Summary
Beskrivet här är ett snabbt och effektivt förfarande för funktionell rekonstitution av renat vildtyp och muterade CFTR-protein som bevarar aktiviteten för denna kloridkanal, vilken är defekt i cystisk fibros. Jodid utflöde från ombildade proteoliposomer förmedlade av CFTR tillåter studier av kanalaktivitet och effekterna av små molekyler.
Abstract
Den cystisk fibros transmembran (CFTR) är en unik kanal bildande medlem av ATP Binding Cassette (ABC) superfamiljen av transportörer. Den fosforylering och nukleotid beroende kloridkanal aktivitet CFTR har ofta studerats i hela cellsystem och som enstaka kanaler i utskurna membran patchar. Många Cystisk fibros framkallande mutationer har visat att ändra denna verksamhet. Medan ett litet antal reningsprotokoll har publicerats, har en snabb beredning metod som bibehåller kanalaktivitet och en lämplig metod för att studera befolkningskanalaktivitet i ett renat systemet saknats. Här snabba metoder beskrivs för rening och funktionell beredning av fullängds CFTR protein i proteoliposomer av definierad lipidsammansättning som behåller aktivitet som en reglerad halid kanal. Denna beredning metoden tillsammans med en ny flödesbaserad analys av kanalaktivitet är ett lämpligt system förstudera befolkningskanalegenskaper vildtyp CFTR och sjukdomsalstrande mutanter F508del- och G551D-CFTR. Specifikt har metoden verktyget studera de direkta effekterna av fosforylering, nukleotider och små molekyler såsom potentiatorer och inhibitorer på CFTR kanalaktivitet. Metoderna är också mottagliga för studiet av andra membran kanaler / transportörer för anjoniska substrat.
Introduction
Chloride transport över de apikala membran av epitelceller i sådana vävnader som lung, tarm, bukspottkörtel och svettkörtlar är främst förmedlas av cystisk fibros transmembran (CFTR), en ATP och fosforylering reglerade medlem av ABC (ATP Bindande Kassett) C underfamiljen av membranproteiner (över i 1). Liksom andra medlemmar av ABCC underfamiljen är CFTR en stor, multi-spänner integrerad membranprotein som binder ATP vid två nukleotid bindningsställen bildas i gränssnittet mellan dess nukleotid-bindande domäner (NBDs), där den har blyg ATPas aktivitet vid en enda plats. Men till skillnad från andra ABCC underfamilj medlemmar, har CFTR utvecklats som en unik reglerad Cl-kanalen snarare än som en aktiv löst ämne transportör.
Mutationer i CFTR orsak Cystisk fibros, en sjukdom som drabbar flera organ inklusive lungor, mag-tarmkanalen, pankreas och reproduktionsorganen, vilket leder till Morbidity och dödlighet hos unga vuxna. Lungsjukdom står normalt för tidig dödlighet i cystisk fibros och i de flesta fall orsakas av förlusten av CFTR funktion på ytan epitel av övriga luftvägarna. Avsaknaden av CFTR kloridkanalaktivitet orsakar en minskning av både Cl - och vatten rörelse över ytan epitelet för att modifiera fluidskiktet på den apikala ytan av cilierade respiratoriska epitelet. Detta resulterar i en viskös luftväg ytvätska som försämrar förmågan hos cilierespirator epitelceller för att effektivt klara patogener ur luftvägarna. Som en följd har de flesta CF-patienter lider av återkommande anfall av lunginfektion och lungskador på grund av inflammation.
Som väntat, studier av verkningsmekanismen för den normala CFTR proteinet främst inriktat på detaljerade elektrofysiologiska studier av dess kanal gating aktivitet. Enkanaliga studier har visat direkt att CFTR fungerar som en PKA-beroende Cl- Kanal som besitter en ATP reglerad grind 2. Detaljerade elektrofysiologiska studier ger en hel del information om enskilda CFTR kanaler 1,3, men det kan finnas oro över huruvida de egenskaper hos någon särskild kanal som har studerats är reflekterande av hela befolkningen i CFTR kanaler och därför enda kanal Resultaten bör alltid övervägas tillsammans med metoder för att studera den makroskopiska befolkningen. Direkt analys av kanalverksamhet renat CFTR befolkningen har potential att ge en inblick i den molekylära defekten i samband med sjukdomsframkallande mutationer och driva upptäckten av kemiska modulatorer som reparation mutant CFTR proteiner. Hittills finns det överstigande 1.900 olika mutationer i CFTR tros orsaka cystisk fibros 4. Den stora mutationen, F508del-CFTR, finns på minst en allel hos ca 90% av patienterna i Nordamerika och Europa leder till protein misfolding ennd retention i endoplasmanätet 5. F508del-CFTR har även andra följder, bland annat defekt kanalaktivitet 6-9. Den resulterande frånvaron av CFTR från cellytan är associerad med allvarlig sjukdom. G551D-CFTR, en mindre vanlig mutation, tros vara ordentligt vikta ännu är dysfunktionell som kloridkanal på cellytan 6. Utvecklingen av småmolekylära correctors och potentiatorer har som mål att korrigera vikning och / eller handel med mutanter såsom F508del-CFTR till cellytan, och förstärkande eller öka kanalaktiviteten av mutationer som G551D då närvarande på cellytan, respektive . Medan correctors VX-809 och VX-661 (ännu ej är godkända för användning på patienter, potentiatom Kalydeco (ivacaftor; VX-770) används på 150 mg var 12 timme i CF-patienter> 6 år med minst en G551D -CFTR mutation, och på senare tid för patienter med en av G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Poch G1349D. Kalydeco är både säker och resulterar i en förbättring av kliniska mått på CF sjukdom 10, men verkningsmekanismen för denna lilla molekyl var dåligt förstådd vid tidpunkten för godkännande av FDA för användning på patienter.
En handfull CFTR reningsmetoder har beskrivits tidigare 2,11-18, av vilka många kräver en avsevärd tid att slutföra. I en nyligen publicerad 19, var en unik snabb rening och rekonstitution metod som beskrivits för CFTR uttrycks i Sf 9 cellexpressionssystem, och detta renade proteinet i definierade lipidsystem användes för att utveckla en CFTR halogenid kanalaktivitetsanalys för en population av CFTR molekyler. Analysen rekapitulerar de kända effekterna av fosforylering, nukleotider och hämmare på CFTR funktion. Systemet användes för att förhöra effekterna av potentiator VX-770 / Kalydeco på vikt- (vildtyp), F508del- och G551D-CFTR och det visades för förstatid som läkemedlet interagerar direkt med CFTR-proteinet att förstärka sin kanalaktivitet i en ATP-oberoende sätt, vilket visar nyttan och användbarheten av dessa metoder för att studera interaktionen mellan CFTR och mutanter med nukleotider och små molekyler från ett befolkningsperspektiv till svara kliniskt relevanta frågor om proteinet. Metoderna har också använts för att studera andra potentiator molekyler och deras derivat 20, samt effekterna av en liten molekyl corrector på aktiviteten hos proteinet 21.
