Un metodo è stato sviluppato per derivare direttamente le cellule staminali neurali umane da cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da cellule del sangue periferico.
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Articolo metodologico
Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malattie umane specifiche colture neuronali sono essenziali per la generazione di modelli in vitro per le malattie neurologiche umane. Tuttavia, la mancanza di accesso alle adulti umano colture neuronali primarie pone sfide uniche. I recenti sviluppi in cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) fornisce un approccio alternativo per derivare culture neuronali di fibroblasti cutanei attraverso specifico paziente iPSC, ma questo processo è laborioso, richiede competenze specifiche e una grande quantità di risorse, e può richiedere diversi mesi. Ciò impedisce l'ampia applicazione di questa tecnologia per lo studio delle malattie neurologiche. Per superare alcuni di questi problemi, abbiamo sviluppato un metodo per ottenere cellule staminali neurali direttamente dal sangue periferico umano adulto, bypassando il processo di derivazione IPSC. Cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da sangue periferico umano adulto sono state coltivate in vitro e trasfettate con vettori Sendai contenenti fattori di trascrizione Sox2, ottobre3/4, Klf4, e c-Myc. I risultati di trasfezione di cambiamenti morfologici nelle cellule che vengono ulteriormente selezionati utilizzando media progenitrici neurali umane contenenti base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) e fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Le cellule risultanti sono caratterizzate dall'espressione di marcatori di cellule staminali neuronali, come nestin e SOX2. Queste cellule staminali neurali potrebbero essere ulteriormente differenziati ai neuroni, astroglia e oligodendrociti in mezzi differenziazione specificato. Usando campioni di sangue periferico umano facilmente accessibili, questo metodo potrebbe essere utilizzato per ottenere cellule staminali neurali per un'ulteriore differenziazione di cellule neurali per la modellazione in vitro di disturbi neurologici e può avanzare studi relativi alla patogenesi e il trattamento di queste malattie.
Introduzione
In vitro colture neuronali sono state utilizzate come strumento fondamentale per lo studio di malattie neurologiche. Animale primario (principalmente roditori) colture neuronali 1, 2 e linee cellulari neuronali umane derivate da gliomi o altri tumori sono i più comunemente utilizzati in tali studi. Tuttavia, è stato riconosciuto che non vi sono differenze significative tra roditori e cellule umane. Molte scoperte basate su roditori non possono essere tradotti per gli esseri umani. Inoltre, con i rapidi sviluppi l'analisi delle informazioni di massa genomica e la relativamente facile editing gene e sequenziamento dell'intero genoma, la tend....
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Protocollo
1. Arricchimento di emopoietiche progenitrici cellule da sangue intero per adulti
NOTA: le cellule progenitrici ematopoietiche o cellule CD34 + possono essere purificati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) derivate da una varietà di fonti, tra cui il sangue del cordone, materiale leucaferesi e sangue intero con metodi basati gradiente di densità di centrifugazione. Il metodo qui elencati utilizza sangue intero come esempio.
- Isolamento di PBMC da sangue intero:
- Aggiungere 4,5 ml di mezzo di separazione dei linfociti al tubo SepMate pipettando attraverso il foro centrale dell'inserto.
- Dilui....
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Risultati
La qualità delle cellule CD34 è critico per il successo di trasduzione di cellule staminali neurali. Cellule CD34 alta qualità proliferano durante il primo paio di giorni di coltura e appaiono come non aderenti, cellule omogeneamente rotonde, galleggiante appena sopra il fondo di recipienti di coltura (Figura 1A). I risultati infettati in aggregati di cellule, che si espande nel tempo (Figura 1B), mentre si possono verificare aggregati cellulari non specifici durante coltura cellu.......
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Discussione
Viene fornito un protocollo dettagliato per generare direttamente le cellule staminali neurali da cellule progenitrici ematopoietiche periferiche.
Rispetto alle cellule di fibroblasti, sangue periferico umano è più accessibile. Utilizzando il protocollo presentato, più di 1 x 10 5 cellule progenitrici ematopoietiche o cellule CD34 positive, può essere arricchito da 10 ml di sangue intero. Sebbene contaminazione con piastrine di solito non è evitabile, può essere facilmente ridotto.......
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Dichiarazioni
Lo studio è finanziato dai fondi intramurali del NIH.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Terreno di separazione linfocitario | Lonza | 17-829E | 1x |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 ml |
| Siero umano | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotici | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2 mM |
| MACS LS colonna | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1x |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1x |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/ml |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/ml |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/ml |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/ml |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/ml |
| IPS Sendai Kit di riprogrammazione | Life Technologies | A1378001 | |
| Raschietto cellulare | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Fiale | CryoTubeThermo | 368632 | |
| Mr. Frosty contenitore | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12400-024 | 1x |
| integratore di N2 | Life Technologies | 17502-048 | 1x |
| albumina sierica bovina | Sigma | A2934 | 0,1% (p/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Integratore Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | 1x |
| NSC senza siero medium | Life Technologies | A1050901 | 1x |
| vetrini coprioggetti rivestiti in poli-D-lisina/laminina | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamina C | Sigma | A0278 | 0,2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poli-L-ornitina | Sigma | P4957 | 1x |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Qualità Biologica | 119-069-101 | 1x |
| Siero di capra | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Monoclonale di topo anti-Nestina | Millipore | AB5922 | 1:1.000 diluizione |
| Anti-SOX2 anticorpo | Cellule staminali applicate | ASA0120 | Pronto all'uso |
| Topo anti-β Anticorpo III-tubulina | Promega | G712A | Diluizione 1:1.000 |
| Anticorpo anti-GFAP di coniglio | Sigma | G4546 | Diluizione 1:100 |
| Anticorpo anti-O4 | R& D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 capra anticorpo anti-coniglio | Life techniologies | A11012 | Diluizione 1:400 |
| Alexa Fluor 488 capra anti-topo anticorpo | Life techniologies | A11001 | 1:400 diluizione |
| Alexa Fluor 488 capra anti-topo Anticorpo IgM | Life techniologies | A21042 | 1:250 diluizione |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 μ g/ml |
Riferimenti
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941(2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neurob....
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Ristampe e permessi
