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Articolo metodologico

Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

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DOI:

10.3791/52298

⸱

28 gennaio 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

Un metodo è stato sviluppato per derivare direttamente le cellule staminali neurali umane da cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da cellule del sangue periferico.

Abstract

Malattie umane specifiche colture neuronali sono essenziali per la generazione di modelli in vitro per le malattie neurologiche umane. Tuttavia, la mancanza di accesso alle adulti umano colture neuronali primarie pone sfide uniche. I recenti sviluppi in cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) fornisce un approccio alternativo per derivare culture neuronali di fibroblasti cutanei attraverso specifico paziente iPSC, ma questo processo è laborioso, richiede competenze specifiche e una grande quantità di risorse, e può richiedere diversi mesi. Ciò impedisce l'ampia applicazione di questa tecnologia per lo studio delle malattie neurologiche. Per superare alcuni di questi problemi, abbiamo sviluppato un metodo per ottenere cellule staminali neurali direttamente dal sangue periferico umano adulto, bypassando il processo di derivazione IPSC. Cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da sangue periferico umano adulto sono state coltivate in vitro e trasfettate con vettori Sendai contenenti fattori di trascrizione Sox2, ottobre3/4, Klf4, e c-Myc. I risultati di trasfezione di cambiamenti morfologici nelle cellule che vengono ulteriormente selezionati utilizzando media progenitrici neurali umane contenenti base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) e fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Le cellule risultanti sono caratterizzate dall'espressione di marcatori di cellule staminali neuronali, come nestin e SOX2. Queste cellule staminali neurali potrebbero essere ulteriormente differenziati ai neuroni, astroglia e oligodendrociti in mezzi differenziazione specificato. Usando campioni di sangue periferico umano facilmente accessibili, questo metodo potrebbe essere utilizzato per ottenere cellule staminali neurali per un'ulteriore differenziazione di cellule neurali per la modellazione in vitro di disturbi neurologici e può avanzare studi relativi alla patogenesi e il trattamento di queste malattie.

Introduzione

In vitro colture neuronali sono state utilizzate come strumento fondamentale per lo studio di malattie neurologiche. Animale primario (principalmente roditori) colture neuronali 1, 2 e linee cellulari neuronali umane derivate da gliomi o altri tumori sono i più comunemente utilizzati in tali studi. Tuttavia, è stato riconosciuto che non vi sono differenze significative tra roditori e cellule umane. Molte scoperte basate su roditori non possono essere tradotti per gli esseri umani. Inoltre, con i rapidi sviluppi l'analisi delle informazioni di massa genomica e la relativamente facile editing gene e sequenziamento dell'intero genoma, la tendenza è sempre più orientata alla scoperta di malattia geni inclini e delineare le loro funzioni e ruoli a malattie specifiche, il che rende i pochi neuronale umana linee cellulari solo hanno limitato l'utilizzo. Teoricamente, colture neuronali primarie umane derivate da campioni di sistema nervoso paziente sono la scelta migliore ma sono impossibili da ottenere; meth quindi alternativaODS sono necessari. Negli ultimi anni, alcuni approcci sono stati perseguiti, con due è il più distinguibili. Dopo lo sviluppo della tecnica di generare cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) utilizzando il mouse e cellule somatiche umane 3, 4, cellule neurali potrebbe essere ulteriormente differenziate da loro 5-7. Tuttavia, la generazione e la caratterizzazione iPSC richiede intensità di lavoro, le tecniche, e l'ingresso di tempo, a volte anche eccessivamente. Poco dopo, un altro approccio è stato sviluppato per trasformare direttamente le cellule neuronali dalle cellule somatiche 8, 9. Poiché i neuroni risultanti sono non-proliferativa, limita la sua applicazione in studi intensivi e screening di farmaci, che richiede una grande quantità di cellule. Per prendere i vantaggi di entrambe le tecniche, diretta derivazione di cellule staminali neurali / cellule progenitrici a partire da cellule somatiche è stata esplorata da diversi gruppi di 10-12, che bypassa il tedioso processo di generazione iPSC e caratterizzazione, ma comunque provides un numero decente di cellule staminali neurali per dopo differenziamento neurale. Abbiamo precedentemente dimostrato che in seguito all'introduzione dei fattori di trascrizione Yamanaka in cellule progenitrici ematopoietiche, cellule staminali neurali possono essere generati direttamente utilizzando una cellula progenitrice neurale selezionando media 13. Qui riportiamo il metodo in dettaglio.

