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Articolo metodologico

Sfruttando la domanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder cicloaddizione per Pretargeted PET Imaging

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⸱

DOI:

10.3791/52335

⸱

3 febbraio 2015

 ,  , 
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La cicloaddizione di Diels-Alder per la domanda di elettroni inversi bioortogonali è stata sfruttata per creare una strategia di imaging PET premirata efficace e modulare per il cancro. In questo protocollo, le fasi di questa metodologia sono descritte nel contesto di un sistema modello che impiega l'anticorpo mirato al cancro del colon-retto huA33 e un radioligando marcato con 64Cu.

Abstract

Grazie alla loro squisita affinità e specificità, gli anticorpi sono diventati vettori estremamente promettenti per la somministrazione di radioisotopi alle cellule tumorali per l'imaging PET. Tuttavia, la necessità di marcare anticorpi con radionuclidi con lunghe emivite fisiche spesso si traduce in elevati tassi di dose di radiazioni di fondo ai tessuti non bersaglio. Al fine di aggirare questo problema, abbiamo impiegato una strategia di imaging PET premirata basata sulla reazione di cicloaddizione di Diels-Alder a domanda inversa di elettroni. La metodologia disaccoppia l'anticorpo dalla radioattività e quindi sfrutta le caratteristiche positive degli anticorpi, evitando al contempo i loro svantaggi farmacocinetici. Il sistema è composto da quattro fasi: (1) l'iniezione di un coniugato mAb-trans-ciclooctene (TCO); (2) un periodo di localizzazione durante il quale l'anticorpo si accumula nel tumore e si libera dal sangue; 3) l'iniezione della tetrazina radiomarcata; e (4) la click ligation in vivo dei componenti seguita dalla clearance del radioligando in eccesso. Nell'esempio presentato nel lavoro in esame, un radioligando di tetrazina marcato con 64Cu-NOTA e un anticorpo umanizzato coniugato trans-ciclooctene (huA33) sono stati utilizzati con successo per delineare i tumori del cancro del colon-retto SW1222 con un elevato contrasto tumore-fondo. Inoltre, la metodologia di pretargeting produce immagini di alta qualità a solo una frazione della dose di radiazioni al tessuto non bersaglio creata da radioimmunoconiugati marcati direttamente con 64Cu o 89Zr. In definitiva, la modularità di questo protocollo è uno dei suoi maggiori vantaggi, poiché la porzione trans-ciclooctene può essere aggiunta a qualsiasi anticorpo non internalizzante e la tetrazina può essere attaccata a un'ampia varietà di radioisotopi.

Introduzione

Negli ultimi trent'anni, tomografia ad emissione di positroni (PET) è diventato uno strumento indispensabile clinica nella diagnosi e gestione del cancro. Anticorpi sono stati a lungo considerati vettori promettenti per la fornitura di radioisotopi ad emissione di positroni per tumori a causa della loro affinità squisita e specificità per biomarcatori tumorali. 1,2, tuttavia, relativamente lenti farmacocinetica in vivo di anticorpi mandati l'uso di radioisotopi con più giorni emivita fisica. Questa combinazione può produrre alte dosi di radiazioni agli organi non bersaglio di pazienti, una complicazione importante che è di particolare rilevanza clinica poiché radioimmunoconjugates vengono iniettati per via endovenosa e quindi - a differenza parziali scansioni corpo CT - risultato in dosi assorbite in ogni parte del corpo, indipendentemente tessuti interrogati.

Per evitare questo problema, notevole sforzo è stato dedicato alla svipment di strategie di imaging PET che disaccoppiare radioisotopo e la frazione di targeting, sfruttando in tal modo le proprietà vantaggiose di anticorpi e contemporaneamente costeggiando i loro limiti farmacocinetiche intrinseche. Queste strategie - spesso definito pretargeting o il targeting più fasi - tipicamente impiegano quattro fasi: (1) la somministrazione di un anticorpo in grado di legare sia un antigene ed un radioligando; (2) l'accumulo dell'anticorpo nel tessuto bersaglio e la sua clearance dal sangue; (3) la somministrazione di una piccola molecola radioligando; e (4) la legatura in vivo del radioligando all'anticorpo seguita dalla rapida clearance dell'eccesso radioligando. 3-8 In alcuni casi, un agente di compensazione addizionale viene iniettato tra i passaggi 2 e 3, al fine di accelerare l'escrezione di qualsiasi anticorpo che deve ancora impegnare il tumore e rimane nel sangue. 5

