Name: Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare lattività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: Scopri un bioassay con pesce predatore per valutare l'attività antipredatoria di metaboliti secondari dai tessuti di organismi marini. Questo metodo fornisce evidenze sperimentali sui ruoli ecologici delle difese chimiche.

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Ringraziamo James Maeda e Aaron Cooke per l'assistenza con le riprese e il montaggio di questo video. Il finanziamento è stato fornito dalla National Science Foundation (OCE-0550468, 1029515).

NOTA: Fase 3 del presente protocollo coinvolge soggetti animali vertebrati. La procedura è stata progettata in modo che gli animali ricevano il trattamento più umano possibile ed è stato approvato dalla cura e l&#39;uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) presso la University of North Carolina Wilmington. 1) Estrazione del tessuto <ol><li> Utilizzare tessuto che è nel suo stato naturale di idratazione e non spremuto, secchi-out o eccessivamente umido come questo altera la concentrazione volumetrica di metaboliti secondari. Tagliare o tagliare il tessuto in pezzi o fette che possono essere inseriti in un tubo da centrifuga da 50 ml. Nota: tessuto fresco può essere utilizzato in alcuni casi, ma spesso è meglio tagliare o tritare tessuti congelati, che non è soggetta a spremitura al taglio. </li><li> Aggiungere pezzi di tessuto a 30 ml di una miscela 1: 1 di diclorometano (DCM) e metanolo (MeOH) in una provetta da centrifuga graduata fino ad un volume finale di 40 ml è raggiunto. Assicurarsi di eseguire tutti i passaggi che comportano il trasferimento disolvente in una cappa aspirante con ventilazione adeguata. </li><li> Tappare la provetta e capovolgerla più volte, poi agitare più volte nel corso di un periodo di estrazione 4 ore. Nota: Durante questo periodo, l&#39;acqua si combina con il MeOH e il risultante MeOH: fase acquosa si separa dalla fase DCM. Il tessuto è alternativamente esposto al DCM e MeOH: acqua come emulsione come i tubi sono agitati. </li><li> Trasferire l&#39;estratto DCM in un pallone a fondo rotondo ed evaporare a secchezza su un evaporatore rotante utilizzando basse temperature (&lt;40 ° C). Utilizzando solventi minimal, trasferire l&#39;estratto secco di 20 ml di scintillazione flacone. Montare la fiala con un adattatore evaporatore rotante e di nuovo evaporare a secco in un evaporatore rotante con fuoco basso (&lt;40 ° C). Nota: Il passo successivo richiede l&#39;uso di uno strumento di compressione casalingo che possono essere assemblati avvitando i seguenti elementi in ordine sequenziale sull&#39;estremità di un&#39;asta filettata: (1) il dado (2) Rondella, e (3) dado cieco. La rondella deve o essere perforato omontata in modo che sia inferiore al diametro interno di un tubo da centrifuga da 50 ml. </li><li> Tornando al tubo da centrifuga graduato contenente tessuti e MeOH: estratto dall&#39;acqua, premere il mezzo di estrazione di tessuto attraverso la compressione. Trasferire il MeOH: estratto acquoso allo stesso pallone a fondo tondo e memorizzare refrigerati (&lt;10 ° C). </li><li> Aggiungere MeOH al tubo da centrifuga graduata finché il tessuto ora disidratato è sommerso per una seconda estrazione di 2 a 6 durata ore, poi trasferire la nuova MeOH estratto nel pallone a fondo tondo refrigerati contenente la MeOH: estratto acquoso. Se non vi è alcuna preoccupazione che il tessuto non è stato completamente estratto, ripetere l&#39;estrazione MeOH 2 a 6 ore. </li><li> Asciugare la MeOH su un evaporatore rotante con fuoco basso (&lt;40 ° C). Trasferire l&#39;estratto acquoso rimanente dal pallone a fondo tondo nella fiala di scintillazione contenente l&#39;estratto secco non polare, con un volume minimo di MeOH per risciacquare il pallone a fondo tondo. </li><li> Evaporate l&#39;estratto acquoso di essiccazione, a fuoco basso (&lt;40 ° C) su un concentratore a vuoto. La fiala di scintillazione ora contiene l&#39;estratto grezzo organico secco totale di 10 ml di tessuto. Evacuare spazio di testa del flaconcino con N 2 gas per prevenire l&#39;ossidazione, sigillare ermeticamente e conservare congelato (-20 ° C). </li></ol> 2) Preparazione alimentare <ol><li> Preparare calamari polvere manto liofilizzata. Nota: mantello Squid fornisce una fonte di alimentazione che è paragonabile a quella di altri invertebrati bentonici, e verrà utilizzato come ingrediente nelle sottofasi di 2.2. <ol><li> Anelli surgelati Scongelare del mantello calamari a deionizzata calda (DI) di acqua, poi purea in un frullatore ad alta velocità. </li><li> Versate un sottile strato di purè calamari mantello su una teglia bassa e congelamento (-20 ° C), quindi rompere il foglio di congelato purea calamari a pezzetti per essere liofilizzato. </li><li> Lyophilize la calamari congelati manto purea seguendo le modalità di funzionamento del freeze-essiccatore. </li><li> Polverizzare i pezzi liofilizzate di calamari mantello purea in un frullatore ad alta velocità per formare una polvere. </li><li> In una cappa aspirante, versare il mantello calamaro in polvere in una farina setaccio rotante e vagliare separare grossi pezzi di tessuto dalla polvere fine. </li><li> Trasferire la multa in polvere manto calamari in un contenitore sigillato. Evacuare spazio di testa del contenitore con N 2 gas per prevenire l&#39;ossidazione e memorizzare congelati (-20 ° C). </li></ol></li><li> Preparare l&#39;impasto alimentare. Nota: Durante l&#39;esecuzione di più test consecutivi, è pratico di preparare ~ 100 ml di