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Protocollo

1. Arricchimento di emopoietiche progenitrici cellule da sangue intero per adulti

NOTA: le cellule progenitrici ematopoietiche o cellule CD34 + possono essere purificati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) derivate da una varietà di fonti, tra cui il sangue del cordone, materiale leucaferesi e sangue intero con metodi basati gradiente di densità di centrifugazione. Il metodo qui elencati utilizza sangue intero come esempio.

  1. Isolamento di PBMC da sangue intero:
    1. Aggiungere 4,5 ml di mezzo di separazione dei linfociti al tubo SepMate pipettando attraverso il foro centrale dell'inserto.
    2. Diluire il campione di sangue con un uguale volume di DPBS sterili contenenti siero umano 2% (v / v). Ad esempio, diluire 5 ml di campione con 5 ml di siero umano DPBS + 2%.
    3. Aggiungere il campione diluito pipettando giù il lato del tubo. Fare attenzione a non versare il campione direttamente attraverso il foro centrale.
    4. Centrifugare a 1200 xg per 10 minuti a RT.
    5. Rimuovere con attenzione il surnatante sopra il livello PMBC.
    6. Raccogliere lo strato PBMC (nuvoloso) in un nuovo tubo.
    7. Aggiungere 15 ml di fosfato di Dulbecco tamponata Saline (DPBS) contenente siero umano 2% nel tubo e centrifugare a 150 xg per 10 min a RT con il freno off.
    8. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 15 ml di DPBS contenente siero umano 2%. Contare il numero di cellule.
    9. Centrifugare a 690 xg per 10 min a RT. Rimuovere tutto il surnatante dal tubo.
    10. Risospendere le cellule a 1 x 10 7 cellule per 15 ml di medium (IMDM) Dulbecco modificato di Iscove contenente 1% di antibiotici (v / v) e siero umano al 10% (v / v).
    11. Incubare le cellule O / N a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore prima isolare cellule CD34 +.
  2. Selezione positiva di cellule CD34 + da PBMC utilizzando CD34 Multisort Kit:
    NOTA: lavoro veloce e utilizzare soluzioni pre-raffreddato a rendere le cellule freddo e prevenire tappaturadi anticorpi sulla superficie cellulare e l'etichettatura di cellule non-specifico per l'istruzione kit.
    1. Raccogliere tutti PMBCs in un tubo da 50 ml e contare il numero di cellule totali nel mezzo.
    2. Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min. Rimuovere completamente tutto il surnatante.
    3. Risospendere 8 fino a 10 300 cellule per ml in tampone tallone (DPBS contenente 0,5% di siero umano (v / v) e 2 mM EDTA).
    4. Aggiungere 100 ml di FcR reagente di bloccaggio e aggiungere 100 ml di MultiSortMicroBeads CD34.
    5. Mescolare bene e incubare per 30 minuti in frigorifero (2 - 8 ° C).
    6. Lavare le cellule aggiungendo 2 ml di tampone per tallone 10 8 cellule e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. Rimuovere completamente il surnatante.
    7. Risospendere fino a 10 8 cellule in 500 microlitri di tampone.
    8. Inserire colonna MACS LS nel campo magnetico di un separatore MACS e preparare colonna risciacquando con 3 ml di tampone tallone.
    9. Applicare sospensione cellulare sul center della colonna. Cellule senza etichetta fluiranno attraverso cui possono essere raccolti, se si preferisce.
    10. Lavare colonna tre volte con 3 ml di tampone tallone.
    11. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarlo su un tubo 15 ml.
    12. Aggiungere 5 ml di tampone tallone nella colonna e lavare immediatamente le cellule marcate magneticamente spingendo lo stantuffo nella colonna.
    13. Aggiungere 20 ml di MULTISORT Reagente di uscita per 1 ml di sospensione cellulare. Mescolare bene e incubare per 10 minuti in frigorifero (2 - 8 ° C).
    14. Aggiungere 1 - 2 ml di tampone tallone per 10 7 cellule e centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a RT. Rimuovere completamente il surnatante.
    15. Risospendere le cellule in 50 ml di tampone tallone per 10 7 cellule.
    16. Aggiungere 30 ml di MULTISORT arresto reagente per 10 7 cellule e incubare per 15 minuti in frigorifero.
    17. Aggiungere 5 ml di tampone tallone e centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a RT. Scartare il surnatante.

