Articolo metodologico

Un colorimetrico metodo che misura particolare Granzyme B proteolitici attività: idrolisi di Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

DOI:

10.3791/52419

⸱

28 novembre 2014

 ,  , 
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un semplice test colorimetrico quantitativo che misura specificamente l'attività proteolitica del Granzima B (GzmB) umano, di topo o di ratto. Questo protocollo può essere facilmente adattato per determinare l'attività proteasica di altre serina proteasi in granuli mediante l'idrolisi di altri substrati peptidici sintetici con un'appropriata sequenza di riconoscimento.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La serina proteasi Granzyme B (GzmB) media l'apoptosi delle cellule bersaglio quando viene rilasciata dai linfociti T citotossici (CTL) o dalle cellule natural killer (NK). Il GzmB è il granzima più studiato nell'uomo e nei topi e quindi i ricercatori hanno bisogno di strumenti specifici e affidabili per studiarne la funzione e il ruolo nella fisiopatologia. Ciò richiede in particolare saggi che non riconoscano proteasi come caspasi o altri granzimi strutturalmente o funzionalmente correlati. Qui, applichiamo la preferenza di GzmB per la scissione dopo residui di acido aspartico in un saggio colorimetrico utilizzando il peptide tioestere Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Il GzmB è l'unica serina proteasi di mammifero in grado di scindere questo substrato. Il substrato viene tagliato con efficienza simile dal GzmB umano, di topo e di ratto, una proprietà non condivisa da altri substrati peptidici disponibili in commercio, anche da alcuni che sono pubblicizzati come adatti a questo scopo. Questo protocollo è dimostrato utilizzando lisati non frazionati da cellule NK attivate o CTL ed è adatto anche per proteasi ricombinanti generate in una varietà di sistemi procariotici ed eucariotici, a condizione che vengano utilizzati i controlli corretti. Questo test è un metodo altamente specifico per accertare la potenziale attività pro-apoptotica di molecole citotossiche nei linfociti di mammifero e delle loro controparti ricombinanti espresse da una varietà di metodologie.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Granzimi sono una famiglia di serina proteasi presenti nei lisosomi secretori di natural killer (NK) e dei linfociti T citotossici (CTL) 1. Esistono cinque differenti granzimi nell'uomo (A, B, H, K e M), e dieci nei topi (A - G, K, M e N) 2,3. Granzyme A e B Granzyme (GzmA, GzmB) sono i più abbondanti e sono stati ampiamente studiati nel contesto umano e roditori.

La funzione classica GzmB è l'induzione di apoptosi nelle cellule bersaglio eseguite in combinazione con la proteina perforina formano pori, che permette di accedere granzyme citosol cellula bersaglio 4. Anche se l'espressione GzmB è inequivocabilmente trova in linfociti citotossici, studi recenti stanno affrontando una serie di altri tipi di cellule-GzmB esprimono, compreso ma non limitato ai cheratinociti 5, 6 basofili, mastociti 7, cellule dendritiche plasmacitoidi 8, e le cellule B 9, 10.In questo contesto, le funzioni GzmB non-apoptotici sono stati rivelati vanno dalla partecipazione a processi infiammatori, rimodellamento dei tessuti e altre proprietà immunomodulanti 11-14.

Dato che un ruolo biologico più ampio è stato proposto per GzmB quanto precedentemente sospettato, ricercatori richiedono strumenti affidabili e specifici per la sua individuazione. Di vantaggio è requisito specifico di GzmB per fendere sul lato carbossilico di residui di acido aspartico, una struttura unica tra serina proteasi eucariotiche 15. Mouse, umano e di ratto GzmB sono strutturalmente molto simile, tuttavia la specificità di substrato di topo GzmB estesa differisce leggermente da quella di umano e di ratto 16, il che significa che certi substrati generici con Asp al terminale (P1) possono essere scissi efficientemente GzmB da tutte e tre le specie, mentre altri substrati con sequenze più complesse monte di P1 può dare risultati molto variabili. Sia nel passato e li più recenteterature, questo fatto ha provocato una notevole confusione e cattiva interpretazione del significato biologico di alcuni risultati sperimentali, anche se attentamente controllato, studi cinetici hanno cercato di correggere la situazione 17.