miscela di cibo, ma questa ricetta può essere scalata a volumi più piccoli, se necessario. <ol><li> Combinare una miscela di 3 g di acido alginico e 5 g liofilizzata mantello polvere calamari con 100 ml di acqua deionizzata in un bicchiere da 150 ml. Mescolare energicamente con una microspatula per qualche minuto fino a quando la polvere è completamente idratata e la miscela è omogenea. Nota: Se si desidera, colorante alimentare può essere aggiunto a questo step: è facile aggiungere alla miscela colorante alimentare che genererà entrambe le miscele trattate e di controllo (mascherare il pigmento naturale dell&#39;estratto nella miscela estratto trattati) anziché cercare di abbinare il colore della miscela dell&#39;estratto trattati aggiungendo tingere alla miscela di controllo. Colorante alimentare verde o marrone è spesso desiderabile per mascherare eventuali pigmenti nell&#39;estratto greggio. </li><li> Caricare esattamente 10 ml di miscela di cibo in una siringa graduata. Fare attenzione ad evitare l&#39;inclusione di bolle d&#39;aria nel corso di questo processo. </li><li> Rimuovere l&#39;20 ml scintillazione flacone con estratto biologico greggio asciutto dal freezer. Aggiungere una o due gocce di MeOH, quindi mescolare l&#39;estratto in una miscela omogenea con un microspatula. </li><li> Espellere il caricata siringa da 10 ml di matrice alimentare in 20 ml di scintillazione fiala e mescolare con una microspatula per omogeneizzare la miscela alimentare estratto trattati. Nota: Può essere utile per espellere la siringa in incrementi più piccoli (cioè, espellere 2 ml e omogeneizzare, poi r.EPEAT fino tutti i 10 ml sono stati omogeneizzati). </li></ol></li><li> Preparare il pellet di analisi. <ol><li> Caricare un volume molto piccolo della miscela dell&#39;estratto (~ 1 ml) in una siringa, e immergere la punta della siringa in una soluzione di 0,25 M CaCl 2. Estrarre il contenuto della siringa per formare un lungo spaghetto-like. </li><li> Dopo pochi minuti, togliere il filo indurito, tritarlo in 4 mm di lunghezza pellet su un tagliere di vetro con una lama di rasoio, poi sciacquare in acqua di mare. </li><li> Ripetere i punti 2.3.1 e 2.3.2 senza includere l&#39;estratto di tessuto per fare pellet di controllo. Assicurarsi di trattamento pellets di controllo con un volume equivalente di solvente (vedi aggiunta di MeOH al composto trattata nel passaggio 2.2.3) per controllare per aggiunta di solventi. Se un controllo negativo è desiderato per confermare che il pesce saggio può essere indotta a rinunciare alimentazione, aggiungere denatonium benzoato ad una concentrazione di 2 mg ml -1 al cibo miscela grezza 27. </li></ol></li></ol> 3) AppetibilitàBioassays <ol><li> Eseguire test di alimentazione con il giallo-fase wrasse bluehead catturati, Thalassoma bifasciatum, tenuti in gruppi di tre in compartimenti opaco facciate di acquari di laboratorio. </li><li> Invia pellets alimentari da un bicchiere di acqua di mare con una pipetta di vetro con un bulbo di gomma. Nota: Potrebbero essere necessari alcuni giorni per addestrare i pesci per ricevere il cibo in questo modo. Uno stimolo condizionata (es pochi tocchi della pipetta sul vetro dell&#39;acquario) che precede la consegna di cibo può essere utile per addestrare il pesce aspettarsi l&#39;aggiunta di pellets alimentari. </li><li> Punteggio pellet. Si consideri un pellet accettato se prontamente consumato dai pesci. Si consideri un pellet respinta se non mangiato, dopo un minimo di tre tentativi da parte di uno o più pesci di prenderlo nella loro cavità orale, o se il pellet si avvicina e ignorato dopo un tentativo del genere. </li><li> Campioni di punteggio. Nota: La procedura di test è raffigurato come un diagramma di flusso in Figura 1 Gruppi di pesci che si rifiutano di mangiare.pellets di controllo in qualsiasi fase del protocollo non sono considerati ulteriormente. Ci sono due possibili risultati di una singola esecuzione del test: il campione viene accettato o respinto. <ol><li> Inizia con un pellet di controllo per confermare che il gruppo di pesci è cooperativa. Offrire un pellet trattata. Se i pesci accettano il pellet trattata, segnare il campione accettata. Se i pesci rifiutano il pellet trattato, offrire una successiva pellet di controllo per determinare se i pesci hanno cessato l&#39;alimentazione. Se i pesci accettano la successiva pellet di controllo, segnare il campione respinta. </li></ol></li><li> Replica. Ripetere la procedura di test con dieci gruppi indipendenti di pesce per ogni estratto. </li></ol> 4) Significato Valutazione <ol><li> Valutare la significatività delle differenze di consumo di controllo vs pellet trattate con una versione modificata del test esatto di Fisher 26. Modificare il test in modo che siano fissati i totali marginali per il controllo e pellet trattati, Trattandoli due campioni casuali. Nota: Questo fornisce p = 0,057 quando 7 pellet sono mangiati; quindi, ogni estratto è considerato deterrente se 6 o meno pellet sono mangiati, e appetibile se 7 o più pellet sono mangiati. </li><li> Per confrontare l&#39;appetibilità relativa tra i gruppi di estratti, calcolare un numero medio di pellet consumato all&#39;interno di ogni gruppo. Mantenere la soglia a 6 pellet così un gruppo di estratti repliche sono considerati deterrente se il numero medio di pellet consumato + errore standard (SE) ≤6. Nota: Nei risultati rappresentativi, l&#39;assegnazione del gruppo è di specie, così replicano estratti provengono da individui distinti e la relativa appetibilità possono essere confrontati tra le specie. </li></ol>

