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Articolo metodologico

Generazione di cellule CAR T per adottiva terapia nel contesto di Glioblastoma standard di cura

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DOI:

10.3791/52397

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16 febbraio 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Duke Brain Tumor Immunotherapy Program, Department of Neurosurgery, Duke University, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Pathology, Duke University

In questo articolo

Sommario

Gli effetti linfodepletivi e immunomodulatori della chemioterapia e dello standard di cura delle radiazioni possono essere sfruttati per migliorare l'efficacia antitumorale dell'immunoterapia con cellule T. Descriviamo un metodo per generare cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) specifiche per EGFRvIII e somministrarle nel contesto dello standard di cura del glioblastoma.

Abstract

L'immunoterapia con cellule T adottive offre una strategia promettente per mirare ed eliminare in modo specifico i gliomi maligni. Le cellule T possono essere ingegnerizzate ex vivo per esprimere recettori chimerici dell'antigene specifici per gli antigeni del glioma (cellule T CAR). L'espansione e la funzione delle cellule CAR T trasferite in modo adottivo possono essere potenziate dagli effetti linfodepletivi e tumoricidi della chemioterapia e della radioterapia standard di cura. Descriviamo un metodo per generare cellule T CAR che hanno come bersaglio EGFRvIII, un antigene specifico del glioma, e per valutarne l'efficacia quando combinato con un modello murino di glioblastoma standard di cura. Le cellule T sono ingegnerizzate per trasduzione con un vettore retrovirale contenente il gene CAR anti-EGFRvIII. Gli animali portatori di tumore sono sottoposti a condizionamento dell'ospite mediante un ciclo di temozolomide e irradiazione dell'intero cervello a regimi di dose progettati per modellare lo standard clinico di cura. Le cellule T CAR vengono quindi somministrate per via endovenosa agli ospiti innescati. Questo metodo può essere utilizzato per valutare l'efficacia antitumorale delle cellule CAR T nel contesto dello standard di cura.

Introduzione

Glioblastoma (GBM) è il tumore maligno al cervello primario più comune ed è invariabilmente fatale. La resezione chirurgica accoppiato con standard di non-specifica delle cure di chemioterapia e radioterapia non riesce ad eliminare completamente le cellule maligne, con conseguente prognosi infausta di meno di 15 mesi in pazienti affetti da questa malattia 1. Al contrario, l'immunoterapia offre un metodo preciso per specifico le cellule tumorali, e quindi ha il potenziale per servire come piattaforma trattamento altamente efficace con un ridotto rischio di tossicità garanzie 2-4. Le cellule T progettati ex vivo per esprimere i recettori chimerici antigene (auto) offrono una strategia versatile per tumore immunoterapia. CAR vengono generati fondendo la regione variabile extracellulare di un anticorpo con la molecola di segnalazione uno o più cellule T intracellulare (s), al posto di un integrale complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) -restricted recettore delle cellule T 5. Questo modo di anticorpi come att antigeneon permette cellule T antigene-specifiche reattivi per riconoscere e rispondere ad antigeni tumorali, in assenza di MHC e possono essere adattati per un antigene repertorio virtualmente infinita.

Cellule T ingegnerizzate CAR contro una varietà di antigeni tumorali hanno dimostrato l'efficacia preclinica e promessa eccezionale nella clinica 6-9. In particolare, nel contesto di GBM, un CAR piattaforma di cellule T di targeting di crescita epidermico recettore del fattore di variante III (EGFRvIII), una mutazione specifica per tumore espresso sulla superficie delle cellule del 10, ha dimostrato di prolungare la sopravvivenza in glioma-cuscinetto topi 11. Nonostante la loro versatilità, tuttavia, il beneficio clinico di CAR terapia adottiva non è stato pienamente realizzato, in parte a causa immunosoppressione associata al tumore e l'evasione immune 12-16 e sfide nel creare e mantenere le cellule T antigene-specifiche in vivo. Sfruttando standard di cura (SOC) con immunoterapia può potenzialmente superare molti di questi limitazioni, con conseguente maggiore efficacia sia in ambito preclinico e clinico.