In generale, two tipi di strategie pretargeting sono più diffusi in letteratura. Mentre entrambi hanno dimostrato con successo in modelli preclinici, possiedono anche limitazioni chiave che hanno impedito la loro applicabilità clinica. La prima strategia si basa sul alta affinità tra streptavidina anticorpi coniugati e radiolabels biotina-modificato; Tuttavia, l'immunogenicità degli anticorpi streptavidina-modificato ha dimostrato di essere un problema preoccupante per quanto riguarda la traduzione. 5,6,9,10 La seconda strategia, al contrario, impiega anticorpi bispecifici geneticamente ingegnerizzati per legare sia un cancro biomarker antigene e una piccola aptene radiomarcato molecola. 3,11-14 Mentre quest'ultimo rotta è certamente creativo, la sua ampia applicabilità è limitata dalla complessità, spesa, e la mancanza di modularità del sistema.

Recentemente, abbiamo sviluppato e pubblicato una metodologia di imaging PET pretargeted basato sulla domanda inversa elettrone Diels-Alder (IEDDA) reazione di cicloaddizione tra -cyclooctene trans (TCO) e tetrazina (Tz;. Figura 1) 11 Mentre la reazione si è stato conosciuto per decenni, IEDDA chimica ha conosciuto una rinascita negli ultimi anni come una tecnica bioconjugation click chemistry, come illustrato da l'affascinante lavoro dei gruppi di Ralph Weissleder, Giuseppe Volpe, e Peter Conti, tra gli altri. 12-15 L'IEDDA cicloaddizione è stato applicato in una vasta gamma di impostazioni, tra cui imaging di fluorescenza con peptidi, anticorpi, e nanoparticelle e di imaging nucleare . con entrambi radiohalogens e radiometalli 16-26 La legatura è ad alto rendimento, pulito, veloce (k 1> 30.000 M -1 sec -1), selettivo, e - critica -. bioorthogonal 27 E mentre un certo numero di tipi di click chemistry - compresi azide-alkyne cicloaddizioni Cu-catalizzata, cicloaddizioni azide-alkyne ceppo-promossa, e Staudinger ligzioni -. bioorthogonal sono pure, è la combinazione unica di cinetica di reazione veloci e bioorthogonality che rende IEDDA chimica così adatto per applicazioni pretargeting in organismi interi 28,29 Lungo queste linee, è importante notare che la recente relazione nostro laboratori non è stato il primo ad applicare IEDDA chimica per pretargeting: il primo rapporto delle immagini pretargeted con IEDDA sorto dal lavoro di Rossin, et al e caratterizzato da una metodologia SPECT impiegando un 111 In marcato tetrazina 30..

Come abbiamo discusso in precedenza, la metodologia pretargeting ha quattro abbastanza semplici passaggi (Figura 2). Nel protocollo a portata di mano, sarà descritta una strategia pretargeted per imaging PET di tumore del colon-retto, che si avvale di un Cu-NOTA-marcato radiolegante 64 tetrazina e un coniugato TCO modificato dell'anticorpo huA33. Tuttavia, in ultima analisi, la modularità di questa metodologia è uno dei suoi grbeni ne mangerai, come la frazione -cyclooctene trans possono essere aggiunti a qualsiasi anticorpo non interiorizzare, e la tetrazina può essere collegato a una grande varietà di giornalisti radioattive.