2. Derivazione di cellule staminali neurali indotte da cellule CD34 +

  1. Cellule CD34 + cultura:
    NOTA: media appena preparato deve essere utilizzato entro 7 giorni se conservata in frigorifero. Significativa perdita di cellule CD34 può essere osservata dopo 24 ore, ma la significativa proliferazione delle cellule dovrebbe essere evidente, soprattutto dopo giorno 5. Se il numero di cellule diminuisce continuamente o non c'è proliferazione, esso implica o cattiva qualità delle cellule medie o CD34 e cellule non deve essere utilizzato per il passo successivo.
    1. Risospendere e cultura CD34 + cellule CD34 mantenendo medio (StemSpan SFEM terreno contenente trombopoietina umana (TPO, 100 ng / ml), FMS-come tirosin chinasi 3 (Flt-3) ligando (100 ng / ml) e fattore delle cellule staminali (SCF, 100 ng / ml), interleuchina-6 (IL-6, 20 ng / ml) e interleuchina-7 (IL-7, 20 ng / ml)) in una piastra a 24 pozzetti (fino a 3 x 10 5 / pozzetto in 1 ml di terreno per pozzetto) a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.
    2. After 24 ore, raccogliere le cellule galleggianti e centrifugare le cellule a 110 xg a temperatura ambiente per eliminare eventuali cellule collegate e detriti cellulari. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 1 ml di CD34 mantenere fresco medio e seme in una nuova piastra 24 pozzetti (fino a 1 x 10 5 / pozzetto) a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore per 5 giorni aggiuntivi.
    3. Sostituire la metà del mezzo ogni l'altro giorno aspirando accuratamente la metà superiore surnatante mentre le cellule CD34 + sono galleggianti sul fondo dei pozzetti (Figura 1A).
  2. Sendai trasfezione virus:
    1. Il giorno 5, raccogliere le cellule CD34 e centrifugare le cellule a 170 xg per 10 min a RT. Scartare il surnatante.
    2. Risospendere le cellule in terreno fresco a 1 x 10 5 / pozzetto in una piastra da 24 pozzetti in 1 ml di terreno.
    3. Scongelare un kit riprogrammazione cytotune-iPS Sendai dapprima immergendo il fondo dei tubi in un bagno di 37 ° C l'acqua per 10 secondi e poi completamente scongelare unt RT. Brevemente centrifugare le provette e metterli su ghiaccio. Preparare l'impasto Sendai miscelando il volume consigliato di ogni virus elencati sul certificato di analisi (COA) per il lotto corrispondente. MOI 15 è raccomandato.
    4. Aggiungere mix Sendai a ciascun pozzetto di cellule CD34. Mescolare i pozzetti scuotendo delicatamente. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.
    5. Osservare l'efficienza di trasfezione dopo 24 ore. Si noti che aggregati di cellule e la formazione sfera sono indicatori per trasfezione di successo (Figura 1B).
    6. Cambiare la metà del mezzo trasferendo accuratamente la metà superiore del mezzo ad un altro bene. Se ci sono sfere cellule nel nuovo pozzo, aggiungere la stessa quantità di mezzo fresco.
    7. Modificare media ogni l'altro giorno ripetendo il passaggio 2.2.6.
  3. Induzione di cellule staminali neurali:
    NOTA: A seconda delle condizioni delle cellule, circa 5 o 7 giorni dopo la trasfezione, le cellule aderenti monostrato raggiungeranno 30 -50% di confluenza (Figura 1C).
    1. Rimuovere il surnatante contenenti celle galleggianti e sfere e quindi aggiungere 1 ml di terreno progenitrici neurali (Dulbecco Modified Eagle Medium: miscela di nutrienti F-12 (DMEM / F12), contenente 1x N2 supplemento, 0,1% (w / v) di albumina sierica bovina ( BSA), 1% (v / v) antibiotici, 20 ng / ml di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) e 20 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF)) nelle cellule aderenti.
    2. Facoltativamente, dissociare le sfere cellule pipettando delicatamente e centrifugare le cellule a 170 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno progenitrici neurali in una nuova piastra 24 pozzetti rivestite con matrigel per istruzione come backup.
    3. Modificare il supporto a giorni fino alle cellule raggiungono 60 - 80% confluenti, di solito dopo 1 settimana.
    4. Eliminare il surnatante e aggiungere 1 ml di terreno di cellule staminali neurali (media siero libero, NSC SFM). Dissociare il celle utilizzando un raschietto cellulare seguitada molto delicato pipettaggio.
    5. Rimuovere le cellule e sementi tutti in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Aggiungi un altro 1 ml di mezzo di cellule staminali neurali per fare 2 ml supporto per ciascun bene. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.
    6. Modificare media ogni l'altro giorno.
    7. Quando le cellule hanno raggiunto il 60% di confluenza, dissociarsi e replate le cellule a rapporto 1: 3 seguendo la procedura descritta in 2.3.4 e 2.3.6.
  4. Congelamento delle cellule staminali neurali:
    1. Preparare cellule staminali neurali congelamento mezzo aggiungendo 20% dimetilsolfossido (DMSO) nel terreno di cellule staminali neurali. Mantenere il mezzo congelamento su ghiaccio.
    2. Dissociano le cellule in un 6-pozzetti, utilizzando raschietto cella seguita pipettando delicatamente. Contare le cellule. Centrifugare le cellule a 170 xg per 10 min a RT. Scartare il surnatante.
    3. Risospendere le cellule in terreno cellule staminali neurali a 1 x 10 6 / ml. Aggiungere lo stesso volume di congelamento mezzo alle cellule.
    4. Aggiungere 1 ml (5 x 10 5 cellule totali) di cellule in un esageratamente. Congelare le cellule utilizzando un congelamento contenitore Mr. Froster seguendo le istruzioni.