SOC per la post-resezione GBM consiste di temozolomide alte dosi (TMZ), un DNA agente alchilante 17, e tutta l'irradiazione cerebrale (WBI) 1. Questi trattamenti si presume di sinergizzare con i vaccini tumorali attraverso upregulation di tumore MHC espressione 18-20 e lo spargimento di antigeni da parte delle cellule tumorali morte 17,19,21,22. In effetti, l'aggiunta di TMZ 20,23 o 18,24 WBI porta a una maggiore efficacia antitumorale dei trattamenti a base immunitaria nel setting preclinico. Inoltre, come molti chemioterapici citotossici non specifici, TMZ è noto per provocare 25,26 linfopenia sistemica, che può essere sfruttato come mezzo di accoglienza condizionata per le piattaforme di terapia adottivi 27-29. Lymphodepletion TMZ mediata ha dimostrato di aumentare la frequenza e la funzione delle cellule T antigene-specifiche, con conseguente maggiore efficacia di un ADOPPiattaforma terapia tive contro i tumori intracranici 30. Nel contesto della terapia CAR, lymphodepletion serve come mezzo di host-condizionata sia la riduzione del numero di cellule T soppressori endogena 31, e indurre proliferazione omeostatica 32 attraverso concorrenza ridotta per citochine 33, migliorando così l'attività antitumorale 11,34. Dato il rapporto sinergico tra le piattaforme SOC e immunoterapia GBM, valutare nuove terapie adottivi e piattaforme vaccino nel contesto del SOC è fondamentale per trarre conclusioni significative per quanto riguarda l'efficacia.

In questo protocollo, delineiamo un metodo per la generazione e la somministrazione endovenosa di cellule murine CAR T specifiche per EGFRvIII accanto TMZ e WBI in topi portatori di tumori intracranici EGFRvIII-positivi (vedi Figura 1 per il trattamento temporale). Brevemente, le cellule T sono realizzati CAR ex vivo da trasduzione retrovirale. Rene embrionale umano (HEK) 293T cellule sono trasfettate con un complesso DNA / lipide (contenente il vettore CAR e plasmidi PCL-Eco) per produrre virus, che viene poi utilizzato per trasdurre splenociti murini attivate che vengono raccolte e coltivate in parallelo. Durante il corso della generazione CAR, ospita murine recanti tumori intracranici EGFRvIII-positivi vengono somministrati frazionata tutto il cervello a raggi X irradiazione e il trattamento sistemico TMZ a dosi paragonabili a SOC clinica. Cellule T auto sono poi consegnati per via endovenosa a host lymphodepleted.

La seguente procedura è descritta in sette fasi distinte: (1) La somministrazione di Temozolomide per tumore Mice, (2) irradiazione cerebrale totale di topi tumore-cuscinetto, (3) Transfection, (4) La splenectomia e T cellule Preparazione, (5 ) trasduzione, (6) Cultura celle CAR T e Harvest, e (7) la somministrazione di cellule T di topi CAR tumore-cuscinetto. Queste fasi sono costituite da diversi passaggi che si estendono 6-7 giorni e sono state compiute contemporaneamente.

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Protocollo

Questo protocollo si basa su un disegno sperimentale in cui 10 topi vengono trattati con 10 7 CAR cellule T ciascuno. Ciò significa che saranno necessari 10 8 cellule CAR T; il rendimento dovrebbe essere sovrastimata da 5 x 10 7 -1 x 10 8 per conto per la perdita di redditività. Il protocollo che segue viene scalato per generare circa 200 x 10 6 cellule. Le cellule sono poi somministrati per via endovenosa al femminile C57BL / 6 topi con 9 giorni stabiliti singenici tumori intracranici EGFRvIII-positivo, sviluppato dalle linee esistenti di cellule di melanoma KR158B astrocitoma o B16. In concomitanza con il CAR generazione di cellule T, i topi di tumore vengono somministrati dosi clinicamente rilevanti di lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) e WBI (16.5 Gy).

I topi sono stati mantenuti e allevati in condizioni esenti da organismi patogeni della Duke University Medical Center (DUMC). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalla Duke University Istituzioneal Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. La somministrazione di Temozolomide per Mice tumore-cuscinetto

Giorni 0 a 4:

  1. Calcolare il numero totale di topi da iniettare e moltiplicare tale da 0,5 a determinare il volume di soluzione TMZ necessario (ad esempio, 30 topi x 0.5 ml = 15 ml TMZ) e aggiungere 1,5 ml di volume per tenere conto di ricaduta (16.5 ml TMZ ).
  2. Moltiplicate questo volume totale da 3 mg / ml per determinare il peso di liofilizzato TMZ necessario (ad esempio, 16,5 x 3 = 49.5 mg TMZ). Pesare questo in una conica da 50 ml.
    ATTENZIONE: TMZ è tossico per inalazione, ingestione e contatto con gli occhi, la pelle e le membrane mucose. Consultare la sicurezza dell'istituzione del lavoro e / o di salute ambientale e il reparto wellness per le raccomandazioni in materia di riduzione del rischio di esposizione.
  3. Moltiplicare il volume totale di 0,15 per determinare il volume di dimetilsolfossido (DMSO) necessaria (ad esempio, 16,5 x0,15 = 2.475 ml DMSO). Filtro sterilizzare questo volume di DMSO (più altri 2 ml per spiegare ricaduta) attraverso un filtro da 0,2 micron in una provetta sterile. Aggiungere 2,475 ml di DMSO sterile per la polvere TMZ.
  4. Posizionare la soluzione TMZ / DMSO in un becher di acqua su una piastra calda a 65 ° C per 10-15 min. Una volta TMZ è completamente sciolto, la soluzione dovrebbe diventare colore giallo paglierino; se la soluzione diventa rosa, allora il TMZ è degradata, e una nuova soluzione dovrebbe essere preparata con un nuovo sacco di TMZ.
  5. Calcolare il volume appropriato di soluzione salina sterile necessario moltiplicando 0,85 per il volume totale (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml di soluzione salina). Aggiungere 15 ml di soluzione salina sterile per un conica da 50 ml. Mentre TMZ sta dissolvendo in DMSO, saline di calore a 65 ° C.
  6. Vortex la soluzione / DMSO TMZ per garantire che la polvere TMZ è completamente sciolto e aggiungere lentamente salina riscaldata alla soluzione / DMSO TMZ.
  7. Immediatamente dopo la preparazione, caricare completamente 15 x 1 ml tubercolina syringes con la soluzione TMZ per l'amministrazione di quattro giorni stabiliti tumorali cuscinetto topi.
  8. Ripetere questa procedura nei giorni da 1 a 4 per un totale di cinque amministrazioni TMZ.

2. Whole Brain irradiazione dei topi tumore-cuscinetto

Giorni 2 a 4:

  1. Accendere il irradiatore X-ray e lasciarlo riscaldare-fino a piena tensione. Assicurarsi che il filtro appropriato è a posto e ingresso la tensione corretta e le impostazioni correnti (Figura 2a).
    NOTA: La dosimetria del irradiatore andrà stabilita anticipatamente per stabilire i provvedimenti impostazioni di tensione e layout a griglia (figura 2A, B).
  2. Calcolare la lunghezza di tempo che è necessario per provocare 5,5 Gy X-ray irradiazione. Ad esempio, se i raggi X vengono forniti ad una velocità di 2 Gy / min, poi 2,75 min è necessario fornire un totale di 5,5 Gy. Inserire la durata di tempo adeguato.
    NOTA: La tabella 2 fornisce il mouse WBI dosa unnd loro equivalenti clinico nell'uomo. Nel contesto di gliomi ad alto grado, 60 Gy frazionata WBI (2 frazioni Gy, 5 giorni / settimana per 6 settimane) è lo standard clinico di cura, e l'equivalente murino utilizzato è 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).
  3. Preparare una soluzione fresca di ketamina / xylazina per anestesia sistemica aggiungendo 2 ml di ketamina e 1 ml a 17 ml xilazina soluzione salina in modo che la soluzione finale è di 10 mg / ml di ketamina e 1 mg / ml xylazina.
  4. Pesare topi e amministrare 10 ml di ketamina / xilazina intraperitoneale per grammo di peso corporeo tale che gli animali ricevono una dose di ketamina a 100 mg / kg e 10 mg / kg xilazina. I topi dovrebbe essere pienamente sedato e visibilmente la respirazione entro 2 minuti di somministrazione / xylazina ketamina.
  5. Per mantenere l'umidità oftalmica negli animali sedati, strofinare delicatamente una piccola quantità di lacrime artificiali unguento su ciascun occhio.
  6. Inserire topi sedati sulla griglia in modo tale che le teste sono posizionati nella zona che riceve il massimo raggi X intensity (Figura 2B, C). Corpi Shield dal collo in giù, con opportunamente dimensionate tubi di piombo per bloccare la consegna a raggi X sistemica (Figura 2D).
  7. Inserire topi posizionati sotto il fascio di raggi X in modo che il laser indica il punto focale del fascio di raggi X è al di coordinate (0,0) sul layout della griglia. Inizia consegna X-ray.
  8. Quando la consegna a raggi X, rimuovere gli animali dal irradiatore e posto su una piastra elettrica caldo. Non accogliere animali sedati con animali coscienti fino animali hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere prona sternale. Una volta che gli animali possono mantenere prona sternale, posizionare animali coscienti nel loro gabbie appropriate.
  9. Ripetere questa procedura nei giorni 3 e 4 per un totale di tre dosi frazionate di radiazioni.

