Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare l'attività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini

Ecologia chimica sviluppata attraverso la collaborazione di chimici ed ecologisti. Mentre la sotto-disciplina di terrestre ecologia chimica è stato intorno per qualche tempo, quello di ecologia chimica marina è solo pochi decenni vecchio, ma ha fornito importanti conoscenze sulla ecologia e comunità la struttura evolutiva degli organismi marini ^1-8. Sfruttando le tecnologie emergenti di immersioni subacquee e di spettroscopia NMR, i chimici organici rapidamente generato un gran numero di pubblicazioni che descrivono nuovi metaboliti bentoniche invertebrati e alghe marine negli anni 1970 e 1980 ^9. Supponendo che metaboliti secondari devono servire a qualcosa, molte di queste pubblicazioni ascritti ecologicamente importanti proprietà a nuovi composti senza prove empiriche. Nello stesso tempo, gli ecologisti sono stati anche approfittando dell'avvento di immersioni subacquee e descrivere le distribuzioni e abbondanze di animali bentonici e piante precedentemente noti from metodi di campionamento relativamente inefficaci come il dragaggio. L'assunzione di questi ricercatori è che qualsiasi cosa sessili e corpo molle devono essere difesi chimicamente per evitare il consumo da parte di predatori ^10. Nel tentativo di introdurre l'empirismo a quello che era il lavoro altrimenti descrittivo sulle specie abbondanze, alcuni ecologisti hanno cominciato estrapolando difese chimiche da saggi di tossicità ^11. La maggior parte dei test di tossicità l'esposizione di pesci interi o di altri organismi a sospensioni acquose di estratti organici grezzi di tessuti invertebrati, con successiva determinazione delle concentrazioni in massa a secco di estratti responsabili dell'uccisione metà gli organismi di analisi. Tuttavia, i saggi di tossicità non emulare il modo in cui i potenziali predatori percepiscono preda in condizioni naturali, e gli studi successivi hanno trovato alcuna relazione tra la tossicità e l'appetibilità ^12-13. E 'sorprendente che le pubblicazioni su riviste prestigiose utilizzate tecniche minimo o nullo ecological rilevanza ^14-15 e oggi che questi studi sono ancora ampiamente citati. E 'ancora più allarmante notare che gli studi basati su dati di tossicità continuano ad essere pubblicati ^16-18. Il metodo di analisi biologico descritto è stato sviluppato alla fine del 1980 per fornire un approccio ecologicamente rilevante per gli ecologi marini chimiche per valutare le difese chimiche antipredatory. Il metodo richiede un modello predatore di assaggiare un estratto organico greggio da parte dell'organismo bersaglio ad una concentrazione naturale in un punto di vista nutrizionale analoga matrice alimentare, fornendo dati appetibilità che sono più ecologicamente significativo di dati sulla tossicità.

L'approccio generale per valutare l'attività antipredatory dei tessuti di organismi marini comprende quattro criteri importanti: (1) un appropriato predatore generalista deve essere utilizzato in saggi di alimentazione, (2) metaboliti organici di tutte le polarità devono essere esaustivo estratte dal tessuto del bersaglio organismo, (3) i metaboliti devono be mescolato in un alimento nutrizionalmente sperimentale appropriata alla stessa concentrazione volumetrica come trovato nell'organismo da cui sono stati estratti, e (4) il disegno sperimentale e approccio statistico devono fornire una metrica significativa per indicare relativa distastefulness.

La procedura descritta di seguito è stato progettato specificamente per valutare le difese chimiche antipredatory in Caraibi invertebrati marini. Impieghiamo il wrasse bluehead, Thalassoma bifasciatum, come un modello di pesce predatore, perché questa specie è comune in barriere coralline dei Caraibi ed è noto per degustare un vasto assortimento di invertebrati bentonici ^19. Tissue da parte dell'organismo bersaglio viene dapprima estratta, poi combinata con una miscela di cibo, e infine offerto ai gruppi di T. bifasciatum osservare se rifiutano i cibi estratto trattati. Dati del dosaggio con questo metodo hanno fornito importanti conoscenze sulla chimica di difesa degli organismi marini ^12,20-21, lstoria ife compromessi ^22-24, e la comunità ecologia ^25-26.

