Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare l'attività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare l'attività antipredatoria dei metaboliti secondari provenienti dai tessuti degli organismi marini. Ciao, sono il Dr.Joseph Pollock dell'Università della Carolina del Nord a Wilmington, e sono affiancato dallo studente laureato Michael Marty, che è stato il team leader nella realizzazione di questo video sull'esecuzione di biosaggi per testare le difese chimiche nei tessuti degli organismi marini. Abbiamo iniziato a sviluppare i metodi che state per vedere alla fine degli anni '80.

A quel tempo, i chimici dei prodotti naturali assegnavano ruoli ecologici ai metaboliti secondari senza alcuna prova sperimentale. Nel frattempo, gli ecologi estrapolavano ruoli difensivi da saggi di tossicità che non avevano alcuna rilevanza ecologica. Qui presentiamo un approccio progettato per valutare l'attività antipredatoria dei metaboliti secondari provenienti dai tessuti degli organismi marini.

Questo approccio soddisfa quattro importanti criteri per i biotest di alimentazione. Uno, usiamo un predatore generalista appropriato. In secondo luogo, estraiamo in modo esaustivo i metaboliti organici di tutte le polarità dai tessuti.

Tre, abbiamo messo quei metaboliti in un alimento sperimentale alla stessa concentrazione volumetrica che si trova nell'organismo. E quattro, il nostro disegno sperimentale e l'approccio statistico forniscono una metrica significativa per indicare il relativo disgusto. In questi esperimenti di alimentazione, utilizziamo il thoma testa blu di fossum, un modello di pesce predatore appropriato per saggi utilizzando tessuti di invertebrati marini caraibici perché questa specie ittica è comune sulle barriere coralline dei Caraibi ed è nota per campionare un vasto assortimento di invertebrati bentonici.

Ora Michael descriverà il protocollo in dettaglio. Innanzitutto, il tessuto deve essere estratto. Aggiungere una miscela uno-a-uno di dicloruro, metano e metanolo a una provetta da centrifuga graduata fino a un volume finale di 30 millilitri.

Quindi taglia pezzi di tessuto dal tuo organismo bersaglio. Questo può essere fatto con fazzoletto fresco o congelato. Lavoriamo con le spugne, quindi questa dimostrazione cinematografica presenterà la spugna arancione per le orecchie di elefante, alus, plet roadies.

Potrebbe essere necessario tagliare pezzi di tessuto molto piccoli per ottenere il volume giusto. Utilizzando lo spostamento volumetrico, è possibile estrarre esattamente 10 millilitri di tessuto, tappare il tubo e capovolgerlo, quindi agitare per quattro ore durante questo periodo, l'acqua si combina con il metanolo e la fase acquosa di metanolo risultante si separa dalla fase di clorometano. Il tessuto viene esposto alternativamente a ciascun mezzo di estrazione mentre le provette vengono agitate.

Dopo questo periodo di estrazione, saranno evidenti due fasi distinte. La fase polare del metanolo e dell'acqua si troverà sopra la fase non polare del clorometano utilizzando un trasferimento di pipette passanti. L'estratto di clorometano dalla provetta da centrifuga graduata in un pallone a fondo tondo, la provetta da centrifuga graduata deve essere conservata in frigorifero.

Per i passaggi successivi, collegare il pallone a fondo tondo a un evaporatore rotante per tutti i passaggi dell'evaporatore rotante. Assicurarsi che la temperatura del bagnomaria rimanga inferiore a 40 gradi Celsius. Seguendo le procedure operative di base per l'evaporatore rotante, essiccare il clorometano nel pallone a fondo tondo e risospendere l'estratto secco non polare utilizzando una quantità molto piccola di clorometano.

Un po' di agitazione o vortice può essere utile per rimuovere il materiale secco dai lati del pallone a fondo tondo. Quindi trasferire l'estratto di clorometano dal pallone a fondo tondo in una fiala di scintillazione da 20 millilitri. Invece di posizionare il tappo sulla fiala di scintillazione, collegare un adattatore per evaporatore rotante alla fiala di scintillazione e di nuovo evaporare a secco Su un evaporatore rotante, la fiala di scintillazione con l'estratto secco non polare può essere conservata in frigorifero durante i passaggi successivi.