3. Trasfezione

-1 ° giorno:

  1. Preparare supporti D10 aggiungendo 50 ml di siero bovino fetale (FBS) a 500 ml di Dulbecco Modified (DMEM).
  2. Preparare supporti di cellule T (TCM) con l'aggiunta di 5,5 ml di L-glutammina, 5,5 ml di piruvato di sodio, 5,5 ml aminoacidi non essenziali, e 5.5 ml Pencillin / di streptomicina (pen / strep) a 500 supporti ml RPMI-1640. Avanti, aggiungere 550 ml di 2-mercaptoetanolo e 550 ml gentamicina. Infine, aggiungere 50 ml di FBS.
  3. Harvest vitro cellule in coltura HEK293T e portare a una concentrazione di 7,5 x 10 6 cellule / ml nei media D10.
  4. La tavola 10 ml supporti D10 e aggiungere 1 ml di sospensione cellulare HEK293T in ciascuno di 16 x 10 centimetri poli-D-lisina (PDL) piastre rivestite.
  5. Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO 2.

Giorno 0:

  1. Sostituire i media con 10 ml D10 fresco almeno 30 minuti prima di trasfezione le cellule.
  2. Determinare la quantità di vettore plasmidico, PCL-Eco vettoriale, e liposomiale trasfezione reagente necessario per trasfezione moltiplicando il numero totale di piatti + 1 (16 + 1 = 17) 14.1 mgplasmide vettore (14.1 x 17 = 239,7 mg), 9.9 mg PCL-Eco vettore (9,9 x 17 = 168,3 mg), e 60 ml di reagente liposomiale trasfezione (60 x 17 = 1.020 ml). Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente prima di preparare soluzioni.
  3. Etichettare due provette A e B. In tubo A, aggiungere 239,7 mcg vettore plasmidico e 168,3 mg PCL-Eco vettore a (1,5 x 17) ML-siero ridotto modificato mezzo di Eagle (RS-MEM). Nel tubo B, aggiungere 1020 ml liposomiale trasfezione reagente (1,5 x 17) ml RS-MEM.
  4. Incubare A e B separatamente per 5 min a temperatura ambiente.
  5. Mescolare A e B insieme delicatamente (vortex per 1-2 sec capovolgere varie volte) e incubare per 20 min a temperatura ambiente per formare lipidi complessi / DNA.
  6. Aggiungere lipidi / DNA complesso goccia a goccia per le cellule HEK293T a 10 centimetri piatto.
  7. Incubare a 37 ° C per 6-8 ore o durante la notte (non superare 24 ore).
  8. Dopo 6-8 ore di incubazione, sostituire medie con 12 ml di TCM fresco per la produzione virale. Questo placcato supportisaranno utilizzati al Day 2 come surnatante virale per la trasduzione di cellule T.

4. La splenectomia e preparazione delle cellule T

Giorno 0:

