Articolo metodologico

Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

DOI:

10.3791/52298

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28 gennaio 2015

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1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

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Un metodo è stato sviluppato per derivare direttamente le cellule staminali neurali umane da cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da cellule del sangue periferico.

Abstract

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Malattie umane specifiche colture neuronali sono essenziali per la generazione di modelli in vitro per le malattie neurologiche umane. Tuttavia, la mancanza di accesso alle adulti umano colture neuronali primarie pone sfide uniche. I recenti sviluppi in cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) fornisce un approccio alternativo per derivare culture neuronali di fibroblasti cutanei attraverso specifico paziente iPSC, ma questo processo è laborioso, richiede competenze specifiche e una grande quantità di risorse, e può richiedere diversi mesi. Ciò impedisce l'ampia applicazione di questa tecnologia per lo studio delle malattie neurologiche. Per superare alcuni di questi problemi, abbiamo sviluppato un metodo per ottenere cellule staminali neurali direttamente dal sangue periferico umano adulto, bypassando il processo di derivazione IPSC. Cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da sangue periferico umano adulto sono state coltivate in vitro e trasfettate con vettori Sendai contenenti fattori di trascrizione Sox2, ottobre3/4, Klf4, e c-Myc. I risultati di trasfezione di cambiamenti morfologici nelle cellule che vengono ulteriormente selezionati utilizzando media progenitrici neurali umane contenenti base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) e fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Le cellule risultanti sono caratterizzate dall'espressione di marcatori di cellule staminali neuronali, come nestin e SOX2. Queste cellule staminali neurali potrebbero essere ulteriormente differenziati ai neuroni, astroglia e oligodendrociti in mezzi differenziazione specificato. Usando campioni di sangue periferico umano facilmente accessibili, questo metodo potrebbe essere utilizzato per ottenere cellule staminali neurali per un'ulteriore differenziazione di cellule neurali per la modellazione in vitro di disturbi neurologici e può avanzare studi relativi alla patogenesi e il trattamento di queste malattie.

Introduzione

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In vitro colture neuronali sono state utilizzate come strumento fondamentale per lo studio di malattie neurologiche. Animale primario (principalmente roditori) colture neuronali 1, 2 e linee cellulari neuronali umane derivate da gliomi o altri tumori sono i più comunemente utilizzati in tali studi. Tuttavia, è stato riconosciuto che non vi sono differenze significative tra roditori e cellule umane. Molte scoperte basate su roditori non possono essere tradotti per gli esseri umani. Inoltre, con i rapidi sviluppi l'analisi delle informazioni di massa genomica e la relativamente facile editing gene e sequenziamento dell'intero genoma, la tend....

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Protocollo

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1. Arricchimento di emopoietiche progenitrici cellule da sangue intero per adulti

NOTA: le cellule progenitrici ematopoietiche o cellule CD34 + possono essere purificati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) derivate da una varietà di fonti, tra cui il sangue del cordone, materiale leucaferesi e sangue intero con metodi basati gradiente di densità di centrifugazione. Il metodo qui elencati utilizza sangue intero come esempio.

  1. Isolamento di PBMC da sangue intero:
    1. Aggiungere 4,5 ml di mezzo di separazione dei linfociti al tubo SepMate pipettando attraverso il foro centrale dell'inserto.
    2. Dilui....

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Risultati

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La qualità delle cellule CD34 è critico per il successo di trasduzione di cellule staminali neurali. Cellule CD34 alta qualità proliferano durante il primo paio di giorni di coltura e appaiono come non aderenti, cellule omogeneamente rotonde, galleggiante appena sopra il fondo di recipienti di coltura (Figura 1A). I risultati infettati in aggregati di cellule, che si espande nel tempo (Figura 1B), mentre si possono verificare aggregati cellulari non specifici durante coltura cellulare, .......

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Discussione

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Viene fornito un protocollo dettagliato per generare direttamente le cellule staminali neurali da cellule progenitrici ematopoietiche periferiche.

Rispetto alle cellule di fibroblasti, sangue periferico umano è più accessibile. Utilizzando il protocollo presentato, più di 1 x 10 5 cellule progenitrici ematopoietiche o cellule CD34 positive, può essere arricchito da 10 ml di sangue intero. Sebbene contaminazione con piastrine di solito non è evitabile, può essere facilmente ridotto.......

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Dichiarazioni

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Lo studio è finanziato dai fondi intramurali del NIH.

Ringraziamenti

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreno di separazione linfocitarioLonza17-829E1x
SepMateStemcell Technologies1541515 ml
Siero umanoInvitrogen34005-100
AntibioticiGibco15240-0621%
CD34 MultiSort KitMiltenyi Biotec130-056-701
EDTACellgro46-034-Cl2 mM
MACS LS colonnaMiltenyi Biotec130-042-401
StemSpan SFEM mediumStemcell Technologies96501x
IMDMQuality Biologicals112-035-1011x
TPOPeprotech300-18100 ng/ml
Flt-3Peprotech300-19100 ng/ml
SCFPeprotech300-07100 ng/ml
IL-6Peprotech200-0620 ng/ml
IL-7Peprotech200-0720 ng/ml
IPS Sendai Kit di riprogrammazioneLife TechnologiesA1378001
Raschietto cellulareSarstedt83.183
DMSOSigmaD2650
FialeCryoTubeThermo368632
Mr. Frosty contenitoreThermo5100-0001
DMEM/F12Life Technologies12400-0241x
integratore di N2Life Technologies17502-0481x
albumina sierica bovinaSigmaA29340,1% (p/v)
bFGFPeprotech100-18B20 ng/ml
EGFIntegratore PeprotechAF-100-15
B27Life Technologies17504-0441x
NSC senza siero mediumLife TechnologiesA10509011x
vetrini coprioggetti rivestiti in poli-D-lisina/lamininaBD Bioscences354087
cAMPSigmaA9501300 ng/ml
Vitamina CSigmaA02780,2 mM
BDNFPeprotech450-0210 ng/ml
GDNFPeprotech450-1010 ng/ml
Poli-L-ornitinaSigmaP49571x
PDGF-AAPeprotech100-13A10 ng/ml
NT-3Peprotech450-032 ng/ml
ShhPeprotech1314-SH/CF2 ng/ml
T3SigmaT63973 nM
PFASigmaP61484%
PBSQualità Biologica119-069-1011x
Siero di capraSigmaG90234%
TritonX-100SigmaT9284
Monoclonale di topo anti-NestinaMilliporeAB59221:1.000 diluizione
Anti-SOX2 anticorpoCellule staminali applicateASA0120Pronto all'uso
Topo anti-β Anticorpo III-tubulinaPromegaG712ADiluizione 1:1.000
Anticorpo anti-GFAP di coniglioSigmaG4546Diluizione 1:100
Anticorpo anti-O4R& D SystemsMAB1326IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 capra anticorpo anti-coniglioLife techniologiesA11012Diluizione 1:400
Alexa Fluor 488 capra anti-topo anticorpoLife techniologiesA110011:400 diluizione
Alexa Fluor 488 capra anti-topo Anticorpo IgMLife techniologiesA210421:250 diluizione
DAPISigmaD95421 μ g/ml

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941(2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neurob....

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Trasfezione del virus SendaiCD34 del sangue perifericoterreno per progenitori neuralimicroscopia a immunofluorescenzaespressione di Nestin e SOX2differenziamento neuronalegenerazione di astrociti e oligodendrocitimetodo di induzione diretta

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