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<li>Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antifeedant+triterpene+glycosides+from+the+Caribbean+sponge+Erylus+Formosus%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Letters%22%5BJournal%5D)">New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus.</a> Natural Product Letters. 15 (4), 275-285 (2001).</li>
<li>Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+the+odor+from+sponges+of+the+genus+Ircinia+protect+them+from+fish+predators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators.</a> Journal of Chemical Ecology. 28 (6), 1103-1115 (2002).</li>
<li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defenses+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+I.+Assays+with+hermit+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).</li>
<li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+II.+Assays+with+sea+stars%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).</li>
<li>Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-predatory+defenses+of+Red+Sea+and+Caribbean+sponges.+I.+Chemical+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense.</a> Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).</li>
<li>Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+for+defensive+synergy+in+Caribbean+sponges%3A+Bad+taste+or+glass+spicules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322 (1), 67(2005).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La procedura qui descritta prevede un protocollo di laboratorio relativamente semplice, ecologicamente rilevanti per valutare le difese chimiche antipredatory negli organismi marini. Qui passiamo in rassegna i criteri importanti che sono soddisfatte da questo insieme di metodi: (1) appropriata predatore. Questa analisi alimentare impiega il wrasse bluehead, Thalassoma bifasciatum, uno dei pesci più abbondanti sulle barriere coralline in tutti i Caraibi. Il bluehead è un car...