In questo articolo abbiamo cercato di illustrare questi punti con due substrati disponibili in commercio, vale a dire Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl e N-acetil-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilide. I due reagenti fare generare diversi gruppi reattivi a seguito di scissione (un sulfidrilico gratuito contro un paranitroanilide gratuito fluorescente), ma questo non ha alcun effetto su qualunque taglio proteolitico. Il protocollo descritto è un adattamento moderno di un protocollo molto vecchio 18, ma dovrebbe aiutare gli investigatori di utilizzare i diversi substrati GzmB adeguatamente, fornendo inoltre un quadro metodologico per rilevare l'attività di altri granzimi, come GzmA e GzmH.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: milze erano derivate da topi (6-10 settimane di età) e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida etiche degli animali del Centro Cancer MacCallum Peter (E486).

1. Preparazione dei campioni.

  1. Preparazione delle cellule del mouse NK attivate.
    1. Isolare cellule NK naive primarie da cella singola sospensioni dei milza di C57BL / 6 o B6.GrzmB - / - (GzmB gene null) topo di selezione negativa utilizzando kit disponibili in commercio.
    2. Seguire il protocollo dei costruttori. In breve, magneticamente etichettare "non-NK" cellule come le cellule T e B, cellule dendritiche, granulociti, macrofagi e globuli rossi utilizzando anticorpi biotina-coniugato contro i loro marcatori di superficie specifici. Utilizzare separazione magnetica con perle anti-biotina deplezione delle cellule "non-NK".
    3. Culture isolato cellule NK per 5-7 giorni in terreni contenenti IL-2 (1.000 U / ml) a 700.000 cellule / ml in piastre da 24 pozzettia 37   ° C.
    4. In alternativa, l'uso attivato cellule T 19, primaria antigene-ristretto da CTL OT1 T cell receptor topi transgenici 20, CTL generati in colture miste linfocitarie 21 o supernatanti di cellule NK attivate per determinare l'attività di secreto GzmB 19.
  2. Mantenimento della linea di cellule NK umane e l'isolamento di cellule NK primarie.
    1. Mantenere leucemia umana NK (cellule YT) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium supplementato con siero di vitello fetale del 10%. In alternativa, purificare cellule NK primari da sangue periferico di soggetti sani e stimolare per 2-3 giorni in terreno contenente IL-2 a 100 U / ml 22 come precedentemente descritto.
  3. Generazione di lisati cellulari.
    1. Lavare le cellule tre volte in PBS (pH 7,4), poi sospendere Nonidet P-40 tampone di lisi (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Idealmente, lisare un minimo di 5 x 10 6 cellule NK, o 1 x 10 7 cellule T in 100 microlitri di buffer. Non aggiungere gli inibitori della proteasi, come molti sono inibitori irreversibili della serina-proteasi, in particolare tryptases quali GzmA. Incubare in ghiaccio per 20 minuti, e poi pellet nuclei in una microcentrifuga a 15.000 xg per 10 min. Eliminare il pellet nucleare e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
  4. Determinare la concentrazione di proteine ​​dei lisati.
    1. Utilizzare un protocollo disponibile in commercio di scelta come, Bradford o acido bicinconinico (BCA) e determinare la concentrazione di proteine. Assicurarsi che la concentrazione è ~ 2 mg minimo / ml. Conservare lisati a -20 ° C fino al momento (attività granzyme è stabile per molti mesi a -20 ° C).

2. Granzyme B Activity Assay

  1. Preparazione dei reagenti
    1. Preparare uno stock 10 mM dei substrati (Boc-AAD-S-Bzl o Ac-IEPD-Anp) in DMSO (~ 5 mg / ml) e conservare in aliquote a -20 & #176; C. Preparare una diluizione di lavoro fresco e gettare dopo ogni giorno, come Boc-AAD-S-Bzl idrolizza parzialmente in deposito in DMSO.
    2. Preparare uno stock di 250 mm del reagente colorimetrico (5,5'-ditio-bis (acido 2-nitrobenzoico), DTNB) in DMSO (0,09 g / ml) e conservare a -20 ° C. Preparare una diluizione di lavoro fresco ogni giorno. Questo reagente è richiesto solo per substrati con gruppi di indicatori SBzl, non dell'Anp.
    3. Make up tampone fresco (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl 2, pH 7,3) ogni 2-3 settimane.
  2. Portare DTNB e substrati sintetici a temperatura ambiente. Diluire substrati (01:16, ad esempio 100 microlitri di 1.6 ml di tampone) e DTNB (1: 250, ad esempio, 10 ml a 2,5 ml di tampone) e mescolare bene.
  3. Diluire un minimo di 100 mcg di proteine ​​lisato di ciascun campione in tampone ad un volume finale di 160 microlitri. Usando una pipetta multicanale aggiungere 50 ml per pozzetto in triplice copia (~ 33,3 mcg / pozzetto) in un '' U '' vinile bottom piastra da 96 pozzetti.Includere un "buffer-only" di controllo (anche in triplice copia).
  4. Aggiungere 100 ml di DTNB diluito al controllo dei campioni / tampone (saltare questo passaggio quando si lavora con Ac-IEPD-pNA.
    NOTA: La scissione di Ac-IEPD-pNA dal GzmB rilascia direttamente fluorogenico pNA (Figura 4B).
  5. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere rapidamente 50 ml di substrati diluito per ogni set di triplicato, a cominciare con il tampone poi tutti i controlli negativi e la finitura con campioni positivi attesi.
  6. Posizionare la piastra nel lettore di piastre. Misurare l'attività Asp-ase per idrolisi di Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA in un lettore di micropiastre a OD 405 nm. Utilizzare un protocollo di test cinetico, prendere 25 misure, ogni 15 sec (ca. 6 min di tempo di lettura totale).
  7. Utilizzare le letture di assorbanza generati in ogni punto di tempo per calcolare manualmente il tasso di substrato scissione se il software della piastra-reader non può generare un valore per Vmax.