NOTA: Fase 3 del presente protocollo coinvolge soggetti animali vertebrati. La procedura è stata progettata in modo che gli animali ricevano il trattamento più umano possibile ed è stato approvato dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) presso la University of North Carolina Wilmington.

1) Estrazione del tessuto

1. Utilizzare tessuto che è nel suo stato naturale di idratazione e non spremuto, secchi-out o eccessivamente umido come questo altera la concentrazione volumetrica di metaboliti secondari. Tagliare o tagliare il tessuto in pezzi o fette che possono essere inseriti in un tubo da centrifuga da 50 ml. Nota: tessuto fresco può essere utilizzato in alcuni casi, ma spesso è meglio tagliare o tritare tessuti congelati, che non è soggetta a spremitura al taglio.
2. Aggiungere pezzi di tessuto a 30 ml di una miscela 1: 1 di diclorometano (DCM) e metanolo (MeOH) in una provetta da centrifuga graduata fino ad un volume finale di 40 ml è raggiunto. Assicurarsi di eseguire tutti i passaggi che comportano il trasferimento disolvente in una cappa aspirante con ventilazione adeguata.
3. Tappare la provetta e capovolgerla più volte, poi agitare più volte nel corso di un periodo di estrazione 4 ore. Nota: Durante questo periodo, l'acqua si combina con il MeOH e il risultante MeOH: fase acquosa si separa dalla fase DCM. Il tessuto è alternativamente esposto al DCM e MeOH: acqua come emulsione come i tubi sono agitati.
4. Trasferire l'estratto DCM in un pallone a fondo rotondo ed evaporare a secchezza su un evaporatore rotante utilizzando basse temperature (<40 ° C). Utilizzando solventi minimal, trasferire l'estratto secco di 20 ml di scintillazione flacone. Montare la fiala con un adattatore evaporatore rotante e di nuovo evaporare a secco in un evaporatore rotante con fuoco basso (<40 ° C).
   Nota: Il passo successivo richiede l'uso di uno strumento di compressione casalingo che possono essere assemblati avvitando i seguenti elementi in ordine sequenziale sull'estremità di un'asta filettata: (1) il dado (2) Rondella, e (3) dado cieco. La rondella deve o essere perforato omontata in modo che sia inferiore al diametro interno di un tubo da centrifuga da 50 ml.
5. Tornando al tubo da centrifuga graduato contenente tessuti e MeOH: estratto dall'acqua, premere il mezzo di estrazione di tessuto attraverso la compressione. Trasferire il MeOH: estratto acquoso allo stesso pallone a fondo tondo e memorizzare refrigerati (<10 ° C).
6. Aggiungere MeOH al tubo da centrifuga graduata finché il tessuto ora disidratato è sommerso per una seconda estrazione di 2 a 6 durata ore, poi trasferire la nuova MeOH estratto nel pallone a fondo tondo refrigerati contenente la MeOH: estratto acquoso. Se non vi è alcuna preoccupazione che il tessuto non è stato completamente estratto, ripetere l'estrazione MeOH 2 a 6 ore.
7. Asciugare la MeOH su un evaporatore rotante con fuoco basso (<40 ° C). Trasferire l'estratto acquoso rimanente dal pallone a fondo tondo nella fiala di scintillazione contenente l'estratto secco non polare, con un volume minimo di MeOH per risciacquare il pallone a fondo tondo.
8. Evaporate l'estratto acquoso di essiccazione, a fuoco basso (<40 ° C) su un concentratore a vuoto. La fiala di scintillazione ora contiene l'estratto grezzo organico secco totale di 10 ml di tessuto. Evacuare spazio di testa del flaconcino con N ₂ gas per prevenire l'ossidazione, sigillare ermeticamente e conservare congelato (-20 ° C).

