ENHANCED ridotto Rappresentanza bisolfito sequenziamento per la valutazione della metilazione del DNA in Risoluzione coppia di basi

La metilazione del DNA a citosina (5-metilcitosina) è un marchio epigenetico critica in cellule di mammifero per una varietà di processi biologici, compreso ma non limitato a imprinting, inattivazione del cromosoma X, lo sviluppo, e la regolazione dell'espressione genica ^1-8. Lo studio della metilazione del DNA in maligne e altri disturbi ha determinato malattie modelli specifici e contribuito alla comprensione della patogenesi della malattia e potenziali scoperte biomarker ^9-17. Ci sono molti protocolli che interrogano dell'epigenoma per lo stato di metilazione del DNA. Questi possono essere suddivisi in base affinità, enzima di restrizione-based, e saggi basati conversione-bisolfito che utilizzano le piattaforme di microarray o sequenziamento valle. Inoltre, ci sono alcuni protocolli che colmano queste categorie generali compresi, ma non limitatamente a, combinato bisolfito Restriction Analysis ¹⁸ e ridotto Rappresentanza bisolfito Sequencing (RRBs ^19). RRBs stato originariamente descritto da Meissner et al. ^19,20. Il protocollo ha introdotto un passo per arricchire regioni genomiche ricche di GC seguiti da sequenziamento bisolfito, che ha portato i dati risoluzione di base-pair quantitativo, che è economicamente vantaggioso ^21,22. Le regioni ricche di GC sono mirati dal MspI (C ^ CGG) enzima di restrizione, e citosina metilazione si risolve con la conversione bisolfito di cytosines (deamination di cytosines modificati a uracile), seguita dalla reazione a catena della polimerasi (PCR). RRBs coperto la maggioranza dei promotori genici e isole CpG in una frazione del sequenziamento richiesto per un intero genoma; tuttavia RRBs avevano copertura limitata delle coste CPG e altre regioni intergeniche di rilevanza biologica. Diversi gruppi hanno pubblicato aggiornati protocolli RRBs rispetto alla relazione originale che migliorano la metodologia e la copertura risultante di queste regioni genomiche ^23-25. Maggiore rappresentanza ridotta Bisulfite Sequscere (ERRBS) include modifiche preparazione di libreria e di un allineamento di dati alternativo approccio ²⁶ quando rispetto al RRBs. ERRBS provocato un maggior numero di CPGs rappresentata nei dati generati e aumentato la copertura di tutte le regioni genomiche interrogato ^26. Questo metodo è stato utilizzato per risolvere schemi di metilazione del DNA in paziente umano e altri esemplari di animali ^26-30.

Il protocollo ERRBS descritto particolari offerte su tutti i passi necessari per il completamento e dati sono stati generati utilizzando rappresentante DNA umano (i campioni sono stati ottenuti da precedentemente riportati, i campioni dei pazienti de-identificati ^31, e CD34 + midollo osseo da un campione normale donatore umano). Il protocollo comprende una procedura automatica di selezione del formato, che riduce il tempo di elaborazione per campione e consente una maggiore precisione nella selezione della libreria dimensioni. Il protocollo combina una serie di tecniche di biologia molecolare stabiliti. Alto peso molecolare DNA viene digerito won una metilazione-insensitive enzima di restrizione (MspI) seguita da fine-riparazione, A-tailing, e legatura di adattatori denaturato. Dimensione selezione dei frammenti ricchi di GC è seguita da conversione bisolfito e PCR di amplificazione prima sequenziamento. Conversione bisolfito è stato descritto in precedenza ³² e dettagliata revisione di analisi e applicazioni dati è oltre la portata di questo articolo, tuttavia consigli e riferimenti sono inclusi per l'uso dei lettori. Il protocollo può essere eseguita in quattro giorni ed è suscettibile di piccolo ingresso (50 ng o meno) importi rilevanti. Il protocollo, come descritto produce dati con elevata copertura per sito CpG sufficiente non solo per differenziali sito metilazione e regione determinazioni, ma anche per il rilevamento del polimorfismo epigenetico come descritto da Landan, et al. ^33.