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Protocollo

ETICA DICHIARAZIONE: Tutti gli esperimenti sugli animali in vivo descritti sono stati eseguiti secondo un protocollo approvato e alle linee guida etiche del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Sintesi di Tz-Bn-NOTA

  1. In un piccolo recipiente di reazione, sciogliere 7 mg NH 2--BN NOTA (1,25 x 10 -2 mmoli) in 600 microlitri tampone di NaHCO3 (0,1 M, pH 8,1). Controllare il pH della soluzione. Se necessario, regolare il pH della soluzione a 8,1 utilizzando piccole aliquote di 0,1 M Na 2 CO 3.
  2. Aggiungere la soluzione di NH 2 -BN-NOTA a 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) in una provetta 1,7 ml microcentrifuga.
    NOTA: Il Tz-NHS può essere sia pesato secco o aggiunta di una soluzione madre di DMF secco o DMSO (<50 ml).
  3. Lasciare la soluzione di reazione risultante a reagire per 30 minuti a RTcon agitazione lieve.
  4. Dopo 30 minuti, purificare il prodotto con fase inversa C 18 cromatografia HPLC per rimuovere reagito NH 2 -BN-NOTA. L'NH 2 -BN-NOTA può essere monitorato alla lunghezza d'onda di 254 nm, mentre il TZ-NHS e Tz-Bn-NOTA sono meglio controllati alla lunghezza d'onda di 525 nm.
    NOTA: I tempi di ritenzione sono ovviamente fortemente dipendente dalla configurazione apparecchiature HPLC di ogni laboratorio (pompe, colonne, tubi, ecc). Tuttavia, per presentare un esempio, se un gradiente di 0: / H 2 O (entrambi con 0,1% TFA) a 100 100 MeCN: 0 MeCN / H 2 O oltre 25 min ed una analitica 4,6 x 250 millimetri C 18 colonna viene utilizzata , i tempi di ritenzione di Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, e NH 2 -BN-NOTA si aggirano intorno a 15 min, 16.5 min, e 10 minuti rispettivamente. Il prodotto può essere purificato dagli altri componenti della reazione in un singolo run o più corse con un C 18 colonna HPLC semi-preparativa o preparativo. 1 H-NMR, analeytical HPLC, e ESI-MS sono tutti i metodi che possono essere utilizzati per verificare la purezza del completamento precursore Tz-Bn-NOTA. 11
  5. Congelare l'eluente HPLC raccolti con azoto liquido.
  6. Avvolgere il tubo di raccolta congelato in un foglio di alluminio opaco.
  7. Posizionare il tubo di raccolta congelati in un recipiente liofilizzazione O / N per rimuovere la fase mobile HPLC.
  8. Conservare il prodotto purificato (un rosa brillante solido) al buio a -80 ° C.
    NOTA: Questo è un punto di sosta accettabile nella procedura. Il precursore Tz-Bn-NOTA completato è stabile per almeno 1 anno in queste condizioni.

2. Preparazione di huA33-TCO immunoconiugato

  1. In una provetta 1,7 ml, preparare un 1 mg / ml (2,7 mM) soluzione TCO-NHS in secca DMF.
  2. In una provetta 1,7 ml microcentrifuga, preparare un 2 mg / ml (13,3 micron) di huA33 in 1 ml di tampone fosfato, pH 7.4 (0,01 M PO 4 3-, 0,154 M NaCl).
  3. Utilizzando piccole aliquote (<5 microlitri) di 0,1 M Na 2 CO 3, regolare il pH della soluzione a 8,8-9,0 anticorpi. Utilizzare la carta pH o pH-metro con un microelettrodo per monitorare il pH, e fare attenzione a non permettere il pH di elevarsi al di sopra di pH 9,0.
  4. Una volta che la soluzione di anticorpo è alla giusta pH, aggiungere un volume della soluzione TCO-NHS corrispondenti a 8 equivalenti molari di dell'estere attivato. Ad esempio, aggiungere 7,9 ml di 1 mg / ml soluzione TCO-NHS (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) per il 1 ml di soluzione di 2 mg / ml di anticorpi huA33 (1.33 x 10 -8 mol huA33). Non superare il 5% in volume DMF nella soluzione.
  5. Mescolare delicatamente la soluzione invertendo la provetta diverse volte.
  6. Avvolgere la provetta in un foglio di alluminio opaco.
  7. Lasciare che la soluzione per incubare per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione lieve.
  8. Dopo 1 ora a RT, purificare l'immunoconiugato risultante con un siz getta preconfezionatoe l'esclusione colonna dissalazione. Innanzitutto, lavare la colonna esclusione dimensionale come descritto dal fornitore per rimuovere eventuali conservanti presenti nella colonna durante la conservazione. Quindi, aggiungere la miscela di reazione alla colonna esclusione dimensionale, lavare la colonna con 1,5 ml 0,9% soluzione salina sterile, e successivamente raccogliere il prodotto con 2 ml di 0,9% soluzione salina sterile come eluente.
    NOTA: Questo passaggio produrrà il completamento huA33-TCO come soluzione 2 ml.
  9. Misurare la concentrazione della risultante huA33-TCO su un UV-Vis spettrofotometro.
  10. Se una concentrazione maggiore è desiderato, concentrare la soluzione huA33-TCO utilizzando un'unità filtro centrifugo con un peso molecolare di 50.000 cut-off.
    NOTA: E 'importante notare che, mentre huA33 e una varietà di altri anticorpi noti (ad esempio, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, e J591) sono molto tolleranti di essere concentrato, l'aggregazione e la precipitazione può verificarsi dalla concentrazione in altri casi. I ricercatori di tentare questo procedUre con un nuovo anticorpo dovrebbe fidarsi letteratura o la propria conoscenza di anticorpo in questione per quanto riguarda se non concentrare l'anticorpo.
  11. Conservare il completamento immunoconiugato huA33-TCO a 4 ° C al buio.
    NOTA: Questo è un punto di sosta accettabile nella procedura. Il completamento coniugato mAb-TCO deve essere stabile per almeno 3 mesi in queste condizioni di conservazione.