Utflödes analyser har använts i många studier som tidigare för att undersöka aktiviteten av CFTR mutanter och effekterna av CFTR-moduler föreningar på sin verksamhet, inklusive hela cellanalyser med användning elektroder, radioaktiva spårämnen och fluoroforer 22,23, membranvesikler med jonselektiva elektroder 24 och renas rekonstruerad CFTR med radioaktiva spårämnen 25. Emellertid the användningen av jonselektiva elektroder för att studera renas rekonstituerad CFTR rapporterades först nyligen 19. En anpassning av den nuvarande metoden har använts för beredning och funktionell karakterisering av två membranproteiner i Pseudomonas aeruginosa, en gemensam CF patogen. Beredning av renat Alge yttermembranproteinkopplade med jodid mätningar utflödes användes för att stödja en modell för anjoniska alginat sekre genom denna transportör 26. Upplösning och jodid mätningar utflödes applicerades på det renade Wzx protein, vilket tillät en modell som kommer att föreslås som antyder en H + -beroende antiport mekanism för lipid bunden oligosackarid sloka över bakteriella inre membranet av detta protein 27. I båda fallen var jodid användes som ett surrogat för det anjoniska substratet, om än i lägre genomströmning än man kan förvänta sig för en infödd substrat. Förfarandet kan vara lämpligt för anpassning till andra proteiner med cationic transport- eller ledningsvägar för anjoniska substrat.
Här ett snabbt förfarande renings beskrivs för CFTR-proteinet och dess beredning i proteoliposomer av definierade lipid. Den snabba Förfarandet beredning kan lätt anpassas för användning med CFTR renas genom andra metoder, förutsatt att den typ av rengöringsmedel som används vid reningen är mottaglig för borttagning av de metoder som används här eller kan bytas ut mot ett lämpligt rengöringsmedel före beredning. Den jodid utflödesmetod för mätning av kanalaktiviteten av renad och rekonstitueras CFTR-protein beskrivs i detalj och några typiska resultat som kan erhållas från detta förfarande presenteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rening av CFTR
OBS: Vänligen se tabell av material och utrustning för en lista över utrustning och material som används i detta protokoll. En detaljerat protokoll finns för överuttryck av humant Wt-CFTR och mutanter i S f 9-baculovirusexpressionssystem 17,28. Överuttrycker CFTR och förbereda pellets av S f 9 celler enligt detta protokoll.
- Råmembranpreparat
- Skaffa en färsk eller tina en frusen Sf 9 cellpelleten från en 500 ml kultur av celler överuttryck wildtype-, F508del- eller G551D-CFTR-protein med en C-terminal His 10 -taggen, odlas genom standardcellodlingsmetoder, såsom beskrivits tidigare 17,28. Cellpellettar kommer att ha en volym av ca 5 ml och en våtvikt av ungefär 5 g.
- Resuspendera S f 9 celler i 20 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) pH 7,4 med proteashämmare cocktail (1 tablett per 50 ml) vid 4 ° C, garanterar attprov visas visuellt homogen och inga klumpar av celler kvar.
- Lyse celler med hjälp av en högtryckscell disruptor (tabell av material och utrustning), nådde minst 10.000 psi (helst 15,000-20,000 psi) i 2 min per passage. Håll provet vid 4 ° C under lys.
- Samla provet i ett rör på is efter lys perioden sedan omedelbart ladda provet i cellen disruptor. Upprepa lys proceduren 3 gånger. Undersök i mikroskop för att säkerställa mindre än 10% förblir intakta.
OBS: andra metoder för att lysera celler, såsom glaspärlor, etc. har inte granskats noggrant för det här systemet, men en användare kan hitta en sådan en alternativ metod är lämplig.
- Samla provet i ett rör på is efter lys perioden sedan omedelbart ladda provet i cellen disruptor. Upprepa lys proceduren 3 gånger. Undersök i mikroskop för att säkerställa mindre än 10% förblir intakta.
- Centrifugera cellys materialet vid 4 ° C i en höghastighetscentrifug vid 2000 xg under 20 min. Samla supernatanten och kassera pelleten. Dividera supernatanten bland 20 rör och centrifugera proverna för en timme vid 4 ° C vid 125000 x g i en bords ultracentrifuge.
- Avlägsna och kassera supernatanten, försiktigt så att inte störa pelleten, och lagra pellets i samma rör vid -80 ° C under mindre än 2 månader fram till användning, eller behålla på is och fortsätta med reningen omedelbart.
- CFTR solubilisering
- Erhåll 1-4 färska eller frysta Sf 9 råmembranpellets och återsuspendera var och en i en ml buffert 1 (2% fos -choline; se tabell 1 för fullständiga receptet) vid 4 ° C på is, med användning av en 25 G nål och en ml spruta tills lösningen är homogen med ögat utan synliga cellmembran klumpar. Om mer än en pellet vara lösta, fortsätta att behandla varje prov per instruktionerna för en enda pellet nedan parallellt, sammanslagning av proverna vid steg 1.3.2.
- Lös en mini proteashämmare tablett i 1 ml Buffert 2 (10 mM imidazol, se tabell 1) som saknar fos -choline 14 detergent (proteashämmare är 10 x mer concentbetygsatt än deras rekommenderade späd på denna punkt) och tillsätt 100 l till suspenderas råmembranpellet (proteashämmare är som rekommenderad späd på denna punkt). Ställ på is i 45-60 minuter med att blanda genom att vända fem gånger varje 5 min.
- Centrifug suspenderades råmembran pelleten i en bordsskiva ultracentrifugen under 25 minuter vid 125.000 xg och 4 ° C. Behåll supernatanten, som innehåller upplöst CFTR och kasta pelleten.
- Kolumn bindning, fosforylering och eluering
- Tvätta 400 pl av nickel-NTA (nitrilotriättiksyra) agaros uppslamning eller motsvarande harts med 1 ml Buffert 2 (10 mM imidazol, se tabell 1), som saknar detergent, för att avlägsna lösningsmedel och buffert vid 4 ° C. Upprepa tvätta ytterligare två gånger.
- Kombinera solubiliserat CFTR, återstående proteas-inhibitor (900 ul) och nickel-harts (från 400 pl uppslamning) till totalt 10 ml med buffert 2 (10 mM imidazol, se tabell 1) wso m saknar fyllt på tvättmedel. FOS -choline 14 koncentration effektivt späddes till 0,2% (vikt / volym) vid detta steg. Om det finns flera rör, pool alla prover innehållande solubiliserat CFTR, proteashämmare, nickel-NTA-harts och 0,2% (vikt / volym) fos -choline-14 vid denna punkt. Inkubera under 60 minuter vid 4 ° C med försiktig skakning.
- Pass CFTR-proteasinhibitor-nickel NTA lösning ner en liten screening kolonn (tabell 1) eller en motsvarande tom kolonn.
- Tvätta nickel NTA harts, som kvarhålles i kolonnen, med 4 ml per ursprunglig pellet av Buffert 3 (10 mM imidazol + DDM; se tabell 1) som saknar fos -choline 14, men den innehåller en mM DDM (dodekyl maltosid detergent), vid 4 ° C. Tillsättning av DDM tvättmedel inte signifikant ändra pH i denna buffert.