Ecologia chimica sviluppata attraverso la collaborazione di chimici ed ecologisti. Mentre la sotto-disciplina di terrestre ecologia chimica è stato intorno per qualche tempo, quello di ecologia chimica marina è solo pochi decenni vecchio, ma ha fornito importanti conoscenze sulla ecologia e comunità la struttura evolutiva degli organismi marini 1-8. Sfruttando le tecnologie emergenti di immersioni subacquee e di spettroscopia NMR, i chimici organici rapidamente generato un gran numero di pubblicazioni che descrivono nuovi metaboliti bentoniche invertebrati e alghe marine negli anni 1970 e 1980 9. Supponendo che metaboliti secondari devono servire a qualcosa, molte di queste pubblicazioni ascritti ecologicamente importanti proprietà a nuovi composti senza prove empiriche. Nello stesso tempo, gli ecologisti sono stati anche approfittando dell&#39;avvento di immersioni subacquee e descrivere le distribuzioni e abbondanze di animali bentonici e piante precedentemente noti from metodi di campionamento relativamente inefficaci come il dragaggio. L&#39;assunzione di questi ricercatori è che qualsiasi cosa sessili e corpo molle devono essere difesi chimicamente per evitare il consumo da parte di predatori 10. Nel tentativo di introdurre l&#39;empirismo a quello che era il lavoro altrimenti descrittivo sulle specie abbondanze, alcuni ecologisti hanno cominciato estrapolando difese chimiche da saggi di tossicità 11. La maggior parte dei test di tossicità l&#39;esposizione di pesci interi o di altri organismi a sospensioni acquose di estratti organici grezzi di tessuti invertebrati, con successiva determinazione delle concentrazioni in massa a secco di estratti responsabili dell&#39;uccisione metà gli organismi di analisi. Tuttavia, i saggi di tossicità non emulare il modo in cui i potenziali predatori percepiscono preda in condizioni naturali, e gli studi successivi hanno trovato alcuna relazione tra la tossicità e l&#39;appetibilità 12-13. E &#39;sorprendente che le pubblicazioni su riviste prestigiose utilizzate tecniche minimo o nullo ecological rilevanza 14-15 e oggi che questi studi sono ancora ampiamente citati. E &#39;ancora più allarmante notare che gli studi basati su dati di tossicità continuano ad essere pubblicati 16-18. Il metodo di analisi biologico descritto è stato sviluppato alla fine del 1980 per fornire un approccio ecologicamente rilevante per gli ecologi marini chimiche per valutare le difese chimiche antipredatory. Il metodo richiede un modello predatore di assaggiare un estratto organico greggio da parte dell&#39;organismo bersaglio ad una concentrazione naturale in un punto di vista nutrizionale analoga matrice alimentare, fornendo dati appetibilità che sono più ecologicamente significativo di dati sulla tossicità. L&#39;approccio generale per valutare l&#39;attività antipredatory dei tessuti di organismi marini comprende quattro criteri importanti: (1) un appropriato predatore generalista deve essere utilizzato in saggi di alimentazione, (2) metaboliti organici di tutte le polarità devono essere esaustivo estratte dal tessuto del bersaglio organismo, (3) i metaboliti devono be mescolato in un alimento nutrizionalmente sperimentale appropriata alla stessa concentrazione volumetrica come trovato nell&#39;organismo da cui sono stati estratti, e (4) il disegno sperimentale e approccio statistico devono fornire una metrica significativa per indicare relativa distastefulness. La procedura descritta di seguito è stato progettato specificamente per valutare le difese chimiche antipredatory in Caraibi invertebrati marini. Impieghiamo il wrasse bluehead, Thalassoma bifasciatum, come un modello di pesce predatore, perché questa specie è comune in barriere coralline dei Caraibi ed è noto per degustare un vasto assortimento di invertebrati bentonici 19. Tissue da parte dell&#39;organismo bersaglio viene dapprima estratta, poi combinata con una miscela di cibo, e infine offerto ai gruppi di T. bifasciatum osservare se rifiutano i cibi estratto trattati. Dati del dosaggio con questo metodo hanno fornito importanti conoscenze sulla chimica di difesa degli organismi marini 12,20-21, lstoria ife compromessi 22-24, e la comunità ecologia 25-26.

<table><tbody><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A41220</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>Cryocool Fluido termovettore</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-548-146</td><td>Per concentratore sottovuoto</td></tr><tr><td>Acido alginico Sale sodico Alta viscosità</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td>154723</tr><tr><td>Anelli mantello calamaro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Può essere acquistato al supermercato</td></tr><tr><td>Denatonium benzoato</td><td>Aldrich</td><td>D5765</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga graduata da 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fiala a scintillazione da 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Lampadine in gomma per pipette Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Lampadine rosse per erogazione pellet</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-27</td><td></td></tr><tr><td>Pallone a fondo tondo da 250 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-067E</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per fiala a scintillazione per rotavap</td><td>Fisher Scientific</td><td>K747130-1324</td><td></td></tr><tr><td>Weightboats</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>Microspatola</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>Siringa graduata da 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-53</td><td></td></tr><tr><td>Siringa graduata da 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17302</td><td></td></tr></tbody></table>

un pesce-alimentare laboratorio bioassay per valutare l&#39;attività di antipredatory secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

L'ecologia chimica marina è una disciplina giovane, nata dalla collaborazione di chimici ed ecologi marini negli anni '80 con l'obiettivo di esaminare le funzioni ecologiche dei metaboliti secondari provenienti dai tessuti degli organismi marini. Il risultato è stato una progressione di protocolli che hanno sempre più affinato la rilevanza ecologica dell'approccio sperimentale. Qui presentiamo la versione più aggiornata di un biotest di laboratorio per l'alimentazione dei pesci che consente ai ricercatori di valutare l'attività antipredatoria dei metaboliti secondari dei tessuti degli organismi marini. I metaboliti organici di tutte le polarità sono estratti in modo esaustivo dal tessuto dell'organismo bersaglio e ricostituiti a concentrazioni naturali in una matrice alimentare appropriata dal punto di vista nutrizionale. I pellet alimentari sperimentali vengono presentati a un predatore generalista in saggi di alimentazione di laboratorio per valutare l'attività antipredatoria dell'estratto. La procedura qui descritta utilizza il testa blu, Thalassoma bifasciatum, per testare l'appetibilità degli invertebrati marini dei Caraibi; Tuttavia, il design può essere facilmente adattato ad altri sistemi. I risultati ottenuti utilizzando questo test di laboratorio sono un importante preludio agli esperimenti sul campo che si basano sulle risposte alimentari di un gruppo completo di potenziali predatori. Inoltre, questo biotest può essere utilizzato per dirigere l'isolamento di metaboliti deterrenti per l'alimentazione attraverso il frazionamento guidato da biodosaggio. Questo biotest sull'alimentazione ha migliorato la nostra comprensione dei fattori che controllano la distribuzione e l'abbondanza di invertebrati marini sulle barriere coralline dei Caraibi e può informare le indagini in diversi campi di indagine, tra cui la farmacologia, la biotecnologia e l'ecologia evolutiva.