Tutte le procedure eseguite sono approvati dalla Scuola di Medicina Istituzionale Animal Care and Use Committee Indiana University e seguono Istituto Nazionale di linee guida di salute.

1. Tecnica chirurgica

1. Mantenere una tecnica asettica durante questa procedura utilizzando guanti sterili, strumenti, e un campo chirurgico sterile, secondo le linee guida NIH ^25. Sterilizzare gli strumenti prima di iniziare l'intervento chirurgico da loro autoclave (vedi Tabella di reagenti specifici / Attrezzature per l'elenco completo). Utilizzare uno sterilizzatore perle di vetro per sterilizzare strumenti durante l'operazione.

2. Anestesia e preparazione

1. Anestetizzare il mouse in una scatola anestesia con una miscela di 0,9 L / min ossigeno e 2,5% isoflurano utilizzando un sistema vaporizzatore isoflurano veterinaria. Assicurarsi che il mouse non risponde ai cambiamenti di posizione del corpo prima di rimuoverlo dalla scatola.
2. Applicare una pomata oftalmica al mouGli occhi di SE per proteggerli dalla disidratazione.
3. Passare il flusso di gas dalla casella a cono. Posizionare il mouse esattamente sul lato sinistro su un tappetino riscaldato coperto da un tappetino chirurgica e carta assorbente con panca il naso e la bocca all'interno del cono. Monitorare costantemente il ritmo del respiro del mouse e la velocità e regolare i livelli isoflurano come necessario (tra 2,5-3% isoflurano) per mantenere un adeguato livello di anestesia, e utilizzare la punta pizzico reflex per confermare sedazione totale.

3. Approccio chirurgico

1. Allineare e mettere a fuoco lo stereoscopio con il campo operatorio. Regolare il cono e il nastro verso il basso in modo che sia posizionato lungo il bordo del campo visivo.
2. Con il mouse sdraiato sul suo lato sinistro, il nastro il bordo dell'orecchio destro al cono, esponendo l'area dietro l'orecchio in cui verrà effettuata l'incisione. Assicurarsi che la vena auricolare posteriore percorre orizzontalmente l'orecchio. Si noti che il corretto posizionamento di tegli animali e taping dell'orecchio sono fondamentali al fine di trovare rapidamente il nervo facciale.
3. Bagnare il pelo sopra e dietro l'orecchio con il 70% di etanolo e radere il sito chirurgico con una lama di rasoio o bisturi. Pre-bagnare il pelo rende la rasatura più facile in questa posizione anatomica.
4. Pulire la pelle con una soluzione di iodio, come Betadine lavaggio chirurgico (7,5% povidone-iodio), seguito da 70% di etanolo. Ripetere questa pulizia due volte di più per disinfettare accuratamente la zona.
5. Per determinare dove fare l'incisione, tracciare la vena auricolare posteriore dall'orecchio caudalmente alla zona posteriore alla protuberanza orecchio. Utilizzando forbici primavera, fare un 4 millimetri un'incisione 2 - 3 mm posteriormente alla protuberanza.
6. Sezionare attraverso il grasso sottocutaneo e la fascia con smussa. Evitare il taglio diretto con le forbici, perché i vasi sanguigni o tessuto muscolare possono essere facilmente danneggiati.
7. In caso di emorragia, applicare pressione al sito chirurgico con un tampone di cotone sterileper almeno 30 secondi. Se si verifica una significativa perdita di fluido, iniettare il mouse per via intraperitoneale con fino a 0,5 ml di soluzione salina sterile allo 0,9% utilizzando un ago G 25 o 27.
8. Utilizzare diversi punti di riferimento chiave, il nervo accessorio spinale, canale uditivo, e anteriore del muscolo digastrico (descritto di seguito), per individuare il nervo facciale. Sezionare intorno a questi punti di riferimento fino a quando sono visualizzati i rami del nervo facciale. Il nervo apparirà come una significativa struttura di solido bianco quando viene rivelato e uno strato di fascia aderisce agli strutture sottostanti.
   1. Trova il nervo accessorio spinale, che viaggia dalla porzione caudale del cranio per innervare il muscolo trapezio, una volta che il grasso sottocutaneo e la fascia sono stati sezionati. Il nervo facciale è profondo al nervo accessorio spinale.
   2. Trovare il canale uditivo cartilagineo che sembra bianco perlato e può essere visto rostrale al nervo facciale.
   3. Trova il ventre muscolare del muscolo digastrico anteriore, che si trova in cima e caudal al nervo facciale.
9. Quando i principali rami del nervo facciale sono visualizzati, li risalire dorsale di trovare la loro origine dal forame stylomastoid. Utilizzando punta fine Dumont pinze # 5/45 di tenere il sito chirurgico aperto, far avanzare le punte primavera forbice seguito il percorso del nervo, quindi spostare la pinza dorsale per mantenere la nuova area Advanced Open.
10. Visualizza il tronco del nervo facciale con zigomatico, buccale, e rami mandibolari marginali a questo punto.
    NOTA: Il ramo temporale si troverà più vicino al forame. I rami marginali nervo mandibolare nelle sue parti superiore e inferiore più vicino alla mascella, pertanto quei rami nervose non saranno visibili a questo livello.
    1. Se si esegue una resezione del nervo, di stabilizzare il nervo delicatamente con le pinze punta fine e tagliare il nervo con le forbici a molla. Evitare di applicare troppa trazione al nervo con le pinze per evitare avulsing nervo dal tronco encefalico. Spingerei monconi distanti, o tagliare e rimuovere una porzione del nervo distale per garantire che nessun riconnessione può verificarsi.
    2. Se si esegue una lesione da schiacciamento, utilizzare Dumont # 5/45 pinze per comprimere il nervo per 30 secondi con una pressione costante a recidere tutti gli assoni, quindi ripetere questa cotta in un secondo angolo perpendicolare al primo sito cotta. Evitare l'applicazione di quantità variabili di pressione durante la 30 sec cotta, altrimenti il ​​danno non sarà coerente tra gli animali.