- Förbered PKA-MgATP lösning genom att tillsätta 25 ^ (5 mM, slutlig koncentration) i MgATP, 2.500 U av cAMP-beroende proteinkinas A, katalytisk subenhet (PKA) till 475 pl Buffert 3 (10 mM imidazol + DDM, se tabell 1) till kolonnen. Fosforylera protein genom försegling av bottenänden av kolonnen med ett lock eller Parafilm, och tillsats av 500 pl av PKA-MgATP lösningen för varje inledande pellet användes.
- Inkubera vid rumstemperatur (20 ° C) under 20 min med försiktig blandning och återsuspension av hartset med användning av en 1 ml pipett varje 2 min för att säkerställa att PKA har kommit i kontakt med hela ytan av nicklet NTA harts.
- Ta av locket och eluera PKA / MgATP lösning från kolonnen. Tvätta kolonnen med 2 ml Buffert 3 (10 mM imidazol + DDM; se tabell 1) vid 4 ° C.
- Multiplicera antalet pellets som används i experimentet genom 4. Tvätta kolonnen med denna antalet ml Buffert 4 (50 mM imidazol + DDM; se tabell 1) vid 4 ° C, genom tillsats av 4 ml buffert till kolonnen, vilket gör att den att flyta genom och omedelbart tillsätta nästa 4 ml alikvot till kolonnen.
- Koncentrera proteinprov för att avlägsna imidazol och lågmolekylära nedbrytningsprodukter med hjälp av en centrifug filteranordning (100.000 molekylvikt cut-off) som beskrivs i tabell av material och utrustning eller annan liknande anordning, i totalt 10 ml Buffert 6 (75 mM KI + DDM; se tabell 1) eller annan buffert av val innehållande 1 mM DDM (såsom Buffert 7 för icke-jodid utflödes experiment, 25 mM HEPES + DDM; se tabell 1), genom centrifugering vid 2000 xg och 4 ° C under ca 20 min tills provet koncentrat till 200 | il. Späd provet till 10 ml och upprepa steg koncentrationen.
OBS: I vår erfarenhet (opublicerad), imidazol signifikant inhibitar ATPas aktiviteten hos CFTR och bör tas bort i detta steg genom utspädning och koncentration minst två gånger om provet kommer att användas för funktionella mätningar. - Samla koncentrerat renat CFTR. Förvara vid 4 ° C i närvaro av DDM buffert fram till användning inom 1-2 dagar eller fortsätta på omedelbart till beredning steget. Frys inte det renade proteinet, som i vår erfarenhet som vi observerar minskad aktivitet.
2. Beredning av CFTR
- Lipid beredning
OBS: CFTR har framgångsrikt rekonstitueras in Egg PC, POPC, 2: 1 (vikt / vikt) ägg-PC: POPC (1: 1 vikt / vikt) blandning, eller en blandning av PE: PS: PC: ergosterol, 5: 2 : 2: 1 (vikt / vikt).- För jodid utflödes experiment, torr 5 mg Egg PC (200 pl 25 mg / ml lager, se tabell av material och utrustning) under en ström av argongas under 20 minuter vid rumstemperatur i en Pyrex eller annan robust (icke-borosilikatglas ) glasrör.
- Använda absorbans vid 280 nm, en ELISA enssay eller annan metod, uppskatta den koncentration av det renade CFTR proteinprovet. För jodid utflödes experiment med vildtyp CFTR, använd ett protein: lipid förhållandet 1: 300-1: 3000 (w / w) för att producera en tillräcklig signal. För G551D- och F508del-CFTR, använder ett protein: lipid-förhållande av ungefär 1: 200 till 1: 1200 (vikt / vikt) i syfte att detektera efflux aktivitet.
- Optimera proteinet: lipid-förhållande för varje speciellt system. Beräkna volymen av renat protein som erfordras. Beräkna volymen av buffert med 1 mM DDM krävs för att göra en slutlig volym av 1 ml, dvs, 1 ml - (volym proteinlösning krävs) = volym buffert.
- Lägg den beräknade volymen av den önskade buffertsystem med 1 mM DDM till den torkade lipid (men inte lägga CFTR proteinet vid denna tid) och täcka glasrör med Parafilm. För jodid utflödes experiment, suspendera lipider i Buffert 6 (75 mM KI + DDM, se tabell 1). För andra experiment suspendera i buffert 8 (25 mM HEPES + DDM, seTabell 1) eller en annan önskad intern buffert innehållande 1 mM DDM.
- Vortexa i 2 min vid rumstemperatur för att underlätta suspension av lipid i DDM buffert. Alternativt Provet uppvärms till 37 ° C under 1-2 min före vortexning.
- Suspendera lipiden upprepade gånger vid rumstemperatur med en 1 ml spruta och 25 G nål tills ingen Lipidfilmen är synlig på sidorna av röret. Undvik att injicera luft i lösningen som skulle producera fina bubblor och stöd i oxidation av jodid och lipider.
- Sonikera suspenderade lipid i Parafilm täckta röret för en 20 sek brast i ett badsonikator innehåller is, och sedan överföra direkt till is under 1 min. Upprepa 3 gånger.
OBS: Intensiv ultraljudsbehandling vänder jodid lösningar gula på grund av oxidation. Därför undvika överdriven ultraljudsbehandling. Övervaka provet för färgförändringar. Om en färgförändring noteras, kassera provet och förbereda igen. Förändringen i färg på grund av oxidation av vissa avjodiden skulle resultera i oxidation av lipiderna under samma betingelser. Förskjuta luften från röret med argongas före sonikering av lösningen kommer att hjälpa till att förhindra oxidation av lipider och jodid. Intensiv ultraljudsbehandling kan bryta dålig kvalitet eller repade glasrör som resulterar i förlust av provet. - Lägg volymen av renat CFTR beräknats i steg 2.1.3 till den sonikerade lipiden provet för en uppnå en slutvolym av 1 ml. Blanda proteinet med lipiden och tvättmedelslösning genom resuspension 10 gånger med en spruta 25 G nål och en ml.
- Ställ lipid och proteinprov på is under 30 min med virvling av röret för att blanda 5 gånger varje 5 min.
- Tvättmedel bindande kolonn beredning
- Skaffa ett enda användnings kommersiellt rengöringsmedel bindande spinnkolonn (se tabell av material och utrustning) med en 1 ml volymkapacitet och bryta fliken längst ned för att starta kolonnen flyter.
- Centrifugera kolumnen för 2 min vid 2000 xg för att avlägsna lagriUffer, och kasta denna buffert.
- Tillsätt 5 ml av buffert 7 (75 mM Kl, se tabell 1) till kolonnen och centrifugera sedan vid 200 xg under 4 min för att eluera tvättbufferten. Upprepa detta steg två gånger för totalt tre tvättningar för att avlägsna alla spår av buffertlagret. Släng alla genomströmning.
OBS: Det är viktigt att den buffert som används för att tvätta kolonnen inte innehåller DDM eller något annat rengöringsmedel. Kolonnen har en ändlig bindningskapacitet för tvättmedel och om en buffert innehållande detergent används kommer kolonnen att bli ineffektivt på att ta bort detergenten från proteinprovet-lipid-detergent. - Noggrant alikvot alla 1 ml av det lipid-detergent-proteinet på toppen av hartskolonnen och inkubera provet vid toppen av kolonnen för 2 min vid rumstemperatur.