2) Preparazione alimentare

1. Preparare calamari polvere manto liofilizzata.
   Nota: mantello Squid fornisce una fonte di alimentazione che è paragonabile a quella di altri invertebrati bentonici, e verrà utilizzato come ingrediente nelle sottofasi di 2.2.
   1. Anelli surgelati Scongelare del mantello calamari a deionizzata calda (DI) di acqua, poi purea in un frullatore ad alta velocità.
   2. Versate un sottile strato di purè calamari mantello su una teglia bassa e congelamento (-20 ° C), quindi rompere il foglio di congelato purea calamari a pezzetti per essere liofilizzato.
   3. Lyophilize la calamari congelati manto purea seguendo le modalità di funzionamento del freeze-essiccatore.
   4. Polverizzare i pezzi liofilizzate di calamari mantello purea in un frullatore ad alta velocità per formare una polvere.
   5. In una cappa aspirante, versare il mantello calamaro in polvere in una farina setaccio rotante e vagliare separare grossi pezzi di tessuto dalla polvere fine.
   6. Trasferire la multa in polvere manto calamari in un contenitore sigillato. Evacuare spazio di testa del contenitore con N ₂ gas per prevenire l'ossidazione e memorizzare congelati (-20 ° C).
2. Preparare l'impasto alimentare.
   Nota: Durante l'esecuzione di più test consecutivi, è pratico di preparare ~ 100 ml di miscela di cibo, ma questa ricetta può essere scalata a volumi più piccoli, se necessario.
   1. Combinare una miscela di 3 g di acido alginico e 5 g liofilizzata mantello polvere calamari con 100 ml di acqua deionizzata in un bicchiere da 150 ml. Mescolare energicamente con una microspatula per qualche minuto fino a quando la polvere è completamente idratata e la miscela è omogenea.
      Nota: Se si desidera, colorante alimentare può essere aggiunto a questo step: è facile aggiungere alla miscela colorante alimentare che genererà entrambe le miscele trattate e di controllo (mascherare il pigmento naturale dell'estratto nella miscela estratto trattati) anziché cercare di abbinare il colore della miscela dell'estratto trattati aggiungendo tingere alla miscela di controllo. Colorante alimentare verde o marrone è spesso desiderabile per mascherare eventuali pigmenti nell'estratto greggio.
   2. Caricare esattamente 10 ml di miscela di cibo in una siringa graduata. Fare attenzione ad evitare l'inclusione di bolle d'aria nel corso di questo processo.
   3. Rimuovere l'20 ml scintillazione flacone con estratto biologico greggio asciutto dal freezer. Aggiungere una o due gocce di MeOH, quindi mescolare l'estratto in una miscela omogenea con un microspatula.
   4. Espellere il caricata siringa da 10 ml di matrice alimentare in 20 ml di scintillazione fiala e mescolare con una microspatula per omogeneizzare la miscela alimentare estratto trattati.
      Nota: Può essere utile per espellere la siringa in incrementi più piccoli (cioè, espellere 2 ml e omogeneizzare, poi r.EPEAT fino tutti i 10 ml sono stati omogeneizzati).
3. Preparare il pellet di analisi.
   1. Caricare un volume molto piccolo della miscela dell'estratto (~ 1 ml) in una siringa, e immergere la punta della siringa in una soluzione di 0,25 M CaCl _2. Estrarre il contenuto della siringa per formare un lungo spaghetto-like.
   2. Dopo pochi minuti, togliere il filo indurito, tritarlo in 4 mm di lunghezza pellet su un tagliere di vetro con una lama di rasoio, poi sciacquare in acqua di mare.
   3. Ripetere i punti 2.3.1 e 2.3.2 senza includere l'estratto di tessuto per fare pellet di controllo. Assicurarsi di trattamento pellets di controllo con un volume equivalente di solvente (vedi aggiunta di MeOH al composto trattata nel passaggio 2.2.3) per controllare per aggiunta di solventi. Se un controllo negativo è desiderato per confermare che il pesce saggio può essere indotta a rinunciare alimentazione, aggiungere denatonium benzoato ad una concentrazione di 2 mg ml ^-1 al cibo miscela grezza ^27.