3. Neural differenziazione cellulare

  1. Cellule neuronali differenziazione:
    1. Quando le cellule staminali neurali raggiungono l'80% di confluenza, staccare le cellule staminali neurali con un poliziotto di gomma e poi dissociarsi pipettando delicatamente.
    2. Contare le cellule e regolare la concentrazione di 1 x 10 5 / ml in mezzo di cellule staminali neurali.
    3. Per la differenziazione neuronale, piastra le cellule sulla copertura poli-D-lisina / laminina rivestito scivola in piastre da 24 pozzetti a 1 x 10 5 / bene. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.
    4. Sostituire il supporto con il mezzo differenziamento neurale (DMEM / F12 contenenti 1x N2 supplemento, 1x B27 supplemento, 300 ng / ml cAMP, 0,2 mm di vitamina C, di 10 ng cervello ml / derived neurotrophic factor (BDNF) e 10 ng / ml cellule gliali derivati fattore neurotrofico (GDNF)) after 24 ore. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.
    5. Cambiare terreno di differenziamento neurale due volte alla settimana per 2 settimane.
  2. Differenziazione astrogliali:
    1. Dissociare le cellule staminali neurali pipettando.
    2. Contare le cellule e regolare la concentrazione cellulare di 5 x 10 4 cellule / ml. Seme le cellule su piastre da 24 pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.
    3. Sostituire il mezzo con DMEM / F12 con siero fetale bovino 10% (FBS) e incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.
    4. Cambiare media due volte alla settimana per 2 settimane. Se le cellule raggiungono confluenza prima di 2 settimane replate le cellule seguenti operazioni 3.2.1 e 3.2.2.
  3. Oligodendrocyte differenziazione:
    1. Dissociare le cellule staminali neurali pipettando.
    2. Contare le cellule e di semi 1 x 10 5 cellule in piastre da 24 pozzetti rivestiti di poli-L-Ornitina in 1 ml di oligodendrociti Differentimedia zione costituito da DMEM / F12 contenenti supplemento N2, 10 ng / ml di piastrine derivato fattore di crescita-AA (PDGF-AA), 2 ng / ml di neurotrofina-3 (NT-3), 2 ng / ml di sonic hedgehog ( Shh), e 3 Nm di triiodotironina (T3). Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.
    3. Cambiare media due volte alla settimana per 2 settimane.
    4. Sostituire il mezzo con DMEM / F12 con 1xN2 supplemento e 3 Nm di T3 e di cultura le cellule per una settimana supplementare per proteina basica della mielina (MBP) produzione.

4. Immunofluorescenza

  1. Sostituire media con 4% paraformaldeide (PFA). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  2. Scartare PFA e lavare con PBS contenente 0,1% Triton X-100 (PBS-T) per 3 volte, 5 min ciascuna volta.
  3. Permeabilize cellule con PBS contenente 0,5% Triton X-100 per 10 minuti a RT.
  4. Bloccare le cellule con PBS-T contenente siero di capra 4% per 20 minuti a RT.
  5. Incubare le cellule con corrispondenti Antibo primariostampi diluito in PBS-T contenente 0,1% BSA per 2 ore a temperatura ambiente o O / N in cella.
  6. Lavare le cellule per 3 volte con PBS-T, 5 min ciascuna volta. Incubare le cellule con corrispondenti anticorpi secondari accoppiati con un fluorocromo utilizzando 1: 400 di diluizione in PBS-T contenente 0,1% BSA per 1 ora su un agitatore al buio.
  7. Lavare le cellule con PBS-T contenente 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 10 minuti a RT.
  8. Lavare le cellule due ulteriori volte con PBS-T per 5 minuti ciascuno a RT.
  9. Osservare le cellule marcate con un microscopio e scattare foto (figura 3).