- Centrifugera provet vid rumstemperatur under 4 min vid 2000 xg och samla den grumliga proteoliposome provet i ett rent 1,5 eller 2 ml mikrofugrör eller ett glasrör och placera samniskor på is.
- Samla återstående proteoliposomer i kolonnen genom tillsats 200 pl av Buffert 7 (75 mM Kl, tabell 1) eller en annan buffert (utan rengöringsmedel) till toppen av kolonnen och upprepa centrifugeringssteget för 2 min.
- Lägg den andra eluatet till proteoliposome provet om det ser grumligt.
- Förvara provet vid 4 ° C över natten eller använd omedelbart för jodid mätningar utflödes.
3. Iodide utflöde Mätningar för Renat, Rekonstituerat CFTR
- Generering av en jodid gradient över proteoliposomal membranet
- Pre-swell Sephadex G50 pärlor i buffert 9 (75 mM K-Glu, kalium glutamat, se tabell 1), (ca 5 g torra kulor i 50 ml buffert) eller önskad extern buffert i rumstemperatur i minst 2 timmar eller vid 4 ° C över natten.
- Förbered fyra Sephadex G50 kolonner mättade i buffert 9 (75 mM K-Glu, se tabell 1) eller annanbuffert i små screening kolumner genom att ladda hartset till åtminstone ¾ i kolonnen.
- Centrifugera under 4 min vid 2000 xg för att avlägsna överskott av buffert från hartset. Det bör vara ungefär 2,25 ml av packade hydratiserad harts i kolonnen vid slutet av centrifugeringssteget.
OBS: Resin bör lätt återfuktad men inte nedsänkt i vätska och en efterföljande kort spinn bör inte eluera betydande volymer buffert. Det är avgörande för en framgångsrik eluering av prov proteoliposome att hartskolonnen varken är för våt eller för torr och användaren kan behöva experimentera med kolumnerna för att bekanta sig med de mest framgångsrika buffertutbytesförhållandena. - Försiktigt lägga 125-150 pl av proteoliposome prov till toppen av varje kolumn och centrifugera under 4 min vid 2000 x g.
- Pool proteoliposome eluat tillsammans för omedelbar användning i jodid utflöde eller andra experiment.
OBS: Den eluerade volymen från varje kolumn ska vara ungefär150 l och provet bör vara något grumlig, men mindre grumligt än det ursprungliga provet. Större volymer eller tydliga eluat tyder på att kolonnerna inte har torkat tillräckligt, eller har torkat för mycket, respektive, och kommer inte att resultera i en lyckad jodid utflödes experiment.
- Jodid efflux assay
- Tvätta en jodid selektiv mikroelektrod (tabell av material och utrustning) i stor utsträckning med avjoniserat vatten, och sedan inkubera i 20 min före försöket i buffert 10 (15 iM KI, se tabell 1). Tvätta elektroden igen mycket med avjoniserat vatten.
- Lägg 150 pl av läkemedel (20 pM typisk koncentration för att producera en slutlig koncentration av 10 | iM i analysen) i Buffert 9 (75 mM K-Glu, se tabell 1) eller vehikel i Buffert 9 till en brunn i en 96-brunnars platta med en liten loppa omrörarstav.
- Se till att det inte finns några bubblor. Använd en pipett för att ta bort ströbubblor. Om en läkemedelslösning används, se till att den slutliga DMSO-koncentrationen i brunnen är mindre än 1% (volym / volym) (typiskt 0,1-0,2% (volym / volym)).
- Lägg 150 pl av rekonstituerad CFTR-protein som producerades i avsnitt 3.1 i Buffert 9 (75 mM K-Glu, se tabell 1) till brunnen med läkemedel eller buffert, för att producera en total volym av 300 | il i brunnen i plattan.
- Placera 96-brunnar på en uppståndelse tallrik och rör vid 130 rpm (eller vid en måttlig hastighet av ungefär ¼ av den maximala hastigheten).
- In spetsen av jodiden selektiva elektroden försiktigt in i brunnen med provet så att spetsen inte vidrör botten av brunnen eller träffas av omrörarstav. Se till att referenselektrod, om separat, är också i kontakt med lösningen i brunnen.
- Rekord kurvor med hjälp av en hemmagjord eller kommersiell datorprogram som gränssnitt med elektroden (se tabell av material och utrustning för detaljer).Använd en samplingshastighet på 2 Hz, med filtrering av signalen genom ett lågpassfilter.
- Låt provet jämvikt under 5 min till en stabil plan, eller i närheten av platt baslinjen under inspelning.
- Lägg 3 pl MgATP (100 mM stam framställd i dH 2 O och justerades till pH 7 med KOH; 1 mM slutlig koncentration) och provet för att aktivera proteinet. Tillåt ~ 5 min att nå en ny stabil baslinje. Justera alltid pH i 100 mM MgATP lager till neutral före användning för att undvika förändringar i pH i externa bufferten.
- Lägg 3 pl av valinomycin lager (2 uM; 20 nM slutkoncentration) till provet för att shunta ändringar i potentialskillnaden som genereras av jodid-selektiv konduktans genom CFTR. Anteckna minskande lutningen (minskning i mV) på grund av CFTR-medierad jodid utflödes verksamheten under minst 5 minuter.
- För att säkerställa att infångning av jodid i de proteoliposome lumen var tillräcklig, tillsätt 3 | il av 10% (volym / volym) Triton X-100 till provet. Significant och omedelbar jodid frigivning indikerar att tillräcklig jodid har varit instängd i blåsorna så att fånga inte var den begränsande faktorn för de förändringar i lutning bestäms i 3.2.9 utan snarare CFTR-medierad aktivitet.
- Tvätta elektroden och omrörarstav noggrant med avjoniserat vatten efter behandling av proverna med läkemedel eller med Triton X-100 för att säkerställa att alla spår av dessa reagens har tagits bort för att undvika kontaminering av nästa prov.
- Bered en serie av utspädda KI-koncentrationer i det mikromolära till nanomolära området i Buffert 9 (K-Glu-buffert, se tabell 1). Anteckna mV svaret av elektroden till varje koncentration från 0 till den högsta koncentrationen bereddes. Konstruera en standardkurva där proben svar (mV) är plottat mot logaritmen av den molära jodidkoncentrationen. Använd standardkurvan för att omvandla mV svaret hos sonden under utflödes experimentet till koncentration av jodid frigörs.