4. Chiusura e recupero

1. Riposizionare il grasso e muscoli sopra le strutture sottostanti.
2. Approssima i bordi dell'incisione e chiudere la ferita utilizzando un clip ferita 7,5 millimetri. Suture o colla sono accettabili per la chiusura della ferita. Analgesici postoperatoria possono essere forniti in questo momento.
3. Rimuovere il nastro dal orecchio del mouse. Spegnere il flusso isoflurano e lasciare il mouse per respirare ossigeno puro per 30 secondi a 1 minuto. Plasso il mouse in una gabbia vuota senza biancheria da letto per recuperare da anestesia.
4. Quando il mouse è recuperato, esaminare il suo comportamento per i segni di conferma della paralisi facciale. I baffi saranno paralizzati e angolati verso la guancia, il naso viene deviato, e l'occhio non lampeggia in risposta ad un soffio d'aria.
5. Animali Casa congiuntamente dopo l'intervento chirurgico se sono di sesso femminile. Evitare ospitano topi maschi congiuntamente perché sono più aggressivi e tendono a rimuovere forzatamente clip ferita del loro cagemate, che porta a infezioni. Fornire analgesici postchirurgiche in questo momento, se necessario.
6. Monitorare i topi una volta al giorno per diversi giorni dopo l'operazione per assicurarsi che nessuna infezione o altre complicanze si verifica dopo l'intervento. Rimuovere clip ferita 7 - 10 giorni dopo l'intervento chirurgico, se non sono caduti fuori da sè.
7. Applicare lubrificante pomata occhio l'occhio interessato al giorno per prevenire le complicanze corneali, sia fino a quando il riflesso corneale occhio è recoperti o fino eutanasia.

La figura 1 fornisce una panoramica di ERRBS, evidenziando passaggi chiave, che sono spiegate in tutto il protocollo descritto. Biblioteche ERRBS sono stati preparati utilizzando 50 ng DNA di ingresso.