3. 64 Cu radiomarcatura di Tz-Bn-NOTA

NOTA: Questo passaggio del protocollo comporta il trattamento e la manipolazione di radioattività. Prima di eseguire questi passi - o l'esecuzione di qualsiasi altro lavoro con radioattività - i ricercatori dovrebbero consultarsi con il Dipartimento di sicurezza di radiazione del proprio istituto. Adottare tutte le misure possibili per ridurre al minimo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.

  1. In una provetta 1,7 ml, preparare un 0,5 mg / ml (723 um) soluzione di Tz-Bn-NOTA.
  2. In un MicroC 1,7 mltubo entrifuge, aggiungere 10 ml di soluzione di Tz-Bn-NOTA (5 mg) per 400 ml di 0,2 M NH 4 OAc pH 5,5 tampone.
  3. Nell'interesse di una corretta radiochimica nota-keeping, misurare e registrare la quantità di radioattività nel campione con un calibratore di dosi prima e dopo i passi successivi nel protocollo di seguito (3,4-3,8). Ciò contribuirà con la determinazione precisa dei rendimenti radiochimica.
  4. Aggiungi 2.000 uCi (74 MBq) di 64 Cu alla soluzione Tz-Bn-NOTA.
    NOTA: in genere, [64 Cu] CuCl 2 viene fornito in un piccolo volume (<30 ml) di 0,1 N HCl, e quindi solo piccoli volumi (<10 ml) di questa soluzione madre sono necessarie per la reazione radiomarcatura. Se sono necessari grandi volumi della [64 Cu] CuCl 2 stock, la reazione radiomarcatura è tollerante di aumentare il volume di reazione complessiva. Tuttavia, il pH della soluzione di reazione radiomarcatura devono essere monitorati attentamente per garantireche non scenda al di sotto di pH 4,0.
  5. Lasciare che la soluzione per incubare per 10 min a RT con agitazione lieve.
  6. Dopo 10 min di incubazione, purificare il prodotto con fase inversa C 18 cromatografia HPLC. I tempi di ritenzione sono ovviamente altamente dipendenti dalla configurazione apparecchiature HPLC di ogni laboratorio (pompe, colonne, tubi, ecc). Tuttavia, per presentare un esempio, se un gradiente di 5:95 MeCN / H 2 O (entrambi con 0,1% TFA) a 95: 5 MeCN / H 2 O oltre 15 min viene utilizzato, il tempo di ritenzione di 64 Cu-Tz- Bn-NOTA dovrebbe essere di circa 9,8 minuti, mentre la connessione, non complessato 64 Cu si eluire con il fronte del solvente a circa 2-4 min.
  7. Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere l'eluente HPLC.
  8. Riprendere il prodotto 64 Cu-Tz-Bn-NOTA nello 0,9% soluzione salina sterile.
    NOTA: Dato il 12,7 hr fisica emivita di 64 Cu, questo non è un punto di arresto accettabile nel procedimento. Eseguire la sintesi di 64 Cu-Tz-Bn-NOTA immediatamente prima dell'iniezione del radiolegante, e seguire passo 3.7 immediatamente by Step 4.5.