  1. Versare 10 ml di TCM in una conica da 50 ml e posto in ghiaccio per la raccolta della milza.
  2. Sacrifica il numero appropriato di animali da CO 2 asfissia e decapitazione secondario: Posizionare gli animali in gabbia ricevere CO 2 ad una portata di 10-30% gabbia volume / minuto, secondo le linee guida American Veterinary Medical Association (non più di 5 animali possono essere sacrificato contemporaneamente) fino termina respirazione e per due minuti successivi. Rimuovere gli animali dalla camera di CO 2 e di decapitarlo.
    NOTA: Uno spleen di un 6-12 settimane vecchia femmina C57BL / 6 del mouse produrrà circa 4,5-5 x 10 7 splenociti. Qui, 4 milze saranno raccolte per circa 200 x 10 6 cellule.
  3. Posare il mouse in modo che il suo lato destro rivolto verso l'alto, espruzzare con il 70% di etanolo. Con le pinze, afferrare un sottile lembo di pelle sotto la gabbia toracica sinistra e tagliare una leggera incisione con le forbici. Rimuovere la pelle, afferrare con cura un sottile piega del peritoneo con una pinza, e tagliare una piccola cavità.
  4. La milza è un piccolo, allungato, organo rosso scuro che ricorda un fagiolo appiattita; delicatamente afferrare la milza con le pinze e le accise tagliando via il tessuto connettivo circostante. Posizionare le milze asportati nel conica contenente 10 ml di TCM su ghiaccio.
  5. Versare milze oltre un filtro 70 micron cella maglie e disaggregare da schiacciare con l'estremità smussata della parte interna di una siringa da 5 ml per generare una cella singola sospensione. Un massimo di due milze dovrebbe essere disaggregate per filtro a rete.
  6. Utilizzare un piccolo volume di TCM di lavare accuratamente il filtro seguente disaggregazione per raccogliere eventuali splenociti rimanenti. Piscina tutto milze disaggregati in una cella singola sospensione. Portare il volume finale di 50 ml con TCM per un lavaggio did girare a 300 xg per 10 min.
  7. Preparare una soluzione di tampone di lisi 1x aggiungendo 5 ml 10x tampone di lisi a 45 ml di acqua sterile. Per eliminare i globuli rossi, risospendere pellet in 5 ml di 1x tampone di lisi per milza in una conica da 50 ml, mescolando bene pipettando gentilmente su e giù. Se superiore a 5 milze, utilizzare un tubo da centrifuga da 250 ml. Inserire conica o tubo da centrifuga in un bagno d'acqua 37 ° per 5 minuti.
  8. Rimuovere la reazione lisi dal bagno di acqua e aggiungere TCM in un rapporto 1: 1 con tampone di lisi per neutralizzare la reazione. Lavare facendo girare a 300 xg per 10 min.
  9. Aspirare il surnatante e pellet completamente risospendere in MTC (2 ml / milza, 8 ml totale per 4 milza) pipettando su e giù.
  10. Contare le cellule con l'aggiunta di 10 ml di sospensione cellulare a 190 ml blu trypan (1:20 diluizione). Moltiplicare il numero ottenuto in uno dei quattro quadrati reticolati da 20 x 10 x 4 volume totale (8 ml) per ottenere il numero totale di cellule (ad esempio, 125 cellule x 20 x 10 4 x 8 ml = 200 x 10 6 splenociti).
  11. Diluire le cellule ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml in TCM, supplementato con 2 ug / ml concanavalina A (ConA) e 50 UI / ml ricombinante umano interleuchina-2 (rhIL-2). Così, per 200 x 10 6 splenociti, aggiungere 92 ml di media per 8 ml cellule, 200 mcg Cona e 5.000 UI rhIL-2.
  12. Aggiungere 2 mL cellule in ciascun pozzetto 24 pozzetti tessuto-cultura piastre trattati, tale che 4 x 10 6 cellule sono in ogni pozzetto (es, 100 ml di cellule richiederanno circa 4 piastre).
  13. Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO 2.

5. Trasduzione

1 ° giorno:

  1. Calcolare il numero della cultura non-tessuto trattato piastre da 24 pozzetti necessari per la trasduzione moltiplicando il numero di milza raccolte da 2 (8 piastre sono necessari per 4 milza).
  2. Successivamente, calcolare il volume richiesto di soluzione ricombinante frammento fibronectina umana (RHFF)necessario per lastre cappotto moltiplicando (numero totale di pozzi + 3) x 0,5 ml (8 piastre x 24 pozzi = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
  3. Preparare 97,5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente RHFF ad una concentrazione di 25 ug / ml moltiplicando il volume totale da 25 mg (97,5 x 25 = 2437,5 mg). Aggiungi questa quantità di RHFF a 97,5 ml di PBS.
  4. Coat coltura non-tessuto trattato piastre da 24 pozzetti aggiungendo 0,5 ml di soluzione PBS / RHFF per pozzetto.
  5. Incubare una notte a 4 ° C.