OBS: Bered en kalibrerings curve veckovis tills en användare är säker på hur snabbt svaret av sond förändringar. Det kommer att finnas en drift i svaret och känslighet av proben över tiden. Som prob åldras kommer svaret nedbrytas. Detta kan delvis upphävas genom att ändra de interna lösningar regelbundet och omfattande tvättning av sondspetsen i vatten efter användning, vilket sannolikt gränser vidhäftning av molekyler till sondytan. - Bestäm den genomsnittliga lutningen på linjen av koncentrationen mot tiden tomt för varje proteoliposome prov för den sista 30 sek före tillsats av MgATP, och efter tillsats av valinomycin men före tillsats av Triton X-100. Subtrahera baslinjen lutning från valinomycin att bestämma CFTR-medierad jodid utflödes aktivitet för det provet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beskrivs i denna skriftliga publikation är metoder för att rena, återskapa och mäter reglerad kanal aktivitet CFTR-proteinet. Figur 1a visar arbetsflödet för rening, beredning och jodid utflödesförfaranden. Metoder för beredning och kanalaktivitetsmätningar av jodid flux visas också mer i detalj i den tillhörande videon.
Rening och ombildning av CFTR i proteoliposomer
CFTR kan funktionellt uttryckas på höga nivåer i S f 9 celler med hjälp av rekombinant baculovirus innehållande Wt eller mutant CFTR cDNA 2. Även om inte ett mammalieexpressionssystem ades CFTR uttrycks enligt det baculovirussystemet i S f 9 celler för att säkerställa en hög nivå av uttryck. CFTR produktion kan vara så hög som 1% av det totala cellulära proteinet 17,28. S f 9- baculovirussystem har fördelen att proteinet är kärnan glykosylerat ochkvalitetskontroll maskiner i detta system är relativt tillåtande så att CFTR och mutanter kan produceras på cellytan. En tio histidinmärkning manipulerades på karboxiterminalen för att tillåta rening på grund av affiniteten hos denna tagg för nickel-NTA. Den C-terminala taggen hjälper till att förhindra samtidig rening av trunke CFTR proteiner och avkastning funktionell CFTR protein i ATPas, singel kanal och jodid utflödes experiment 17,19,24,28,29. Men renings protokoll som beskrivs här ska vara lämplig för N-terminalt märkt CFTR också.
Tidigare har det visats att CFTR-protein effektivt kan extraheras från Sf 9 plasmamembranpreparat med användning NaPFO (natrium pentadecafluoro-oktanoat) vid rumstemperatur 15. Emellertid, för att känsligheten hos NaPFO utfällas vid 4 ° C, en temperatur som gynnar bevara korrekt veckat protein, och den utdragna dialys krävs för att avlägsna PFO var inte mottagliga för rapid rening och beredning metoder avsedda att maximera aktiviteten hos proteinet i efterföljande analyser av CFTR funktion. En utvärdering av en panel av rengöringsmedel (inklusive dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 3 - [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), fos -choline 12 och fos -choline 14, visade att FOS -choline 14 var mest effektiva i att solubilisera humana CFTR-His 10 från Sf 9 membran, och att DDM var effektivt vid upprätthållande av ATPas-aktiviteten hos CFTR i detergentlösning (data ej visade). Sålunda en fos -choline 14 detergentextraktion steg utförs, följt av utbyte för att DDM tvättmedel för att bibehålla aktiviteten hos proteinet.
Efter rening och koncentration, är en proteinfraktion som erhållits i DDM rengöringsmedel som innehåller en kDa band ~ 150 som sin huvudkomponent (Figur 2; Silver Stain). Denna molekylvikt motsvarar människans CFTR uttrycks i S <em> f 9cells och analyseras med SDS-PAGE, där det saknar de typer av komplex glykosylering karakteristisk för CFTR i däggdjursceller. De 150 kDa species verkar ungefär 90% rena efter SDS-PAGE-analys och silverfärgning. Western blotting med hjälp av M3A7 anti-CFTR antikropp bekräftar att detta musmonoklonal riktad mot NBD2 reagerar med kDa-bandet 150 (Figur 2; blot). I vissa studier, spårmängder av lågmolekylära komponenter finns som mindre band synliga på gelén, vid ~ 60 och ~ 80 kDa (data visas ej). Den M3A7 anti-CFTR antikropp reagerar med 60 och 80 kDa-banden, men reagerar inte med andra icke-CFTR proteiner (data visas ej). Detta antyder att de lågmolekylära komponenter är CFTR nedbrytningsprodukter samrenat med CFTR via deras C-terminala His-markör. Reningen sker i närvaro av proteasinhibitorer och det förefaller som om dessa komponenter är närvarande i cellerna innan reningsförfarandet iar utförs. Den koncentrationssteg av förfarandet avlägsnar praktiskt taget alla av de kontaminerande lågmolekylära fragment. CFTR kan rekonstitueras vid denna punkt, eller protein från en annan reningsförfarande kan användas i beredning protokollet.
En liposomal flux baserad analys rapporterar den funktionella beredning av en population av renade och ombildade CFTR molekyler som regleras, anjonselektiva kanaler
För att avgöra om en betydande andel av renat CFTR ombildades som reglerad kloridkanal med hjälp av ovanstående metoder, var en proteoliposomal halid flödesanalys utvecklades som rapporterar aktiviteten hos en population av ombildade CFTR molekyler (visas schematiskt i figur 1B). Om, i värsta fall, de flesta av de rekonstituerade CFTR molekylerna felveckade, dessa molekyler kommer att misslyckas att ge en konduktans, misslyckas med att skilja mellan katjoner och anjoneroch / eller grinden kommer sakna reglering av PKA fosforylering och nukleotider. Lee et al. Har publicerat metoder som gör att uppskattningen av procent funktionell beredning av ett membranprotein 30.
Tomma liposomer (saknar CFTR) eller proteoliposomer (bär rekonstituerad CFTR) är laddade med KI (75 mM) och extra liposomalt jodid utbytt med kalium glutamat (75 mM) genom att liposomer genom en gelfiltreringskolonn. KI laddade proteoliposomer läggs till en brunn innehållande K-Glu (kalium glutamat) för att skapa en utåtriktad gradient för jodid och utflöde övervakas som ökningar i extraliposomal jodid över tiden med en jodid känslig mikroelektrod 24. Utflödet av negativt laddade iodide resulterar i en minskning i mV signalen (signalen blir mer negativ). När koncentrationen av jodid frisätts över tiden plottades, är lutningen inverteras (såsom i fig 3) för att visa en ökning av jodid i fritttern lösning över tiden.
K-Glu valdes som impermeant motjon eftersom det är ett exempel på en anjon som inte passerar genom CFTR-proteinet, tycks inte orsaka betydande blockering av porerna under de betingelser som används, och inte störa den jodid selektiva elektrod. En analys skulle kunna optimeras kring en annan anjon, förutsatt att den uppfyller dessa kriterier. Sjuttiofem mM anjon koncentrationer valdes empiriskt som koncentrationer som gav god fångst och tillräckliga signaler för mätning i analysen enligt de villkor som beskrivs. Det blir i huvudsak ingen jodid frigivning från jodid laddade liposomer som saknar funktionellt rekonstituerade CFTR tills blåsor är permeabiliseras med tvättmedel (Figur 3; styrspår), medan CFTR-rekonstruerad, jodid belastade proteoliposomer förmedlar jodid utsläpp i extern lösning efter tillsats av MgATP (1 mM) för att öppna CFTR kanalen och valinomycin(20 nM) för att förhindra utvecklingen av en membranpotential (fig 3A; se spår för protein: lipid massförhållandet 1: 3000 (vikt / vikt)).