3. Analisi di Data

NOTA: I dati generati si presenta come la velocità massima, definita come il cambiamento di OD nel tempo (Mod / min).

  1. Per analizzare i dati, determinare il tasso massimo di substrato scissione, che viene calcolato dal tasso di variazione di assorbanza. Fate questo automaticamente utilizzando il software lettore di piastre, che in genere ha questa opzione.
  2. In alternativa, dopo aver visto le trame cinetiche di variazione di assorbanza, che vengono generati durante il dosaggio cinetico sul lettore piatto, selezionare manualmente i punti di dati che danno la più ripida linea retta. Per la maggior parte i test la velocità massima viene raggiunta entro i primi 2 minuti del test.
  3. Sottrarre la lettura OD iniziale dalla lettura OD alto su questa linea retta e dividere per l'intervallo di tempo. Trasferire i dati grezzi per pad Microsoft Excel / Graph per l'analisi statistica e la visualizzazione grafica.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il substrato Boc-AAD-S-Bzl è specifico per GzmB

Il GzmB serina proteasi è un importante costituente di linfociti citotossici (cellule CTL e NK) ed è prevalentemente responsabile per indurre una rapida morte per apoptosi nelle cellule bersaglio, come le cellule infettate da virus o trasformate. Ciò è in gran parte dovuto alla sua preferenza substrato per la scissione, dopo taluni residui aspartato specifici in proteine ​​selezionate, un attributo condiviso con le caspasi, che...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Storicamente i granzimi sono stati identificati come molecole effettrici chiave di linfociti citotossici (cellule CTL e NK) in grado di indurre una rapida morte apoptotica nelle cellule bersaglio. Questo è principalmente dovuto all'azione di GzmB che scisso molecole substrato bersaglio a (D) residui di aspartato e quindi era in grado di attivare la cascata caspasi da entrambi da tagliare pro-caspasi, così come molti dei loro bersagli a valle. Tuttavia, è ora apprezzato che l'espressione GzmB non è limitato alle ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro ha ricevuto sostegno attraverso la sovvenzione HA 6136/1-1 dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) a MH. JAT è supportato da sovvenzioni per programmi e progetti del National Health and Medical Research Council of Australia.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Boc-Ala-Ala-Asp-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASMSB05Substrato del granzima B (topo e uomo)
Ac-IEPD-pNA SM Biochemicals LLC, CASMPNA009substrato di Granzyme B (solo umano)
N-α-CBZ-L-lisina-S-BzlSigma-AldrichC3647Substrato di Granzyme A
Suc-Phe-Leu-Phe-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASB025Substrato di Granzyme H
5,5'-ditio-bis(acido 2-nitrobenzoico) Sigma-AldrichD8130DTNB, Ellman' s Kit
di isolamento cellulare NKtopo Miltenyi Biotec GmbH130-096-892kit di selezione negativa
Kit di isolamento cellulare NK umanoMiltenyi Biotec GmbH130-092-657kit di selezione negativa
Lettore di piastreBiorad iMarkBiorad Microplate Manager Versione software MPM6.3
Serocluster U-bottom vinile piastra a 96 pozzettiCorning, MA, USA2797
reagente II

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Attivit della granzima Blisato di cellule NKmisurazione dell attivit proteoliticaspecificit del substratoreazione con DTNBlettore di micropiastreknockout della granzima Blinfociti citotossici

Articoli correlati