2 ° giorno:

  1. Dump soluzione PBS / RHFF dalla cultura non-tessuto trattato piastre da 24 pozzetti.
  2. Aggiungere 1 ml / pozzetto di albumina sierica bovina 2% (BSA) in PBS e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  3. Rimuovere BSA saldamente ribaltare piatto. Lavare con l'aggiunta di 2 ml di PBS.
  4. Raccogliere surnatante virale trasferendo file multimediali da ogni HEK293T PDL piastra in una provetta da 250 ml centrifuga e spin 10 min a 500 x g.
  5. Trasferire accuratamente su viralepernatant in un fresco 250 ml tubo da centrifuga, assicurandosi di non disturbare il pellet che possono essersi formate.
  6. Aggiungere TCM fresco al surnatante virale tale che il volume finale è 3 ml più che la quantità necessaria per pozzi RHFF rivestite. Ad esempio, per 192 pozzetti RHFF rivestite, portare il volume del surnatante virale a 192 + 3 ml = 195 ml.
  7. Rimuovere splenociti coltivate dal incubatore e risospendere pipettando gentilmente su e giù 2 - 3 volte in ogni pozzetto. Trasferire in un conica 250 ml. Se si utilizza una pipetta multicanale, con un serbatoio sterile prima del trasferimento contribuirà ad accelerare questo passaggio. Conta come descritto in precedenza e far girare a 300 xg per 10 min.
  8. Aggiungere rhIL-2 per surnatante virale ad una concentrazione di 50 UI / ml. Ad esempio, aggiungere 50 x 195 = 9.750 UI a 195 ml di surnatante virale-2 rhIL.
  9. Risospendere splenociti di surnatante virale a 1 x 10 6 cellule / ml
  10. Aggiungere 1 ml / pozzetto di sospensione splenocyte a piastre da 24 pozzetti RHFF rivestite.
  11. Spin per 90 min in base alle seguenti impostazioni: 770 xg, accelerazione = 4, freno / decelerazione = 0, 32 ° C.
  12. Preparare una soluzione TCM con 50 UI / ml rhIL-2. Ad esempio, preparare una soluzione 200 TCM aggiungendo 10.000 UI rhIL-2. Aggiungere 1 ml di rhIL-2 / TCM a ciascun pozzetto dopo centrifugazione.
  13. Culture notte a 37 ° C in 5% CO 2.

6. CAR T cellule Cultura e Harvest

Giorni 3 e 4:

  1. Se le cellule T raggiungono> 80% di confluenza, le cellule possono essere divise (questo di solito avviene il giorno 3 o 4 giorni). Per dividere le celle, delicatamente pipettare su e giù in ciascun pozzetto 2-3 volte, e passare 1 ml da ogni pozzetto in nuovi pozzetti di una 24-pozzetti trattati tessuto-coltura fresco. Quindi, aggiungere 1 ml di TCM fresca con 50 UI / ml di IL-2 in ciascun pozzetto tale che il volume finale di 2 ml in tutti i pozzetti.
  2. Se le cellule non raggiungono> 80% di confluenza, effettuare un cambiamento mezza mezzi lentamente pipettando off 1 ml del supporto dalla parte superiore di ciascun pozzetto. Evitare disturbing cellule insediate sul fondo durante la rimozione dei media. Aggiungere 1 ml di TCM fresco contenente 50 UI / ml rhIL-2.

5 ° giorno:

  1. Risospendere le cellule T CAR pipettando gentilmente su e giù per 3 volte in ogni pozzetto e il trasferimento ad un tubo da centrifuga da 250 ml. Spin cellule a 300 xg per 10 min.
  2. Surnatante completamente aspirate senza disturbare pellet. Risciacquare una volta con PBS, contare le cellule come precedentemente descritto, e lavare con PBS una seconda volta. Una resa di cellule CAR T tipico è di circa 1 x 10 6 cellule per bene (8 piastre cellule x 24 pozzi = 192 x 10 6 CAR T).
  3. Risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione di 5 x 10 7 / ml per una iniezione di 1 x 10 7 in un volume di 200 mg (per esempio, per 192 x 10 6 cellule T CAR, risospendere pellet lavate in PBS 3,84 ml).

7. CAR T cellule Administration per Mice tumore fruttiferi

5 ° giorno:

  1. Transpocellule rt sul ghiaccio per stabulario per iniezione endovenosa. Load 500-1000 ml in siringa da insulina con 27-31 G ago, assicurando che tutte le bolle vengono espulsi.
  2. Prendete un mouse alla base della coda e mettere in fermo tubi.
  3. Estrarre la coda tesa con la vena rivolto verso l'alto, e scivolare l'ago di circa 1-2 mm sotto la pelle nella vena inserendolo parallelo alla vena della coda. Lentamente espellere 200 microlitri nella vena. Se l'ago è correttamente inserito nella vena, il volume sarà facile flusso in; altrimenti ci sarà la resistenza e l'ago dovranno essere rimossi dalla coda e ri-inserito correttamente.