Valinomycin är en jonofor som shuttles kalium specifikt över membranet, ned dess koncentrationsgradient och koncentrationen av 20 nM valdes empiriskt som den högsta koncentration som inte stör integriteten för tom liposom i föreliggande system. Detta kan behöva optimeras för varje speciellt system. Utan tillsats av valinomycin, finns det en förkortad jodid frisättning av ett fåtal nM som snabbt når en platå (data ej visade). Även om dessa betingelser är kända för att i övrigt maximalt aktivera anjonen kanalaktiviteten av CFTR (som i figur 3A), framgår det att avsaknaden av en signifikant svar speglar den momentana ökningen intraliposomal positiv laddning medierad av jodid ledning genom anjonselektiva por i CFTR omedelbart begränsa continulig jodid utflöde där valinomycin ingår inte. Denna valinomycin-medierad reaktion bekräftar att jodid utflöde var begränsad i de tidigare försöken på grund av laddnings ackumulation, stödja anjonen selektivitet rekonstituerad CFTR. Om CFTR saknade denna selektivitet, skulle både kalium och jodid har kunnat efflux från proteoliposomer därigenom upphäva behovet av valinomycin att initiera flöde.
De jodidkoncentrationer värderade till dessa inledande tidpunkter var empiriskt UTVALT falla inom det optimala känslighetsområde för jodid avkänningselektroden anställd. Användning av andra jodid elektroder kan kräva optimering av dessa faktorer. Efter att ha nått en platå, är Triton X-100 läggs till permeabilisera proteoliposomer och släpp eventuella kvar instängd jodid. Till skillnad från de initiala jodid mätningar (erhålls mellan 1 och 2 min efter valinomycin tillsats), avläsning vid dessa endpoints inte i det linjära intervallet elektrod calibrering kurva (data ej visade), vilket omöjliggör en korrekt utvärdering av den fraktion av liposomer från vilka CFTR-protein har förmåga att mediera jodid utflödes förhållande till det totala antalet av liposomer i analysen, eller dess procent funktionell rekonstitution.
Hastigheten av jodid flussmedel speglar antalet CFTR-proteinmolekyler, den öppna sannolikhet och enhetlig konduktans hos varje CFTR kanal. Därför bör andelen jodid utflöde vara beroende av antalet och öppna sannolikheten för varje CFTR molekyl. Förutsägelsen testades i detta system genom att öka antalet av CFTR molekyler per liposom. Förhållandet mellan aktiverad (fosforyleras och MgATP behandlad) CFTR protein till lipid var varierat, med förhållandet mellan 1: 300-1: 3000 (w / w) (Figur 3A). Ju större mängden av rekonstituerad CFTR närvarande i proteoliposomer, den större graden av utflöde (mätt mellan 1-2 min efter valinomycin tillsats), stödja förutsägelse thatt utflödes priser är beroende av antalet CFTR molekyler i varje liposom. Den utflödeshastighet erhålls genom att använda specifikt protein: lipidkvoter är reproducerbara mellan experimentella dagar och protein reningar, vilket belyser stringens med denna metod.
Hastigheten av jodid efflux verkar relatera till den öppna sannolikheten för CFTR-kanalen i detta rekonstituerade systemet. Som fosforylering med PKA krävs för CFTR aktivering 31 (och granskning av 32), kan det förväntas att det kommer att finnas en låg hastighet av jodid efflux i vesiklar innehållande CFTR som inte har fosforylerats av exogent PKA behandling, där den öppna sannolikheten är låg . I proteoliposomer som har PKA behandlas, kommer den öppna sannolikheten vara mycket högre, vilket resulterar i en mycket högre förväntade hastighet av efflux. I praktiken, för PKA-behandlade CFTR i närvaro av 1 mM MgATP i detta system, graden av jodid efflux mätt Mellan ett och två minuter efter tillsats av valinomyci är ungefär fyrfaldig graden av CFTR-proteinet utsätts för MgATP men inte PKA (Figur 3B). Dessa resultat stöder hypotesen att utflödestakten avser kanalisera öppen sannolikhet. I praktiken kan det vara svårt att jämföra aktivitet i denna analys direkt att öppna sannolikhet med tanke på att andra faktorer, såsom beroende förändringar tid i den elektrokemiska drivkraft kommer att påverka den observerade utflödesaktiviteten. Läsaren uppmärksammas på att denna analys är inte en ersättning för detaljerade enstaka kanalaktivitetsinspelningar.
Intressant nog är det typiskt observeras en låg hastighet av jodid efflux av "ofosforylerade" protein i närvaro av MgATP, som är signifikant större än utflöde från liposomer som saknar CFTR (Figur 3B, C). Denna låga kan återspegla basal fosforylering av CFTR i Sf 9 cellexpressionssystem före rening 33. CFTR renat från andra uttrycks systems kan ha olika nivåer av basal fosforylering och därmed olika restaktivitet.
Denna snabba rening protokoll avkastning Wt-CFTR från S f 9 celler vid nära homogenitet, men för F508del- och G551D-CFTR är metoden bättre beskrivas som ett förfarande för anrikning. Några förorenande band observeras via SDS-PAGE 19, av vilka många återspegla CFTR nedbrytningsprodukter som är reaktiva för CFTR-antikroppar och som förefaller att vara närvarande före cellsönderdelning. Upplösning och jodid flödesmetoder är lämpliga för dessa berikade prover av kliniskt relevanta mutanter. Såsom visas i fig 3D, är signifikant jodid efflux mättes för både F508del- (protein: lipid massförhållande av cirka 1: 600) och G551D-CFTR (protein: lipid-förhållande av ungefär 1: 300). Även om båda mutanter har lägre absolut aktivitet än Wt-CFTR (protein: lipid massförhållandet 1: 1,200), är det svårt att jämföra proverna direkt som kvantifieringkan inte vara så noggranna för mutanter som är förorenade med CFTR nedbrytningsprodukter. Men både F508del-CFTR och G551D renas genom dessa metoder, beredas och utsattes för utflödes mätningar svara så förväntas småmolekylära potentiatorer (Figur 4), och visar liknande kanalfunktion till protein renas genom strängare PFO reningsmetod 19.
Kanal aktiviteten av renat och rekonstitueras CFTR kan moduleras genom småmolekylinhibitorer och potentiatorer
CFTR inh -172 34 är den mest specifika CFTR hämmare tillgängliga som har visats hämma den öppna sannolikheten för CFTR kloridkanaler i enstaka kanal konduktans mätningar 35 och hämma CFTR aktivitet i andra studier 22,36. Såsom visas i figur 3C, är hastigheten av utflödet efter valinomycin tillsats minskas signifikant genom förbehandling med CFTR inh ub> -172. Därför är denna analys av kanal aktiviteten hos en population av renade och ombildade CFTR molekyler effektiva i rapporteringen aktivitet modulatorer såsom hämmande ligand CFTR inh -172.