3) AppetibilitàBioassays

1. Eseguire test di alimentazione con il giallo-fase wrasse bluehead catturati, Thalassoma bifasciatum, tenuti in gruppi di tre in compartimenti opaco facciate di acquari di laboratorio.
2. Invia pellets alimentari da un bicchiere di acqua di mare con una pipetta di vetro con un bulbo di gomma. Nota: Potrebbero essere necessari alcuni giorni per addestrare i pesci per ricevere il cibo in questo modo. Uno stimolo condizionata (es pochi tocchi della pipetta sul vetro dell'acquario) che precede la consegna di cibo può essere utile per addestrare il pesce aspettarsi l'aggiunta di pellets alimentari.
3. Punteggio pellet. Si consideri un pellet accettato se prontamente consumato dai pesci. Si consideri un pellet respinta se non mangiato, dopo un minimo di tre tentativi da parte di uno o più pesci di prenderlo nella loro cavità orale, o se il pellet si avvicina e ignorato dopo un tentativo del genere.
4. Campioni di punteggio. Nota: La procedura di test è raffigurato come un diagramma di flusso in Figura 1 Gruppi di pesci che si rifiutano di mangiare.pellets di controllo in qualsiasi fase del protocollo non sono considerati ulteriormente. Ci sono due possibili risultati di una singola esecuzione del test: il campione viene accettato o respinto.
   1. Inizia con un pellet di controllo per confermare che il gruppo di pesci è cooperativa. Offrire un pellet trattata. Se i pesci accettano il pellet trattata, segnare il campione accettata. Se i pesci rifiutano il pellet trattato, offrire una successiva pellet di controllo per determinare se i pesci hanno cessato l'alimentazione. Se i pesci accettano la successiva pellet di controllo, segnare il campione respinta.
5. Replica. Ripetere la procedura di test con dieci gruppi indipendenti di pesce per ogni estratto.

4) Significato Valutazione

1. Valutare la significatività delle differenze di consumo di controllo vs pellet trattate con una versione modificata del test esatto di Fisher ^26. Modificare il test in modo che siano fissati i totali marginali per il controllo e pellet trattati, Trattandoli due campioni casuali. Nota: Questo fornisce p = 0,057 quando 7 pellet sono mangiati; quindi, ogni estratto è considerato deterrente se 6 o meno pellet sono mangiati, e appetibile se 7 o più pellet sono mangiati.
2. Per confrontare l'appetibilità relativa tra i gruppi di estratti, calcolare un numero medio di pellet consumato all'interno di ogni gruppo. Mantenere la soglia a 6 pellet così un gruppo di estratti repliche sono considerati deterrente se il numero medio di pellet consumato + errore standard (SE) ≤6. Nota: Nei risultati rappresentativi, l'assegnazione del gruppo è di specie, così replicano estratti provengono da individui distinti e la relativa appetibilità possono essere confrontati tra le specie.

Qui riportiamo i risultati di questo saggio biologico per sei specie di spugne caraibiche comuni (Figura 2). Questi dati sono stati inizialmente pubblicati nel 1995 da Pawlik et al. 12 e dimostrano la potenza di questo approccio per esaminare le differenze nelle strategie di difesa chimiche tra taxa concomitanti. I risultati sono stati riportati come un numero medio di pellet cibo mangiato + errore standard (SE) per ogni specie. Quasi nessun pellet sono stati consumati in test con estratti organici grezzi da clathrodes Agelas, Amphimedon compressa, e cauliformis Aplysina. Al contrario, pellet con estratti di Callyspongia vaginalis, Geodia gibberosa, e Micale laevis sono stati prontamente consumati nel test 12. Meno di sei pellet sono stati consumati per i primi tre specie, così sono stati considerati in modo significativo deterrente. Al contrario, il secondo tre specie non erano significativamente differenti dai controlli, ed eranoconsiderato appetibile.

Figura 1:. Schematica della procedura di saggio In tutte le fasi, il rifiuto di un pellet di controllo indica che questo insieme di pesce test sono poco collaborativo o sazi e non può essere utilizzato ulteriormente. Il protocollo inizia offrendo ogni set di pesci un pellet di controllo seguite da un pellet trattata. Poi, se il pellet trattata è accettato il campione viene segnato come accettata. Se il pellet trattato viene respinto, ma il successivo controllo del pellet è accettato, il campione viene segnato come rifiutata.

Figura 2: Consumo per Thalassoma bifasciatum di pellet alimentare (media + SE) che contiene estratti organici grezzi di spugne a concentrazioni naturali, segnalati nel 1995 da Pawlik 12 pesci consumati tutti i 10 pellets di controllo in tutti i casi. Dopo ciascuna specie, viene specificato il numero di campioni replicati (ogni replica dall'estrazione separata di un campione geograficamente distinta di tessuto spugna). Per ogni test individuale, gli estratti sono stati considerati deterrente se il numero di pellet consumati è inferiore o uguale a 6 (p = 0,057, modificate test esatto di Fisher), come indicato dalla linea tratteggiata nel grafico.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.