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Risultati

Cellule T CAR sono generati dalla trasduzione con il EGFRvIII CAR vettore retrovirale 11. Questo vettore, MSGV1, è stato sviluppato dal vettore SFGtcLuc_ITE4 35, che contiene il virus cellule staminali murine (MSCV) lunghe ripetizioni terminali, la estesa regione gag e sito di splicing busta (splice donatore, sd, e splice accettore, sa), e virale Segnale di imballaggio (ψ). Il CAR EGFRvIII contenente l'anti-EGFRvIII catena singola frammento umano variabile (scFv) 139, in tandem con CD8TM murino...

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Discussione

La timeline trattamento qui descritto è stato progettato per modello standard clinico di cura e di sfruttare i suoi effetti per l'automobile la terapia adottiva. AUTO dosi T cellulari, regimi di TMZ, e l'amministrazione radioterapia possono essere modificati per aumentare in vivo l'attività delle cellule T, lymphodepletion, e tumore uccisione. Regimi TMZ può essere aumentata per produrre mieloablazione host e una maggiore espansione delle cellule adoptively trasferiti 30. Inoltre, gli eff...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Laura Johnson e il dottor Richard Morgan per aver fornito il costrutto retrovirale CAR. Gli autori ringraziano anche Giao Ngyuen per la sua assistenza con la dosimetria per l'irradiazione dell'intero cervello. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione NIH NCI 1R01CA177476-01.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
pCL-Eco Retrovirus Packaging VectorImgenex10045PVettore helper per la generazione di retrovirus CAR
Concanavalin ASigma AldrichC2010Mitogeno non specifico per indurre la proliferazione delle cellule T e la trasduzione virale
RetronectinClonTech/TakaraT100BFacilita la trasduzione retrovirale delle cellule T
Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019Reagente di trasfezione
DMEM, glucosio alto, piruvatoLife technologies11995-065Terreni di coltura HEK293
RPMI 1640Life Technologies11875-093Terreni di coltura per cellule T
Opti-MEM I Siero ridottoMedium Life technologies11058-021Terreni di trasfezione
200 mM L-GlutamminaLife technologies25030-081Integratore di terreni di coltura di cellule T
100 mM Sodium PyruvateLife technologies11360-070Integratore di terreni di coltura di cellule T
100X MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali Life technologies11140-050Integratore di terreni di coltura di cellule T
55 mM 2-MercaptoethanolLife technologies21985-023Agente riducente per rimuovere i radicali liberi
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)Life technologies15140-122Integratore di terreni per colture di cellule T
Gentamicina (50 mg/ml)Life technologies15750-060Integratore di terreni per colture di cellule T
GemCell U.S. Origin Siero fetale bovinoGemini Bio Products100-500Fornisce fattori di crescita e nutrienti per la crescita cellulare in vitro
Albumina sierica bovina (BSA), Frazione V– Gemini Bio Products700-100PBlocca il legame non specifico del retrovirus alle piastre rivestite di retronectina
Lyse farmaceutica (10x concentrato)BD Biosciences555899Lisi i globuli rossi durante l'elaborazione degli splenociti
70 μ m Filtri cellulari steriliCorning352350Filtra le particelle di tessuto di grandi dimensioni durante l'elaborazione degli splenociti
Piastre di coltura BioCoat da 100 mm con poli-D-lisinaCorning 356469Promuove l'adesione delle cellule HEK293 per massimizzare la proliferazione dopo la trasfezione
[header]
TemozolomideBest PharmatechN/APolvere liofilizzata preparata il giorno della somministrazione
Dimetil solfossidoSigma Life SciencesD2650Necessario per la completa dissoluzione della temozolomide
Soluzione salinaHospiraIM 0132 (5/04)Solvente per temozolomide e ketamina/xilazina
Ketathesia HClHenry Schein Animal Health11695-0701-1Soluzione di ketamina
AnaSedLloyd IncN/ASoluzione sterile di xilazina 100 mg/ml
di grado standard

Riferimenti

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).

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