione elettiva del ventre, fianchi, e / o regione della coscia in anestesia locale / generale. Assicurarsi che Institutional Review Board (IRB) di approvazione è stata ottenuta per il protocollo di isolare ASC da tessuti umani, e seguire le precauzioni di sicurezza istituzionali mentre si lavora con questi materiali.
2. Per ottenere il SVF dal tessuto adiposo lipoaspirated, prima lavare il lipoaspirato tre volte con volumi uguali di 1x tampone fosfato salino (PBS) sterile. Con attenzione aspirare ed eliminare lo strato acquoso inferiore.
3. Preparare il buffer collagenasi digestione: 0,075% Tipo I collagenasi a Hank diSoluzione salina bilanciata (HBSS). Preparare tampone FACS: 2% FBS, 1% P188 e l'1% Pen-Strep in PBS. Filtro entrambe le soluzioni che utilizzano una dimensione dei pori 0,22 micron filtro polietersulfone flusso veloce disponibile in commercio.
4. Per digerire il tessuto adiposo lavato, aggiungere un volume uguale di tampone di digestione collagenasi e posizionare vaso di digestione saldamente in un bagno d'acqua agitazione per 60 min a 37 ° C (circa 180 frullati / min).
   NOTA: E 'meglio utilizzare un volume di digestione nave più grande del necessario, in quanto ciò permette di digestione massima durante l'agitazione (cioè, 250 ml di tampone collagenasi digestione, 250 ml di tessuto adiposo lavati in un pallone sterile 1L).
5. Neutralizzare attività enzimatica aggiungendo un volume uguale di tampone FACS e consentendo di sedersi a temperatura ambiente per 5 min. Successivamente, centrifugare a 233 xg per 20 min a 4 ° C.
6. Aspirare accuratamente e scartare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet SVF ad alta densità.
7. Risospendere il pellet in 5-10 ml di RT rossotampone di lisi cellulare, in base alle dimensioni del pellet. Lasciare soluzione sedersi a temperatura ambiente per 5 min e centrifugare a 233 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet aggiungendo 5-10 ml di mezzi di crescita tradizionali, in base alle dimensioni del pellet (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% soluzione di penicillina-streptomicina [pen-strep]).
9. Filtrare la sospensione attraverso un 100 micron filtro cella nylon per rimuovere i detriti cellulari.
10. Centrifugare a 233 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
11. Risospendere il pellet in 5-10 ml di mezzi di crescita tradizionali, in base alle dimensioni del pellet.
12. Inserire 2 x 10 ⁶ cellule in un piatto di coltura standard di 15 cm, stabilire colture primarie O / N a 37 ° C / 21% O _2, 5% CO _2. Mantenere a livelli sub-confluenti per impedire differenziazione spontanea a 37 ° C / 21% O _2, 5% CO ₂ nei substrati.
    Densità cellulare in uno completamente: NOTAconfluenti 15 centimetri piatto è di circa 4-6 x 10 ⁶ cellule.

2. Colorazione

1. ASC culturali in mezzo di crescita tradizionale a 37 ° C / 21% O _2, 5% di CO _2, per 36 ore prima della colorazione / smistamento.
2. ASC Ascensore da piastre di coltura utilizzando Accutase (come da protocollo del produttore).
3. Lavare le cellule una volta con tampone FACS (PBS con il 2% e l'1% FBS pen-strep).
4. Centrifugare a 233 xg per 5 minuti a 4 ° C.
5. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere le cellule in 0,5-1 ml di tampone FACS (a seconda del numero di cellule e la quantità di anticorpo desiderato).
   NOTA: Il volume della sospensione cellulare, in conformità con le raccomandazioni del costruttore l'anticorpo FACS, determina la concentrazione di anticorpi. Tuttavia, la titolazione di concentrazione di anticorpi, utilizzando una concentrazione iniziale di 1: 100, è di solito consigliata se è la prima volta di utilizzare un anticorpo.
6. Contare il numero totale dicellule utilizzando un emocitometro.
7. Riserva 100 aliquote ul a 1,5 ml provette da utilizzare per un campione senza macchia e controlli solo colore (in base al numero di anticorpi fluorescenti utilizzate).
8. Aggiungere gli anticorpi monoclonali fluorescenza marcata adeguati (a concentrazioni predeterminate, secondo le istruzioni del produttore) e incubare per 20-30 minuti sul ghiaccio, al riparo dalla luce.
   1. Per etichettare sottopopolazione osteogenic: Diluire anti-CD90 (APC CD90 anti-umano (Thy1)) o anti-CD105 (FITC anti-umano CD105 (endoglin)) in tampone FACS ad una concentrazione di 1:50.
   2. Per etichettare altre popolazioni cellulari (ad esempio, ematopoietiche e cellule endoteliali): Diluire anti-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (Anti-Human CD34 APC), e / o anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) in FACS tampone a una concentrazione di 1:50.
   3. Se non si usa anticorpi coniugati direttamente, utilizzare un anticorpo primario biotinilato con un secondo streptavidina coniugato appropriatoanticorpi ary, quali streptavidina PE-Cy7, a una diluizione di 1: 100.
9. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte: riempire tubi con tampone FACS e centrifugare a 233 xg per 5 minuti a 4 ° C, aspirando surnatante.
10. Risospendere le cellule in 400-500 campioni microlitri FACS tampone e filtro attraverso un colino 70 micron cella nylon per rimuovere grumi di cellule.
11. Trasferire cellule marcate in tubi FACS con piano filtro e mantenere i campioni in ghiaccio per la durata dell'analisi.