4. In Vivo Pretargeted PET Imaging

NOTA: Come nella sezione protocollo 3, questa fase del protocollo comporta la gestione e la manipolazione della radioattività. Prima di effettuare questa procedura i ricercatori dovrebbero consultarsi con il Dipartimento di sicurezza di radiazione del proprio istituto. Adottare tutte le misure possibili per ridurre al minimo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.

  1. In una femmina atimici topo nudo, impianto sottocute 1 x 10 6 SW1222 cellule tumorali del colon-retto e permettere a questi di crescere in un xenotrapianto 100-150 mm 3 (9-12 giorni dopo l'inoculazione). 11
  2. Diluire un'aliquota della soluzione huA33-TCO dalla sezione protocollo 2 ad una concentrazione di 0,5 mg / ml in 0,9% soluzione salina sterile.
  3. Iniettare 200 microlitri della soluzione di huA33-TCO (100 ug) nella vena della coda del topo xenotrapianto-cuscinetto.
  4. Consentire 24 ore per l'accumulo del huA33-TCO nel tumore del mouse.
  5. Diluire il 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligando ad una concentrazione di 1,5 mCi / ml in 0,9% soluzione salina sterile.
  6. Iniettare 200 ml di soluzione di radiolegante 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (300 uCi; 11,1 MBq; 1.6 nmol di 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, assumendo una specifica attività di 6,7 MBq / nmol) nella vena della coda del xenotrapianto-cuscinetto topi.
  7. Al punto di tempo di imaging desiderato (ad esempio, 2, 6, 12 o 24 ore post-iniezione), anestetizzare il mouse con isoflurano 2%: miscela di gas ossigeno.
  8. Posizionare il mouse sul letto del piccolo scanner PET animali. Mantenere l'anestesia durante la scansione utilizzando una isoflurane 1%: miscela di ossigeno. Prima di mettere l'animale sul piatto dello scanner, verificare l'anestesia con il metodo punta pinch e applicare pomata veterinaria agli occhi del mouse per evitare l'essiccazione durante l'anestesia.
  9. Acquisire i dati di PET per il mouse con una staticascansione con un minimo di 20 milioni di eventi coincidenti utilizzando una finestra di energia di 350-700 keV ed una finestra di temporizzazione coincidenza di 6 nsec. Dopo aver completato l'acquisizione delle immagini, non lasciare incustodito il mouse e non metterlo in una gabbia con altri topi fino a quando non ha ripreso conoscenza.

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Risultati

Le prime tre fasi dell'esperimento - la sintesi di Tz-Bn-NOTA, la coniugazione di TCO per huA33, e la radiomarcatura della Tz-Bn-NOTA costruiscono (figure 3 e 4) - sono altamente affidabili. Nel caso della procedura sopra, il costrutto Tz-Bn-NOTA stato sintetizzato con alta resa e purezza. L'anticorpo huA33 stato modificato con 4,2 ± 0,6 TCO / mAb e Tz-Bn-NOTA era radiomarcato con 64 Cu a cedere il radiolegante purificato in> 99% di purezza radiochimica,> 85% di...

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Discussione

Il principale vantaggio di questa strategia PET pretargeted è che è in grado di delineare tumori con contrasto immagine target-to-background soltanto ad una frazione della dose di radiazione di fondo prodotto da anticorpi marcati direttamente. Ad esempio, nel sistema di imaging del cancro del colon-retto qui descritto, i dati provenienti da esperimenti biodistribuzione acuti sono stati impiegati per eseguire i calcoli di dosimetria per la strategia basata pretargeting-Cu 64 con direttamente marcato 64

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Prof. Ralph Weissleder, il Dr. Pat Zazzonico e il Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty per le utili conversazioni e il NIH per il finanziamento (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tetrazina NHS EsterSigma-Aldrich 764701Store a -80 gradi C
Trans-ciclooctene NHS EsterSigma-Aldrich 764523Negozio a -80 ° C
p-NH2-Bn-NOTAMacrocicliciB-601Negozio a -80 ° E

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