Qui riportiamo i risultati di questo saggio biologico per sei specie di spugne caraibiche comuni (Figura 2). Questi dati sono stati inizialmente pubblicati nel 1995 da Pawlik et al. 12 e dimostrano la potenza di questo approccio per esaminare le differenze nelle strategie di difesa chimiche tra taxa concomitanti. I risultati sono stati riportati come un numero medio di pellet cibo mangiato + errore standard (SE) per ogni specie. Quasi nessun pellet sono stati consumati in test con es...

Questo saggio biologico si avvale di un modello di pesce predatore per valutare la presenza di metaboliti di alimentazione-deterrenti da estratti organici dei tessuti degli organismi marini a concentrazioni naturali utilizzando un punto di vista nutrizionale analoga matrice alimentare.

Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare l&#39;attività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è valutare l'attività antipredatoria dei metaboliti secondari presenti nei tessuti di organismi marini. Salve, sono il dottor Joseph Pollock dell'Università del North Carolina a Wilmington, e sono affiancato dallo studente laureato Michael Marty, che ha svolto il ruolo di capo del gruppo nella realizzazione di questo video sulle prove di bioanalisi per testare le difese chimiche nei tessuti di organismi marini. Abbiamo iniziato a sviluppare i metodi che state per vedere alla fine degli anni '80.In quel periodo, i chimici dei prodotti naturali attribuivano ruoli ecologici ai metaboliti secondari senza alcuna evidenza sperimentale. Nel frattempo, gli ecologi estrapolavano ruoli difensivi da saggi di tossicità privi di rilevanza ecologica. Qui presentiamo un approccio progettato per valutare l'attività antipredatoria dei metaboliti secondari presenti nei tessuti di organismi marini.Questo approccio soddisfa quattro criteri importanti per i saggi biologici alimentari. Primo, utilizziamo un predatore generalista appropriato. Secondo, estraiamo in modo esaustivo i metaboliti organici di tutte le polarità dai tessuti.Tre, inseriamo quei metaboliti in un alimento sperimentale alla stessa concentrazione volumetrica riscontrata nell'organismo. E quattro, il nostro disegno sperimentale e l'approccio statistico forniscono una metrica significativa per indicare il grado relativo di sgradevolezza. In questi esperimenti alimentari, utilizziamo il thoma testablu di Fossum, un pesce predatore modello adatto per saggi che impiegano tessuti di invertebrati marini dei Caraibi, poiché questa specie è comune nelle barriere coralline dei Caraibi ed è nota per consumare una vasta varietà di invertebrati bentonici.Ora Michael descriverà il protocollo in dettaglio. Per prima cosa, il tessuto deve essere estratto. Aggiungere una miscela uno a uno di dicloruro, metano e metanolo in un tubo conico graduato fino a un volume finale di 30 millilitri.Quindi prelevare frammenti di tessuto dall'organismo bersaglio. Questa operazione può essere eseguita con tessuto fresco o congelato. Noi lavoriamo con spugne, quindi questa dimostrazione video riguarderà la spugna a orecchio di elefante arancione, *Agelas clathrodes*.Potrebbe essere necessario tagliare pezzetti molto piccoli di tessuto per ottenere il volume corretto. Utilizzando lo spostamento volumetrico, è possibile estrarre esattamente 10 millilitri di tessuto, chiudere il tubo con il tappo e capovolgerlo, quindi agitare per quattro ore; durante questo periodo, l'acqua si combina con il metanolo e la fase risultante di metanolo-acqua si separa dalla fase di diclorometano. Il tessuto viene esposto alternativamente a ciascun mezzo di estrazione mentre i tubi vengono agitati.Dopo questo periodo di estrazione, saranno visibili due fasi distinte. La fase polare di metanolo e acqua si troverà al di sopra della fase apolare di clorometano, da trasferire utilizzando una pipetta Pasteur. Trasferire l'estratto di diclorometano dal tubo centrifugo graduato a un pallone a fondo rotondo; il tubo centrifugo graduato deve essere conservato in frigorifero.Nei prossimi passaggi, collegare il pallone a fondo rotondo ad un evaporatore rotante per tutte le operazioni sull'evaporatore rotante. Assicurarsi che la temperatura del bagno d'acqua rimanga al di sotto di 40 gradi Celsius. Seguendo le procedure operative di base per l'evaporatore rotante, asciugare il diclorometano nel pallone a fondo rotondo e risospendere l'estratto non polare essiccato utilizzando una quantità molto piccola di diclorometano.Un'agitazione o un movimento rotatorio potrebbero essere utili per rimuovere il materiale essiccato dalle pareti del pallone a fondo rotondo. Successivamente, trasferire l'estratto di clorometano dal pallone a fondo rotondo in un vial da 20 millilitri per scintillazione. Invece di posizionare il tappo sul vial per scintillazione, applicare un adattatore per evaporatore rotante al vial e, nuovamente, evaporare fino a completa essiccazione su un evaporatore rotante. Il vial per scintillazione contenente l'estratto non polare essiccato può essere conservato in frigorifero durante i passaggi successivi.Ritornando al tubo centrifuga graduato che contiene il tessuto e l'estratto di metanolo e acqua, utilizzeremo uno strumento artigianale che comprime il mezzo di estrazione fuori dal tessuto mediante compressione, schiacciando il tessuto. Successivamente, trasferire l'estratto di metanolo e acqua nel pallone a fondo rotondo e conservarlo in frigorifero a temperatura controllata. Aggiungere metanolo al tubo centrifuga graduato fino a quando il tessuto è completamente immerso, per una seconda estrazione della durata da due a sei ore.Una volta completata la seconda estrazione con