Analysen är känslig och mycket tillämplig på undersökning av effekterna av små molekyler potentiator behandling också. Såsom visas i fig 4, är alla tre CFTR genotyper testades väsentligt potentieras av aktiva småmolekylära potentiatorer såsom Kalydeco / VX-770 eller VRT-532 (figur 4C; visad för G551D), medan en inaktiv analog har ingen effekt på den jodid efflux aktivitet CFTR (visad för F508del-CFTR; Figur 4B). Analysen är tillämplig på prövningen av beroende potentiator koncentration, och den roll som ATP och fosforylering på potentiator medierad CFTR aktivitet.
27fig1highres.jpg "width =" 700px "/>
Figur 1:. Analys design och arbetsflöde (A) Arbetsflöde för det arbete som beskrivs i denna publikation (B) Schematisk representation av jodid utflödes experimentet.. En modifierad version av panel B publicerades ursprungligen i The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; och Bear, CE cystisk fibros transmembran (CFTR) potentiator VX-770 (Ivacaftor) Öppnar Defekt Channel Gate i Mutant CFTR i en Fosforylering beroende men ATP-oberoende sätt. 2012; 287: 36.639-36.649. © Det amerikanska samhället för biokemi och molekylärbiologi.
Figur 2:. CFTR snabb rening procedur ger renat Wt-CFTR-protein silverfärgad SDS-PAGE-gel och västern blot hjälp av M3A7 CFTR antikropp för renat humant Wt-CFTR proteinet i DDM tvättmedel (1 ug och 0,1 mikrogram för gelen och blot, respektive), isolerade från S f 9 celler som överuttrycker en (His) 10-märkt version av proteinet. Wt-CFTR (> 90% ren) upptäcks vid 150 kDa, lämplig för detta protein saknar komplex glykosylering. Denna forskning publicerades ursprungligen i The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; och Bear, CE cystisk fibros transmembran (CFTR) potentiator VX-770 (Ivacaftor) Öppnar Defekt Channel Gate i Mutant CFTR i en Fosforylering beroende men ATP-oberoende sätt. 2012; 287: 36.639-36.649. © Det amerikanska samhället för biokemi och molekylärbiologi.
Figur 3: Den iodide utflödesanalysrapporter reglerad kanal aktivitet för det renade och beredda CFTR protein. (A) Renat och fosforylerades Wt-CFTR rekonstituerades vid protein: lipid-förhållanden av 1: 300 (vikt / vikt), 1: 1200 (vikt / vikt) och en: 3000 (vikt / vikt) medierar jodid utflöde från vesikeln lumen till bulk badet över tiden efter tillsats av 1 mM MgATP och 20 nM valinomycin. Tillsatsen av 0,1% (vikt / volym) Triton X-100 för att permeabilisera proteoliposomer släpper infångade jodid i vesikeln lumen vid slutet av experimentet. (B) Ursprunglig jodid efflux tidsförloppet för rekonstituerad Wt-CFTR-protein som inte hade varit pre-fosforylerade. (C) Initiala jodid utflödeshastigheter visar beroendet av den observerade aktiviteten på funktionell CFTR-protein. PKA fosforylering av proteinet krävs för signifikant kanalaktivitet, som inhiberas genom tillsats av CFTR-inhibitor, CTTR inh -172 (20 ^ M). Data är medelvärden ± SEM; * P <0,05, *** p <0,0001. (D) Flera genotyper producerar reglerade CFTR signaler i jodid utflödesanalysen, inklusive vikt, F508del- och G551D-CFTR kontra kontroll. Data är medelvärden ± SEM; * P <0,05; *** P <0,0004 jämfört med kontrollen. Denna forskning (delar av data i paneler A, C och D) publicerades ursprungligen i The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; och Bear, CE cystisk fibros transmembran (CFTR) potentiator VX-770 (Ivacaftor) Öppnar Defekt Channel Gate i Mutant CFTR i en Fosforylering beroende men ATP-oberoende sätt. 2012; 287: 36.639-36.649. © Det amerikanska samhället för biokemi och molekylärbiologi.
Figur 4: Fosforyleringen beroende potentiering av CFTR av små molekyler kan avfrågas med hjälp avjodid utflödessystem för vikt-, F508del- och G551D-CFTR. (A) Wt-CFTR potentieras signifikant av potentiatom VX-770 (10 | iM), enbart i PKA-fosforylerade tillståndet. Data är medelvärden ± SEM, * p <0,01 vs. + PKA-VX-770. (B) VX-770 (10 M) men inte en inaktiv analog, V-09-1188 (10 M), potentierar signifikant jodid utflödet aktivitet av fosforylerad F508del-CFTR. Data är medelvärden ± SEM, n = 3, *** p <0,001 vs. -VX-770 styrning. (C) Förstärkning av G551D-CFTR med 10 iM VRT-532 eller VX-770. Data är medelvärden ± SEM, n = 5, ** p <0,001, *** p <0,0001 vs -VX-770 kontroll. Denna forskning (paneler ac) publicerades ursprungligen i The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; och Bear, CE cystisk fibros transmembran (CFTR) potentiator VX-770 (Ivacaftor) Öppnar Defekt Channel Gate i Mutant CFTR i en Fosforylering beroende men ATP-oberoende sätt. 2012; 287: 36.639-36.649. © Det amerikanska samhället för biokemi och molekylärbiologi.
| Buffert | Namn | Innehåll | pH | Justera pH med användning av |
| Buffert 1 | 2% fos -choline | 2% (vikt / volym) fos -choline 14 detergent i 10 mM imidazol, 25 mM HEPES | 7,4 | Imidazol / HEPES |
| Buffert 2 | 10 mM imidazol | 10 mM imidazol, 25 mM HEPES (inget diskmedel) | 7,4 | Imidazol / HEPES |
| Buffert 3 | 10 mM imidazol + DDM | 10 mM imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM dodekyl-β-D-maltosid | 7,4 | Imidazol / HEPES | Buffert 4 | 50 mM imidazol + DDM | 50 mM imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM dodekyl-β-D-maltosid | 7,4 | Imidazol / HEPES |
| Buffert 5 | 600 mM imidazol + DDM | 600 mM imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM dodekyl-β-D-maltosid | 7,4 | Imidazol / HEPES |
| Buffert 6 | 75 mM Kl + DDM | 75 mM Kl, 20 mM MOPS, 1 mM dodekyl-β-D-maltosid | 7,4 | KOH |
| Buffert 7 | 75 mM Kl | 75 mM Kl, 20 mM MOPS | 7,4 | KOH |
| Buffert 8 | 25 mM HEPES + DDM | 25 mM HEPES, 25 mM NaCl, 1 mM dodekyl-β-D-maltosid | 7,4 | HCl / NaOH |
| Buffert 9 | 75 mM K-Glu | 75 mM K-glutamat, 20 mM MOPS | ight "> 7,4KOH / Glutaminsyra | |
| Buffert 10 | 15 mM Kl | 15 mM Kl, 20 mM MOPS | 7,4 | KOH |
Tabell 1: Tabell över buffertar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har funnits ett begränsat antal reningsprotokoll för fullängds, funktionell CFTR isolering, från en mängd olika cellulära överuttryck system. Metoden som beskrivs här är fördelaktigt eftersom det möjliggör en snabb rening av Wt-CFTR eller hög anrikning av F508del- och G551D-CFTR i måttliga mängder som är mycket funktionell i analyser inklusive ATPas och direkta mätningar av kanalfunktion, inklusive enkanaliga mätningar i plana tvåskiktsmembran system och visat åtgärder av CFTR befolkningskanalfunktion som är mycket relevanta för studien av små molekyler 19-21. Reningsmetoden är integrerad i en snabb och effektiv beredning protokoll, kan dock renat protein från andra metoder kopplas till denna beredning protokoll också, förutsatt att renings tvättmedel är mottaglig för borttagning på samma sätt.