Valutare la qualità delle biblioteche preparati. Produzione Libreria produce abitualmente formati frazione di 150-250 bp e 250-400 bp (Figura 3A-C). Sono attesi Lievi differenze nella distribuzione delle librerie di dimensioni tra i campioni. Si noti che in entrambe le frazioni biblioteca inferiori e superiori non sono formati DNA molto intense, indicativi di arricchimento di una particolare sequenza. MspI risultati digestione l'arricchimento di una famiglia di DNA ripetitivo sequenze presenti nel genoma umano a 190 bp, 250 bp e 310 bp nelle biblioteche ERRBS. Questi tre ripetizioni rappresentano una firma caratteristica di una libreria ERRBS 20 (vedi figure 3A-C e 3G). Biblioteche rappresentativi sono stati sequenziati su una sequenza di prossima generazioner utilizzando single-end legge. Quando si carica alla concentrazione biblioteca consigliata su Illumina HiSeq 2500 sequencer, sono attesi densità di cluster di 500,000-700,000 per mm 2. A questa densità clustering, 81,6% ± 3,14% (n = 81) dei cluster filtro passa (Figura 4A). A causa della fine complessità basso degli inserti di libreria (sito di riconoscimento MspI: C ^ CGG), i valori di intensità e punteggi di qualità registrati durante il sequenziamento sono altamente variabili nei primi tre basi (Figura 4B-C), tuttavia, se una corsia di controllo indipendente è incluso (vedi la discussione), l'85% delle basi avranno punteggi di qualità di 30 o superiore (valori Q30; Figura 4D).

L'allineamento dei dati e determinazione citosina metilazione come descritto nei dati risoluzione rendimenti protocollo base-pair (Tabella 7). Per il genoma umano, un 51-ciclo unico lettura run sequenziamento di una libreria ERRBS in una corsia di un HiSeq 2500 in modalità ad alto rendimento normalely genera 153.194.882 ± 12.918.302 totale si legge che dopo il filtraggio di qualità e l'adattatore taglio rendimenti 152.231.183 ± 13.189.678 legge per l'ingresso nella pipeline di analisi. Rendimento medio mappatura per una libreria ERRBS è tipicamente 62.95% ± 5,92% con la rappresentazione di 3.183.594 ± 713.547 CPGs con una copertura minima per CpG di 10x e una copertura media per CpG di 84,94 ± 16,29 (n = 100).

Il protocollo ERRBS è suscettibile di multiplexing (vedi file Supplemento 1: Protocollo di adattamento per il sequenziamento multiplex). I dati di sequenziamento rappresentante corre è riassunto nella figura 5 Dati da piste di sequenziamento multiplex (51-ciclo di esecuzione singola lettura sequenziamento;. N = 128 per due biblioteche per corsia; n = 11 per tre biblioteche per corsia; n = 11 per quattro biblioteche per corsia) sono stati confrontati con una corsia sequenza completa di una libreria ERRBS (51-ciclo piste sequenziamento singoli-letto; n = 100) e downsampling una sola corsia per SIMULAZIONEe 50%, 33% e 25% di letture per corsia (2, 3, e 4 campione multiplexing per corsia rispettivamente; n = 3). Poiché il numero di letture per campione diminuisce con il fattore di multiplexing, il numero di CPGs coperte ad una copertura minima di 10x e la copertura per CpG diminuisce pure (Figura 5 e Tabella 8). Significa tassi di conversione dei siti non-CpG attesi sono 99,85% ± 0,04% (n = 400). I tassi di conversione più bassi del 99% possono indicare non ottimale di conversione bisolfito che può causare alti tassi di livelli di metilazione falsi.

I dati di una libreria ERRBS preparato da un DNA rappresentante umano genomico è stato analizzato in R 2.15.2 45 utilizzando il pacchetto methylKit 26 (vedi file di codice supplementare 1 per i dettagli di comando). I dati possono essere visualizzati nei browser genoma di uso comune (Figura 6A). I dati citosina metilazione è equamente derivato da entrambi i filamenti (Figura 6B) e va tuttospettro di potenziali livelli di metilazione citosina (Figura 6c). Analisi delle repliche tecniche da un alto rappresentante concordanza rendimenti campione di DNA umano tra i risultati dei dati (Figura 6D) e copre CPGs in un ampio spettro di loci genomici (Figura 6 E e F e, come descritto in precedenza 26). Mentre repliche tecniche produrranno alta R 2 valori (superiore al 97%), repliche biologica produrrà R 2 valori compresi 0,92-0,96 26, e confrontando i differenti tipi di cellule umane produrrà R 2 valori inferiori a 0.86 (dati non mostrati).