metanolo, rimuovere il pallone a fondo rotondo refrigerato dal frigorifero, comprimere il contenuto del tubo centrifugo graduato e trasferire questa nuova estratto di metanolo nel pallone a fondo rotondo originale, che contiene l'estratto di metanolo-acqua ottenuto in precedenza. A questo punto, se vi è il sospetto che il tessuto non sia stato completamente estratto, si può ripetere il passaggio di estrazione con metanolo della durata di due-sei ore. Collegare il pallone a fondo rotondo ad un evaporatore rotante ed evaporare il metanolo come in precedenza.Ricordarsi di mantenere la temperatura del bagno acqua al di sotto di 40 gradi Celsius. Il pallone a fondo rotondo conterrà un estratto acquoso che deve essere combinato con l'estratto non polare essiccato nel vial di scintillazione da 20 millilitri. Pertanto, trasferire il contenuto del pallone a fondo rotondo nel vial di scintillazione da 20 millilitri.Se necessario, risciacquare il pallone a fondo rotondo con una piccola quantità di metanolo per raccogliere tutto l'estratto rimanente. Il vial per scintillazione contiene ora l'estratto non polare essiccato e l'estratto polare. Tuttavia, l'estratto polare è sospeso in un piccolo volume di liquido.Utilizzando un concentratore a vuoto con calore basso, evaporare l'estratto acquoso fino a completa essiccazione. Il vial per scintillazione contiene ora un estratto organico grezzo secco di 10 millilitri di tessuto; asciugare il vial con gas azoto e conservare in congelatore a meno 20 gradi Celsius. Per verificare la palatabilità di questi estratti di tessuto, è necessario prima ricostituirli in una matrice alimentare nutrizionalmente comparabile all'organismo bersaglio.Anelli di mantello di calamaro costituiscono una fonte proteica adatta per saggi biologici su tessuti di invertebrati e possono essere facilmente preparati sotto forma di polvere liofilizzata. Per iniziare questo saggio biologico, collocare anelli di mantello di calamaro congelati in acqua deionizzata tiepida. Una volta scongelati, eliminare parte dell'acqua e versare gli anelli in un frullatore.Mescolare accuratamente ad alta velocità fino a quando il mantello del calamaro diventa un liquido viscoso. Aggiungere acqua se il materiale è troppo denso per essere mescolato. Versare uno strato sottile di mantello di calamaro liquefatto su una teglia bassa e distribuirlo uniformemente.Posizionare la leccarda in un congelatore a meno 20 gradi Celsius. Il foglio di calamaro congelato deve essere spezzato in pezzi più piccoli per facilitare il processo di liofilizzazione. Pezzi più piccoli sono preferibili perché si seccheranno più rapidamente.Nel liofilizzatore. Posizionare i pezzi spezzati di calamaro congelato nella camera e seguire le procedure operative del liofilizzatore. Una volta liofilizzati, i pezzi di calamaro devono essere polverizzati.Questo può essere eseguito con un frullatore. Inserire i pezzi essiccati di calamaro nel frullatore ed azionarlo ad alta velocità fino a quando il materiale non appare come una polvere uniforme. Il passaggio successivo dovrebbe essere effettuato in una cappa aspirante per ridurre l'inalazione della polvere di calamaro particolata.Versare la polvere di calamaro liofilizzata in un setaccio rotante. Tenere un contenitore sotto il setaccio per raccogliere la polvere che passa attraverso il setaccio. Ruotare la manovella per setacciare il materiale di calamaro liofilizzato.Fili spessi di tessuto connettivo che non sono stati adeguatamente omogeneizzati nei passaggi precedenti verranno trattenuti nel setaccio, ottenendo una polvere più fine; se necessario, utilizzare un imbuto per trasferire la polvere di calamaro liofilizzata in un contenitore ermetico, spurgare con gas azoto liquido e conservare congelata a meno 20 gradi Celsius. Dopo aver preparato la polvere liofilizzata di mantello di calamaro, siamo ora pronti a preparare un lotto della miscela alimentare per il saggio. Quando si eseguono più saggi consecutivi nella stessa giornata, è pratico preparare un unico grande lotto della miscela alimentare.Qui illustriamo il processo di preparazione di una miscela di volume pari a 100 millilitri, utilizzando una bilancia pulita per pesare tre grammi di acido alginico e cinque grammi di polvere liofilizzata di mantello di calamaro. Collocare questi ingredienti secchi in un becher da 150 millilitri prima di aggiungere l'acqua. Mescolare delicatamente gli ingredienti secchi con una spatola micro per favorirne l'uniforme miscelazione.Aggiungere 100 millilitri di acqua deionizzata e mescolare vigorosamente. Potrebbero essere necessari alcuni minuti per idratare completamente la polvere. Assicurarsi di avere una miscela omogenea prima di procedere oltre questo passaggio.Se si sceglie di colorare la matrice alimentare con un colore uniforme, aggiungere il colorante in questo passaggio. Riempire una siringa graduata con esattamente 10 millilitri di miscela alimentare. In questo passaggio, la precisione volumetrica è fondamentale, quindi prestare la massima attenzione per evitare l'inclusione di bolle d'aria.Rimuovere il vial da 20 millilitri con estratto organico grezzo secco dal congelatore e aggiungere una o due gocce di metanolo. Non aggiungere troppo metanolo. Questo impedirà alla matrice alimentare di solidificarsi.Utilizzando una spatola microscopica e il minimo quantitativo di solvente, risospendere l'estratto in una miscela omogenea. Assicurarsi di raschiare le pareti del vial per garantire che l'intero estratto venga risospeso. Espellere la siringa con 10 millilitri di matrice alimentare nel vial da 20 millilitri per scintillazione contenente l'estratto omogeneizzato risospeso.Mescolare