Tornando alla provetta da centrifuga graduata che contiene il tessuto e l'estratto acquoso di metanolo, utilizzeremo uno strumento fatto in casa che spreme il mezzo di estrazione dal tessuto attraverso la compressione, comprimendo il tessuto. Quindi trasferire l'estratto di acqua di metanolo nel pallone a fondo rotondo e conservare in frigorifero in frigorifero. Aggiungere metanolo alla provetta da centrifuga graduata fino a quando il tessuto non è immerso per una seconda estrazione della durata da due a sei ore.

Una volta completata la seconda estrazione del metanolo, rimuovere il pallone a fondo tondo raffreddato dal frigorifero, comprimere il contenuto della provetta da centrifuga graduata e trasferire questo nuovo estratto di metanolo nel pallone a fondo tondo originale, che contiene l'estratto acquoso di metanolo di prima. A questo punto, se si teme che il tessuto non sia stato completamente estratto, la fase di estrazione del metanolo da due a sei ore può essere ripetuta. Collegare il pallone a fondo tondo a un evaporatore rotante e asciugare il metanolo come prima.

Ricordarsi di mantenere la temperatura del bagnomaria al di sotto dei 40 gradi Celsius. Il pallone a fondo tondo conterrà un estratto acquoso che dovrà essere combinato con l'estratto secco non polare nella fiala di scintillazione da 20 millilitri. Pertanto, trasferire il contenuto del pallone a fondo tondo nella fiala di scintillazione da 20 millilitri.

Se necessario, sciacquare il pallone a fondo tondo con una piccola quantità di metanolo per raccogliere tutto l'estratto rimanente. La fiala di scintillazione contiene ora l'estratto secco non polare e l'estratto polare. Tuttavia, l'estratto polare è sospeso in un piccolo volume di liquido.

Utilizzando un concentratore sottovuoto a fuoco basso, far evaporare l'estratto acquoso fino a secchezza. La fiala di scintillazione contiene ora un estratto organico secco e grezzo di 10 millilitri di tessuto, soffiare la fiala con azoto gassoso colorante e conservare in congelatore a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Per testare l'appetibilità di questi estratti tissutali, questi devono prima essere ricostituiti in una matrice alimentare che sia nutrizionalmente paragonabile all'organismo bersaglio.

Gli anelli di mantello di calamaro sono una fonte proteica appropriata per i saggi biologici dei tessuti degli invertebrati e possono essere facilmente preparati in una polvere liofilizzata. Per iniziare questo biotest, posizionare gli anelli congelati del mantello di calamaro in acqua calda deionizzata. Una volta scongelato, decantare un po' d'acqua e versare gli anelli in un frullatore.

Frullare accuratamente alla massima potenza fino a quando il mantello di calamaro diventa un liquido viscoso. Aggiungere acqua se il materiale è troppo denso per essere miscelato. Versare uno strato sottile di mantello di calamari liquefatto su una teglia poco profonda e stenderlo uniformemente.

Metti la teglia in congelatore a meno 20 gradi Celsius. La sfoglia di calamari surgelati deve essere spezzata in pezzi più piccoli per facilitare il processo di liofilizzazione. I pezzi più piccoli sono migliori perché si asciugheranno più velocemente.

Nel liofilizzatore. Mettere i pezzi di calamaro congelati rotti nella camera e seguire le procedure operative del liofilizzatore. Una volta liofilizzati, i pezzi di calamaro devono essere polverizzati.

Questo può essere ottenuto con un frullatore. Mettere i pezzi di calamaro essiccati nel frullatore e far scorrere alla massima potenza fino a quando il materiale appare come una polvere uniforme. Il passo successivo dovrebbe essere condotto in una cappa aspirante per ridurre l'inalazione di polvere di calamari particolato.