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Risultati

La qualità delle cellule CD34 è critico per il successo di trasduzione di cellule staminali neurali. Cellule CD34 alta qualità proliferano durante il primo paio di giorni di coltura e appaiono come non aderenti, cellule omogeneamente rotonde, galleggiante appena sopra il fondo di recipienti di coltura (Figura 1A). I risultati infettati in aggregati di cellule, che si espande nel tempo (Figura 1B), mentre si possono verificare aggregati cellulari non specifici durante coltura cellu...

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Discussione

Viene fornito un protocollo dettagliato per generare direttamente le cellule staminali neurali da cellule progenitrici ematopoietiche periferiche.

Rispetto alle cellule di fibroblasti, sangue periferico umano è più accessibile. Utilizzando il protocollo presentato, più di 1 x 10 5 cellule progenitrici ematopoietiche o cellule CD34 positive, può essere arricchito da 10 ml di sangue intero. Sebbene contaminazione con piastrine di solito non è evitabile, può essere facilmente ridotto...

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Dichiarazioni

Lo studio è finanziato dai fondi intramurali del NIH.

Ringraziamenti

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreno di separazione linfocitarioLonza17-829E1x
SepMateStemcell Technologies1541515 ml
Siero umanoInvitrogen34005-100
AntibioticiGibco15240-0621%
CD34 MultiSort KitMiltenyi Biotec130-056-701
EDTACellgro46-034-Cl2 mM
MACS LS colonnaMiltenyi Biotec130-042-401
StemSpan SFEM mediumStemcell Technologies96501x
IMDMQuality Biologicals112-035-1011x
TPOPeprotech300-18100 ng/ml
Flt-3Peprotech300-19100 ng/ml
SCFPeprotech300-07100 ng/ml
IL-6Peprotech200-0620 ng/ml
IL-7Peprotech200-0720 ng/ml
IPS Sendai Kit di riprogrammazioneLife TechnologiesA1378001
Raschietto cellulareSarstedt83.183
DMSOSigmaD2650
FialeCryoTubeThermo368632
Mr. Frosty contenitoreThermo5100-0001
DMEM/F12Life Technologies12400-0241x
integratore di N2Life Technologies17502-0481x
albumina sierica bovinaSigmaA29340,1% (p/v)
bFGFPeprotech100-18B20 ng/ml
EGFIntegratore PeprotechAF-100-15
B27Life Technologies17504-0441x
NSC senza siero mediumLife TechnologiesA10509011x
vetrini coprioggetti rivestiti in poli-D-lisina/lamininaBD Bioscences354087
cAMPSigmaA9501300 ng/ml
Vitamina CSigmaA02780,2 mM
BDNFPeprotech450-0210 ng/ml
GDNFPeprotech450-1010 ng/ml
Poli-L-ornitinaSigmaP49571x
PDGF-AAPeprotech100-13A10 ng/ml
NT-3Peprotech450-032 ng/ml
ShhPeprotech1314-SH/CF2 ng/ml
T3SigmaT63973 nM
PFASigmaP61484%
PBSQualità Biologica119-069-1011x
Siero di capraSigmaG90234%
TritonX-100SigmaT9284
Monoclonale di topo anti-NestinaMilliporeAB59221:1.000 diluizione
Anti-SOX2 anticorpoCellule staminali applicateASA0120Pronto all'uso
Topo anti-β Anticorpo III-tubulinaPromegaG712ADiluizione 1:1.000
Anticorpo anti-GFAP di coniglioSigmaG4546Diluizione 1:100
Anticorpo anti-O4R& D SystemsMAB1326IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 capra anticorpo anti-coniglioLife techniologiesA11012Diluizione 1:400
Alexa Fluor 488 capra anti-topo anticorpoLife techniologiesA110011:400 diluizione
Alexa Fluor 488 capra anti-topo Anticorpo IgMLife techniologiesA210421:250 diluizione
DAPISigmaD95421 μ g/ml

Riferimenti

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