questa miscela con la spatola microscopica fino a quando non risulti omogenea. Caricare un volume molto piccolo della miscela estrattiva. Un millilitro è sufficiente da inserire in una siringa.Immergere la punta della siringa in una soluzione di cloruro di calcio 0,25 M ed espellere il contenuto della siringa per formare un lungo filamento simile a uno spaghetto. Il filamento si indurirà in questa soluzione. Dopo alcuni minuti, rimuovere il filamento indurito e disporlo su un tagliere di vetro.Usare una lametta per tagliare il filamento in pellet lunghi quattro millimetri. Raccogliere i pellet trattati con l'estratto e risciacquarli in acqua di mare. Per preparare i pellet di controllo.Seguire questa stessa procedura senza l'aggiunta di alcun estratto di tessuto. Potrebbe essere necessario aggiungere un colorante alimentare per uniformare il colore dei pellet del controllo e di quelli trattati. Preparare un controllo negativo che i pesci rifiuteranno certamente di mangiare.Aggiungere il deton e la polvere di benzoato alla miscela di cibo crudo a una concentrazione di due milligrammi per millilitro, come descritto da Miller e Pollock nel 2013. I saggi alimentari vengono eseguiti con pesci RAs thala in fase gialla a testa blu catturati in natura, che vengono mantenuti in gruppi di tre in compartimenti laterali opachi di acquari di laboratorio. Un utensile appropriato per la somministrazione di pellet alimentari è una pipetta di vetro con una peretta di gomma.Un pellet è considerato accettato se viene prontamente consumato dal pesce. Un pellet è considerato rifiutato se non viene mangiato dopo almeno tre tentativi da parte di uno o più pesci di introdurlo nella cavità orale, oppure se viene avvicinato e ignorato dopo un singolo tentativo.Gruppi di pesci non collaborativi che rifiutano di mangiare pellet di controllo non devono essere considerati nei saggi. Questo diagramma di flusso illustra la procedura del saggio: in tutti i casi si inizia con un pellet di controllo per confermare che il gruppo di pesci sia collaborativo. Offrire un pellet trattato.Se i pesci accettano il pellet trattato, questo campione viene registrato come accettato. Se i pesci rifiutano il pellet trattato, deve essere offerto un controllo successivo per confermare se i pesci hanno interrotto l'alimentazione. Se i pesci accettano il pellet di controllo successivo, il campione viene registrato come rifiutato.Ogni campione deve essere eseguito con 10 gruppi indipendenti di pesci. Ecco un esempio di esecuzione di questo saggio alimentare. Innanzitutto, viene offerta una pastiglia di controllo che i pesci accettano.In secondo luogo, viene offerto un pellet trattato. In questo caso, i pesci rifiutano il pellet trattato. Pertanto, deve essere offerto un pellet di controllo successivo.I pesci accettano il controllo successivo e il campione può essere classificato come rifiutato. Ogni campione deve essere eseguito con 10 gruppi indipendenti di pesci. La significatività delle differenze nel consumo di pellet di controllo rispetto a quelli trattati deve essere valutata mediante una versione modificata del test esatto di Fisher, come presentata da Low e Pollock nel 2014.Il test viene modificato in modo che i totali marginali per i pellet di controllo e quelli trattati siano fissi, considerando entrambi come campioni casuali. Ciò fornisce un valore P pari a 0,057 quando vengono ingeriti sette pellet. Pertanto, un estratto è considerato deterrente se vengono ingeriti sei o meno pellet, e appetibile in caso contrario.Se vengono ingeriti sette o più pellet. Quando si confronta la palatabilità tra gruppi di estratti, il numero medio di pellet ingeriti deve essere utilizzato, come verrà mostrato nei risultati rappresentativi. Qui riportiamo i risultati di questo saggio biologico per sei specie comuni di spugne dei Caraibi.Questi dati sono stati inizialmente pubblicati da Pollock et al. 1995 e dimostrano l'efficacia di questo approccio nel chiarire le differenze nelle strategie di difesa chimica tra taxa che coesistono. Ogni categoria sull'asse Y rappresenta estratti di una singola specie di spugna. Sono stati prelevati campioni, estratti e testati diversi individui per ciascuna specie, indicati dal numero tra parentesi che segue il nome della specie.I risultati sono riportati come numero medio di pellet alimentari ingeriti, più l'errore standard per ciascuna specie. Quasi nessun pellet è stato ingerito nei saggi con estratto organico grezzo di alus, pleth, pheon, compressor e lycine chiamato foris. Al contrario, i pellet preparati con estratto di Cali spongy di Vais sono stati ingeriti.Geo Osa e Michel lavis sono stati prontamente consumati nel saggio. Meno di sei pellet sono stati ingeriti per le prime tre specie, che quindi possono essere considerate significativamente deterrenti. Al contrario, le ultime tre specie non hanno mostrato differenze significative rispetto ai controlli e possono essere considerate commestibili.I metodi appena illustrati forniscono un approccio potente per studiare le difese chimiche contro i predatori in combinazione con esperimenti manipolativi sul campo e indagini. I risultati di questi saggi biologici hanno aiutato il mio gruppo di ricerca a comprendere i fattori che controllavano la distribuzione e l'abbondanza di invertebrati marini nelle barriere coralline dei Caraibi. In modo importante, questo metodo soddisfa la necessità di rilevanza ecologica in ecologia chimica al di là dell'ecologia chimica stessa.I risultati di questi saggi biologici possono fornire informazioni per indagini in svariati campi di ricerca, tra cui farmacologia, biotecnologia ed ecologia evolutiva.