Versare la polvere di calamari liofilizzati in un setaccio rotante. Tenere un contenitore sotto il setaccio per raccogliere la polvere che passa attraverso il setaccio. Ruotare la manovella per setacciare il materiale di calamari liofilizzati.

Grandi filamenti di tessuto connettivo che non sono stati adeguatamente miscelati nei passaggi precedenti verranno trattenuti nel setaccio producendo una polvere più fine utilizzando un imbuto se necessario, trasferire la polvere di calamaro liofilizzato in un contenitore sigillabile, soffiare con azoto gassoso colorante e conservare congelato a meno 20 gradi Celsius. Dopo aver preparato la polvere di mantello di calamaro liofilizzato, siamo ora pronti per preparare un lotto della miscela alimentare del test. Quando si eseguono più saggi consecutivi nello stesso giorno, è pratico preparare una grande quantità di miscela alimentare.

Qui dimostriamo il processo di preparazione per una miscela di 100 millilitri di volume, utilizzando una massa di siero di latte pulita composta da tre grammi di acido alginico e cinque grammi di polvere di mantello di calamari liofilizzati. Mettere questi ingredienti secchi in un becher da 150 millilitri prima di aggiungere l'acqua. Mescola delicatamente gli ingredienti secchi con una spatola micros per aiutarli a mescolarli insieme.

Aggiungere 100 millilitri di acqua deionizzata e mescolare energicamente. Potrebbero essere necessari alcuni minuti per idratare completamente la polvere. Assicurati di avere una miscela omogenea prima di superare questo passaggio.

Se scegli di tingere la matrice alimentare di un colore coerente, aggiungi il colorante colorato in questo passaggio. Caricare una siringa graduata con esattamente 10 millilitri di miscela alimentare. In questa fase, la precisione volumetrica è fondamentale, quindi prestare la massima attenzione per evitare l'inclusione di bolle d'aria.

Estrarre dal congelatore la fiala di scintillazione da 20 millilitri con estratto organico grezzo secco e aggiungere una o due gocce di metanolo. Non aggiungere troppo metanolo. Ciò impedirà l'installazione della matrice alimentare.

Utilizzando una spatola micros e un solvente minimo, risospendere l'estratto in una miscela omogenea. Assicurati di raschiare i lati della fiala per assicurarti che l'intero estratto sia risospeso. Espellere la siringa con 10 millilitri di matrice alimentare nella fiala di scintillazione da 20 millilitri con estratto omogeneizzato risospeso.

Mescolate questo composto con la spatola micros fino ad ottenere un composto omogeneo. Caricare un volume molto piccolo della miscela di estratto. Un millilitro è sufficiente in una siringa.

Immergere la punta della siringa in una soluzione di cloruro di calcio 0,25 molari ed espellere il contenuto della siringa per formare un lungo filamento simile a uno spaghetto. Il filo si indurirà in questa soluzione. Dopo un paio di minuti, rimuovete il filo indurito e stendetelo su un tagliere di vetro.

Usa una lama di rasoio per tagliare il filo in palline lunghe quattro millimetri. Raccogliere i pellet estratti trattati e sciacquarli in acqua di mare. Per preparare i pellet di controllo.

Seguire la stessa procedura senza l'aggiunta di alcun estratto tissutale. L'aggiunta di colorante alimentare può essere necessaria per abbinare il colore del controllo e dei pellet trattati. Per preparare un controllo negativo che i pesci si rifiuteranno sicuramente di mangiare.

Aggiungere detonazione e polvere di benzoato alla miscela di cibo crudo a una concentrazione di due milligrammi per millilitro come descritto da Miller e Pollock. 2013, I saggi di alimentazione vengono eseguiti con la testa blu in fase gialla catturata in natura I RAs thala dei pesci fum sono tenuti in gruppi di tre in compartimenti opachi dell'acquario da laboratorio. Un utensile appropriato per la consegna di pellet alimentari è una pipetta di vetro con un bulbo di gomma.