3. Fluorescence-activated cell sorting

NOTA: Le seguenti operazioni impongono conoscenza nella cella fluorescenza attivate (FACS) o l'assistenza di un tecnico specializzato.

1. Utilizzando il software FACS appropriate, trame di analisi progettuale esaminare forward scatter (FSC), side scatter (SSC), ficoeritrina (PE) -Texas Red, Pacific Blue, fluoresceina isotiocianato (FITC), Allophycocyanin (APC) e qualsiasi altro uso fluoroforod per etichettare le cellule.
2. Prima di essere caricato nel cell sorter, brevemente vortice ogni campione per sospendere nuovamente le cellule.
3. Iniziare con analisi del campione non colorato per impostare porte per la popolazione totale di cellule, di escludere detriti cellulari, e determinare autofluorescenza basale.
4. Aggiungere ioduro di propidio (PI) al campione non colorato e analizzarlo per visualizzare la popolazione di cellule vive all'interno della popolazione cellulare totale. Costruire un cancello intorno a questa popolazione.
5. Analizzare un campione di controllo unico colore per ogni fluorocromo per impostare la compensazione della fluorescenza.
6. Analizzare il campione colorato per impostare la posizione di porte per l'ordinamento.
7. Aggiungere PI al campione macchiato per macchiare cellule morte.
8. Ordina le popolazioni di cellule etichettate. Ordina in entrambi 1,5 ml provette o tubi conici (15 ml) contenenti terreno di coltura.
9. Cessare manualmente classificare una volta ottenuta la quantità necessaria di cellule.
10. Noiing FACS, eseguire un controllo della purezza analizzando una piccola frazione (ad es., 500 cellule) della popolazione cellulare acquisita.
    NOTA: Questo passaggio conferma la purezza delle popolazioni cellulari ordinati. Idealmente, la purezza dovrebbe essere maggiore di 90-95%.
11. Cellule centrifugare a 233 xg per 5 min a 4 ° C immediatamente dopo il completamento della cernita e risospendere in 1 ml di mezzo fresco contenente 10% FBS.
    NOTA: La quantità di materiale utilizzato può essere aumentato in base alle dimensioni del pellet di cellule.
12. Piatto su piastre rivestite di gelatina per migliorare la vitalità cellulare. A seconda del rendimento cellulare finale, piastra 300.000 cellule per bene in un 6-pozzetti, 100.000 cellule per pozzetto in una piastra di 12 pozzetti.

Risultati

Utilizzando CD90 come marcatore per le cellule con risultati migliorati osteogenesi in isolamento di una popolazione altamente arricchito di ASC umani (Figura 1A, 1B). ASC sono state colorate con Pacific Blue coniugati CD45 anti-umane, coniugati con coniugato CD105 anti-umana, e APC-coniugato anti-CD90 umano. Dopo la cernita, il livello di purezza era superiore al 98%, come quantificato mediante analisi post-ordinamento.

Gruppi di cellule in base ai profili trascrizionali co...

Discussione

Attualmente, l'isolamento di sottopopolazioni omogenei di ASC dal SVF di tessuto adiposo umano rimane una sfida anche se obiettivo auspicabile. Isolamento di sottopopolazioni ASC pro-osteogeniche è particolarmente desiderabile, poiché tali cellule possono essere usati per studiare la formazione e l'omeostasi dei tessuti scheletrici. Tuttavia, la SVF di tessuto adiposo ospita una significativa eterogeneità in materia di staminali la capacità delle cellule e potenziale di differenziazione. ¹¹ Le basi mo...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette coniche monouso da 250 ml	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, glucosio alto, GlutaMAX Integratore	Gibco	10566-016
PBS, pH 7,4	Gibco	10010-023
Betadine - Soluzione antisettica povidone/iodio	Purdue	PFC-67618015017
salina bilanciata di Hank, 1X	Cellgro	21-023-CV
Siero fetale bovino, certificato, origine USA	Gibco	16000-044
Collagenasi da  Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Soluzione di distacco cellulare	Tecnologie delle cellule staminali	7920
APC Topo Anti-Umano CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Topo anti-Umano CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Umano CD45 eFluor 450 (sostituzione Pacific Blue)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Strumento Aria II	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences

Soluzione