I motsats till komplicerade och mödosamma enkanaliga experiment från excrade membran patchar, de metoder som beskrivs här tillåter en robust men ändå enkel bedömning av CFTR kanalfunktion, och unikt denna åtgärd rapporterar funktionen av en större population av CFTR kanaler snarare än en eller ett fåtal molekyler. Till skillnad från tekniker som involverar membran patchar, tillåter denna metod direkt bedömning av effekterna av småmolekylära modulatorer på kanalen i en nära eller fullständig avsaknad av associerade proteiner, beroende på hur effektiv den kopplade reningsproceduren.
Kritiska steg inom protokollet
Även om det finns flera viktiga steg i funktionell ombildning av CFTR för anjonen flux analysen, som indikerade anteckningar i protokollet, optimering av proteinet: lipid under CFTR beredning är nyckeln. Sådan optimering krävs för varje CFTR genotyp.
Ändringar och felsökning av tekniken
De baslinjen mV response för sonden används här under jodid utflödesanalysen med prover framställda enligt beskrivningen är typiskt -20 till -50 mV. Väsentliga avvikelser från detta intervall tyder det kan finnas problem med provet. Andra prober som säljs av olika tillverkare kan skilja sig från de riktlinjer som ges här. Om inte kan uppnås en stabil baslinje, kan rest tvättmedel eller inaktiv, denaturerad, dålig kvalitet proteinet permeabilisering vesiklarna att jodid.
Underlåtenhet att upptäcka en betydande förändring i graden av valinomycin beroende jodid utflödet från liposomer innehållande fosforylerad CFTR i närvaro av MgATP kan spegla flera frågor, som alla bör undersökas. Dessa frågor är: dålig kvalitet, delvis denaturerad CFTR eller oren CFTR; ofullständig avlägsnande av tvättmedel under beredning; icke-optimala protein: lipid förhållandet i proteoliposomer; eller otillräcklig valinomycin tillade, rendering laddningsavledning ofullständig.
Inom iodide utflödes analyser ger flexibilitet att använda pre-fosforylerade CFTR protein (som beskrivs i protokollet), eller till fosforylerat CFTR under analysen. Om den rekonstituerade proteinet inte fosforylerades under reningsförfarandet, kan provet fosforyleras under jodid utflödes experimentet vid steg 3.2.7, genom tillsats av PKA med MgATP. I så fall se till att baslinjen registreras under minst 5 minuter för att säkerställa att proteinet har tillräckligt fosforyleras av PKA enzymet före mätning funktion med tillägg av valinomycin. Liknande resultat erhålles med endera metoden.
Under protokollet, är modulatorn molekylen tillåts interagera med CFTR-proteinet i 5 minuter före mätningen av aktivitet genom tillsats av MgATP och sedan Valinomycin. Eftersom de flesta CFTR modulatorer är mycket lipofila, kan det ta tid mellan förutom badet och jämvikts association med CFTR-proteinet. Analysen kan inte fortsätta utan the tillsats av valinomycin, och därmed ingen information går förlorad genom att utföra analysen på detta sätt. I situationer där användaren inte är orolig för att det kan finnas en fördröjningstid före interaktion av den lilla molekylen med proteinet, kunde analysen utföras av den akuta tillsats av modulatorn efter tillsatsen av valinomycin, medan fortfarande i den ursprungliga satsen fasen av mätningen.
Begränsningar av tekniken
Som tidigare nämnts, denna proteoliposomal flöde baserad analys av reglerad kanal aktivitet genom en population av renade och ombildade fullängds CFTR molekyler ger en unik metod för att förhöra ligander som direkt modifierar aktiviteten. Emellertid är metoden begränsad då den inte ger en inblick i den mekanism genom vilken ligander ändrar hastigheten för flödet genom CFTR. Helst ska proteoliposomal flödesanalysen av renat och rekonstruerad CFTR användas i kombination med plana läppid dubbelskikts studier av enstaka kanal aktivitet. Denna kombination skulle ge insikt i tillståndet för det protein som binder liganderna, dvs den öppna och / eller det stängda tillståndet.
Betydelse avseende befintliga metoder
Det råder för närvarande brist på metoder för att bedöma den direkta interaktionen mellan små molekyler med CFTR kanalen kontra småmolekylära modulatorer som interagerar med en annan cellulär komponent för att indirekt ändra kanalaktivitet, t ex genom en modulerande eller signalväg eller avbrott i viktiga protein-protein interaktioner. Den jodid utflödes Metoden visar direkt interaktion med proteinet enligt någon liten molekyl som modulerar kanalaktiviteten av CFTR. Trots den låga genomströmningen sättet av mätningarna, kvarstår betydande värde i dessa unika metoder för att studera den direkta interaktionen mellan CFTR med småmolekylära potentiatorer och correctors. Många små molecule modulatorer är under utveckling av både akademiska grupper och läkemedelsindustrin för att behandla CF-patienter kliniskt, eftersom detta är den huvudsyfte aktuell CF forskning. Det förväntas att de metoder som beskrivs här kommer stöd i utvecklingen och valideringen av verkningsmekanismen för de mest lovande av dessa molekyler.
Framtida tillämpningar av tekniken
De metoder som används här är också mycket mottagliga för anpassning till andra proteiner av intresse. Faktiskt en modifiering av de beskrivna metoderna användes för att studera två P. aeruginosa membranproteiner inblandade i rörelsen av anjoniska substrat över membranet 26,27, vilket visar nyttan och mångsidighet av dessa metoder. Deras användning i studien av ytterligare anjon kanaler och transportörer förväntas i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna erkänner råd från Dr Mohabir Ramjeesingh under utvecklingen av reningsmetoder som beskrivs här. Dessa studier stöddes av driftsbidrag till CEB från de kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) och cystisk fibros Canada (CFC). PDWE stöddes delvis av Fellowship utmärkelser genom CIHR och CFC. Författarna erkänner att tillhandahålla corrector, potentiator och hämmarföreningar från Dr. R. Bridges (Rosalind University of Medicine and Science) och distribution av cystisk fibros Foundation Therapeutics (CFFT). Författarna erkänner också enastående service av Baylor Cell Culture Facility (NIH bidrag P30 CA125123) uttrycka Wt och mutant CFTR protein med hjälp baculovirussystemet. Den inaktiva VX-770-analog, V-09-1188, var en gåva från Vertex Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001) |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup. |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
References
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
- Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
- Genetic Analysis Consortium. , http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
- Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
- Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
- Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
- Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
- Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
- Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
- Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
- Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
- Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
- Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
- Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
- Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
- Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
- Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
- Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
- Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).
- Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
- Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
- Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
- Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
- Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
- Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
- Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).