Un pellet è considerato accettato se prontamente consumato dai pesci. Un pellet è considerato rifiutato, se non mangiato dopo un minimo di tre tentativi da parte di uno o più pesci di prenderlo nella loro cavità orale. O se il pellet viene avvicinato e ignorato dopo uno di questi tentativi.

I gruppi di pesci che non collaborano e che rifiutano di mangiare pellet di controllo non devono essere presi in considerazione nei saggi. Questo diagramma di flusso dimostra che la procedura di analisi in tutti i casi inizia con un pellet di controllo per confermare che il gruppo di pesci è cooperativo. Offri un pellet trattato.

Se i pesci accettano il pellet trattato, questo campione viene valutato come accettato. Se i pesci rifiutano il pellet trattato, deve essere offerto un controllo successivo per confermare se i pesci hanno smesso di nutrirsi. Se il pesce accetta il successivo pellet di controllo, il campione viene valutato come rifiutato.

Ogni campione deve essere analizzato con 10 gruppi indipendenti di pesci. Di seguito è riportato un esempio di esecuzione di questo test di alimentazione. In primo luogo, viene offerto un pellet di controllo, il pesce accetta il pellet di controllo.

In secondo luogo, viene offerto un pellet trattato. In questo caso, il pesce rifiuta il pellet trattato. Pertanto, è necessario offrire un successivo pellet di controllo.

I pesci accettano il controllo successivo e il campione può essere classificato come rifiutato. Ogni campione deve essere analizzato con 10 gruppi indipendenti di pesci. L'importanza delle differenze nel consumo di pellet di controllo rispetto a quelli trattati dovrebbe essere valutata con una versione modificata del test esatto di Fisher presentato da low e Pollock 2014.

Il test viene modificato in modo da fissare i totali marginali per il pellet di controllo e per quelli trattati, trattandoli entrambi come campioni casuali. Ciò fornisce un valore P pari a 0,057 quando vengono mangiati sette pellet. Quindi, qualsiasi estratto è considerato deterrente se vengono mangiati sei o meno pellet e appetibili.

Se si mangiano sette o più pellet. Quando si confronta l'appetibilità tra gruppi di estratti, si dovrebbe utilizzare il numero medio di pellet consumati, come sarà mostrato nei risultati rappresentativi. Qui riportiamo i risultati di questo biotest per sei specie di spugne caraibiche comuni.

Questi dati sono stati inizialmente pubblicati da Pollock et al 1995 e dimostrano il potere di questo approccio nel chiarire le differenze nelle strategie di difesa chimica tra taxa co-occorrenti. Ogni categoria sull'asse Y rappresenta estratti da una singola specie di spugna. Diversi individui di ogni specie sono stati campionati, estratti e testati, indicati dal numero tra parentesi che segue il nome della specie.

I risultati sono riportati come numero medio di pellet di cibo mangiati, più l'errore standard per ogni specie. Quasi nessun pellet è stato mangiato nei saggi con estratto organico grezzo da alus, pleth, pheon, compressore e licina chiamato foris. Al contrario, pellet realizzati con estratto di Cali spugnoso di Vais.

Geo Osa e Michel lavis sono stati prontamente consumati nel test. Per le prime tre specie sono stati mangiati meno di sei pellet, quindi possono essere considerati significativamente deterrenti. Al contrario, le seconde tre specie non erano significativamente diverse dai controlli e possono essere considerate appetibili.

I metodi appena dimostrati forniscono un potente approccio allo studio delle difese chimiche antipredatorie in tandem con esperimenti e indagini manipolative sul campo. I risultati di questi biotest hanno aiutato il mio gruppo di ricerca a comprendere i fattori che controllano la distribuzione e l'abbondanza di invertebrati marini sulle barriere coralline dei Caraibi. È importante sottolineare che questo metodo soddisfa la necessità di rilevanza ecologica nell'ecologia chimica al di là dell'ecologia chimica.

I risultati di questi biosaggi possono informare le indagini in diversi campi di indagine, tra cui la farmacologia, la biotecnologia e l'ecologia evolutiva.