Figura 1: Diagramma di flusso delle fasi di protocollo ERRBS. Grafico rappresenta passi, che può essere completato in un giorno di lavoro tradizionale. * Indica un potenziale punto di pausa (immediatamente seguire ing legatura ripulire e prima selezione del formato, protocollo punto 5) in cui i campioni possono essere congelati a -20 ° C prima di procedere con la durata di protocollo.

Figura 2: protocollo selezione Size. (A) Schermata di impostazioni utilizzate nel protocollo ERRBS Pippin Prep (vedi sezione protocollo 5.1.2 - 5.1.6): (1) Selezionare il tipo di cassetta. (2) Selezionare tipo da impiegare. (3) Selezionare la modalità di raccolta per ogni corsia. (4) Inserire i campi di raccolta bp. (5) Salvare il protocollo (B) Fasi di estrazione gel manuale utilizzato nella sezione del protocollo 5.2:. (1) scale gel visualizzati. (2) Contrassegnato formati per la selezione dimensioni utilizzando una lama di rasoio. (3) L'immagine dei campioni asportati (frazione inferiore: 150-250 bp e superiori frazione: 250-400 bp)."> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: i risultati dei controlli di qualità per biblioteche rappresentative ERRBS preparati da campioni di DNA umano con una macchina Bioanalyzer. (A) immagine Gel-come mostra una scala standard (1), frazione libreria inferiore (135-240 bp frazione da Pipino Prep); 2) e la frazione biblioteca superiore (240-410 bp frazione da Pipino Prep); . 3) (B) Bioanalyzer elettroferogramma della frazione biblioteca previsto minor (C) Bioanalyzer elettroferogramma della frazione biblioteca più alta prevista D -.. F) i dati rappresentativi da una povera libreria qualità prep. Immagine Gel-like (D) della scala standard (1), frazione inferiore library (2) e la frazione biblioteca superiore (3). La banda a 150 bp contrassegnati con arrow indica una quantità eccessiva di adattatore. Elettroferogramma del minore (E) e le frazioni più alte di libreria (F) con i picchi adattatore in eccesso a 150 bp (segnato con frecce). (G) Bioanalyzer elettroferogramma di una libreria ERRBS pool per il sequenziamento. Traccia rossa rappresenta una libreria pool di alta qualità con una pari rappresentanza di frazioni superiori e inferiori. Blu traccia rappresenta una libreria pool non adeguato per il sequenziamento a causa della mancanza di pari rappresentanza delle frazioni più alte e più basse. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Sequencing classifica per un rappresentante ERRBS 51-ciclo di esecuzione sequenziamento single-letto su un HiSeq 2500 sequencer in alto rendimentomodalità. (A) densità Cluster (K / mm 2 = 1.000 cluster per millimetro quadrato; blu). E densità di cluster passaggio filtrante (verde) in due corsie con librerie ERRBS (B) intensità tipiche visto nei primi 30 cicli in una corsia con una biblioteca ERRBS. Nota la firma CGG da MspI digestione nelle intensità dei primi tre cicli. (C) Percentuale di basi con un punteggio di qualità di 30 o superiore (%> Q30) per ogni ciclo in una corsia ERRBS. (D) Distribuzione punteggio di qualità per tutti i cicli di una corsia ERRBS. Blu = meno di Q30, Verde = maggiore o uguale a Q30. In questa corsia, 84,7% di basi avevano punteggi di qualità di 30 o superiore.