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Protocollo sperimentale per l'esame di profili di risposta comportamentale nel pesce larvale: applicazione alla caffeina Neuro-stimolante

La salute dei pesci selvatici può essere utilizzata come indicatore di salute dell'ecosistema acquatico. Le valutazioni basate su autopsia pesce salute forniscono documentazione di lesioni visibili o anomalie, i dati utilizzati per calcolare indici di condizione, nonché la possibilità di raccogliere i tessuti per la valutazione microscopica, espressione genica e altri più in profondità analisi.

Valutazione di salute basati su autopsia pesce selvatico

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e caratterizzare la struttura, la potenza olfattiva e la risposta comportamentale dei composti di feromone presunto di lamprede di mare.

L'identificazione di feromoni Petromyzon marinus mediante frazionamento analisi biologica-Guida

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l'estratto di veleno grezzo dall'anemone di mare e rilevare la sua attività emolitica e fosfolipasi.

Identificazione dell'attività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici

Questo lavoro mira a valutare e rivedere la procedura di saggio biologico di letalità dell'Artemia salina , identificata anche come saggio di letalità dei gamberetti di salamoia. Questo metodo semplice ed economico fornisce informazioni sulla tossicità generale (considerata come una valutazione preliminare della tossicità) dei campioni, vale a dire i prodotti naturali.

Saggio biologico di letalità con Artemia salina L.

Qui, presentiamo una batteria di test comportamentali completa, tra cui il nuovo serbatoio, Shoaling e i test di preferenza sociale, per determinare efficacemente i potenziali effetti neurotossici delle sostanze chimiche (ad esempio, metanfetamina e glifosato) sul pesce zebra adulto utilizzando un singolo acquario. Questo metodo è rilevante per la neurotossicità e la ricerca ambientale.

Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio

Descriviamo il flusso di lavoro di un sistema di screening e l'analisi dei dati per valutare la tossicità dei composti chimici in base alla risposta di trasalimento dell'embrione di zebrafish. Il sistema registra i movimenti degli embrioni di zebrafish in seguito all'esposizione a uno stimolo vibrazionale e consente una valutazione integrata della tossicità/letalità generale e della tossicità neuromuscolare.

Valutazione della tossicità delle sostanze chimiche utilizzando un sistema di screening della risposta all'allievo delle vibrazioni del pesce zebra

L'articolo propone un nuovo metodo in vitro per la valutazione rapida e sensibile della tossicità e dell'ecotossicità degli inquinanti, basato sulla motilità degli emociti di Mytilus galloprovincialis . Il metodo mira a contribuire allo sviluppo di test di esposizione tossicologica ed ecotossicologica più etici e sensibili.

Un test tossicologico ed ecotossicologico basato sulla motilità degli emociti delle cozze (Mytilus galloprovincialis)

Scopri un bioassay con pesce predatore per valutare l'attività antipredatoria di metaboliti secondari dai tessuti di organismi marini. Questo metodo fornisce evidenze sperimentali sui ruoli ecologici delle difese chimiche.

Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare lattività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini (Video) | JoVE Journal

Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare l'attività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini

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