Figura 5: Sequencing risultati di output. Trame Box di dati sperimentali provenienti da campione multiplex e singola per corsia sequenziamento ru ns (visualizzati come scatole verdi) e di dati ricavati da downsampling simulato dal sequenziamento piste di tre ERRBS librerie (visualizzato come scatole blu, campione di cinque volte per ogni ciclo di sequenziamento) da 51 a ciclo sequenziamento singola lettura corre Il fattore multiplexing corrisponde. il numero di biblioteche ERRBS sequenziato per corsia. 1 = corsia intero o 100% di legge e rappresenta i dati di una singola libreria ERRBS per corsia; 2 = 50% di corsia e rappresenta i dati da due ERRBS biblioteche per corsia; 3 = 33% di una corsia e rappresenta i dati da tre ERRBS biblioteche per corsia; e, 4 = 25% di una corsia e rappresenta i dati provenienti da quattro ERRBS librerie per corsia. (A) I conti di lettura, o il numero di sequenze analizzate, per ogni fattore di multiplexing. (B) Il numero di CpG di coperta dai dati di sequenziamento per multiplexing factor. (C) La copertura media per CpG per fattore multiplexing._blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6: i dati rappresentativi da una libreria ERRBS preparata dal DNA genomico umano (A) University of California, Santa Cruz (UCSC) Browser genoma 43 immagine di dati rappresentativi di una corsia di ERRBS sequenziamento.. La barra di scala asse y rappresenta 0-100% metilazione ad ogni citosina coperto con un minimo di 10x. La pista su ordinazione superiore rappresenta il filo in avanti e la pista personalizzata inferiore rappresenta il filo opposto. Viene mostrato chr12:.. 6,489,523-6,802,422 (hg19) comprensivo di geni RefSeq e isole CpG all'interno di questa regione genomica istogrammi (B) Distribuzione di copertura CpG lungo in avanti e indietro i fili in un CD34 + umane del midollo osseo campione rappresentativo (C) istogramma di distribuzionedei livelli di metilazione CpG lungo entrambi i filamenti in un CD34 umana + midollo osseo campione rappresentativo. (D) Correlazione appezzamento di livelli di metilazione CpG da una replica tecnico rappresentativo di un campione di DNA umano. grafico (E) Pie che illustra le proporzioni di CPGs coperti in ERRBS che annotata in isole CpG (verde chiaro), CpG rive (grigio) e in altre regioni (bianco) in un campione rappresentativo preparata dal DNA genomico umano. grafico (F) Pie che illustra le proporzioni di CPGs coperti in ERRBS che annotati a promotori di geni (rosso ), esoni (verde), introni (blu) e regioni intergeniche (viola). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1:. End reagenti reazione riparazione nomi dei reagenti e le quantità utilizzate nella reazione di riparazione fine (protocollo punto 2.1).

Tabella 2:. A-tailing reagenti reazione nomi dei reagenti e le quantità utilizzate nella reazione A-tailing (protocollo punto 3.1).

Tabella 3: Adattatore legatura reagenti reazione nomi dei reagenti e le quantità utilizzate nella reazione adattatore legatura (protocollo punto 4.2)..

Tabella 4:. Oligos utilizzati nel protocollo ERRBS Elenco dei oligonucleotidi utilizzati nel protocollo ERRBS nella reazione legatura (protocollo punto 4) e fasi di amplificazione PCR (protocollo fase 7).

Tabella 5: reagenti reazione PCR nomi reagenti e le quantità usate nella reazione di amplificazione PCR (protocollo punto 7.1)..

Tabella 6:. Protocol modifiche passo per ingresso quantità dei materiali che vanno 5-50 ng Diversi passi in tutto il protocollo richiedono modifiche delle quantità di reagenti utilizzati per generare le librerie di alta qualità provenienti da diverse quantità di materie prime. Modifiche alla quantità di reagenti chiave sono inclusi qui. Regolare tampone e volumi d'acqua nelle reazioni di conseguenza.

Tabella 8:. Parametri rappresentativi di sequenziamento librerie singoli e multiplex ERRBS riportati sono dati per corsia da 51 a ciclo piste sequenziamento singoli-letto: media e deviazioni standard di allineate in modo univoco si legge, il numero di CPGs coperto e la copertura per sito CpG ottenuto da sequenziamento singolo biblioteche ERRBS per corsia (n = 100), due ERRBS biblioteche per corsia (n = 128), tre ERRBS biblioteche per corsia (n = 11), e quattro ERRBS biblioteche per corsia (n = 11).

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.