Introduction
Aktuelle monolag eller suspension celledyrkningsassays for lægemiddeludvikling er ikke at efterligne den menneskelige cellulære mikromiljø og dermed føre til en hurtig dedifferentiering og tab af funktion i primære humane cellekulturer. Tissue modeller med højere fysiologiske relevans er nødvendige for at forudsige effekten og sikkerheden af forbindelser, for at de kliniske forsøg. For nylig har standard in vitro-cellekultur teknikker udviklet sig fra todimensionale monolagskulturer mod tredimensionale multi-cellulære modeller med henblik på at efterligne in vivo væv mikromiljø. Disse systemer har allerede vist store forbedringer i retning af mere præcis forudsigelse af virkningsmekanismen af forbindelser 1,2. Endvidere tilpasse in vitro dyrkningsbetingelser til højt specialiserede behov celler er af særlig interesse.
Under standard in vitro betingelser, en række vigtige cultidige parametre, såsom næringsstoffer og ilt, fjernelse af akkumulerende produkter og mekanisk kraft, der virker på cellerne ofte ikke kan kontrolleres grundigt i de fleste tilfælde. Mange organer besidder fysiologisk relevante koncentrationsgradienter af stoffer og opløst ilt. Men de stærkt regulerede og optimerede betingelser er i klar opposition til de ukontrollable diffusion gradienter omkring væv under in vitro betingelser, der fører til et meget ustabilt miljø og begrænse cellulær udvikling 3. Således stabil og især mere kvantificerbare in vitro betingelser er forpligtet til at holde celler levedygtige og differentieret over længere perioder. Perfusionerede systemer, hvor mellemstore komponenter fjernes regelmæssigt og substituerede, er ofte bedre karakteriseret og kontrollerbar end statiske kulturer vedrørende direkte omkringliggende væv. Under statiske betingelser, diffusion gradienter af celle sekreter og kultur medium næringsstofferkan omgive dyrkede celler 3. Introduktion velkarakteriserede medium strømningshastigheder omkring væv tillader celle sekreter at blande sig med rigt medium gennem perfusion. Dette gør det muligt generation af definerede cellulære mikromiljøer, sikre en stabil cellulær fænotype og metabolizing enzymekspression gennem hele analysen varighed 4.
Den seneste udvikling i multiorgansystemer chip (MOC) -baserede systemer kombinerer fordelene ved en kontrolleret mediestrøm omkring manipuleret væv, hvor de små, mellemstore og cellemasse krav mikroskala bioreaktorer, hvilket fører til en reduceret mængde af stof nødvendig under test. Adskillige mikrofluide systemer til vævskultur er blevet beskrevet hidtil 5,6. Tissue-til-væske-forhold inden for disse systemer spiller en særlig afgørende rolle i at simulere fysiologisk relevant cellulær krydstale. Men på grund af tekniske begrænsninger, såsom brugen af eksterne pumper og medier reservoirer, the samlede cirkulerende medier volumen i de fleste systemer er for stor i forhold til vævet mængder. Gruppen af Shuler et al. Var de første til at udvikle et system, der sikrer ordentlige opholdstider af stoffer inden for cellekultur rum og in vivo relevante væv-til-væske-forhold 7,8. Dette blev opnået ved at skalere den eksterne reservoir ned til en plade med 96 brønde, som også repræsenterer "andre væv" rum. For at minimere den cirkulerende medier volumen i vores MOC platform, integreret vi en peristaltisk on-chip Mikropumpe, hvilket eliminerer behovet for eksterne medier kredsløb. Denne Mikropumpe er i stand til at betjene systemet ved en valgbar antal medier strømningshastigheder og shear stress satser 9. Mikrofluidapparat kanalsystem 500 um bredde og 100 um højde forbinder to standardiserede vævskulturplader rum, der hver har størrelsen af en enkelt brønd i en 96-brønds plade. Fastholdelsen af størrelserne af industristandard godt plades tillader integration af allerede eksisterende væv modeller fremstillet i transwell format. Endvidere lodrette stilling Transwell cellekultur skær er justerbar, således at dyrkning af væv modeller, der ikke kun direkte udsat for fluidstrømmen, men kan også løftes op og afskærmet fra den underliggende strøm. Tilsvarende, luft-væske-grænseflade kulturer er mulig ved hjælp af dette system.
MOC platform er fremstillet af et polydimethylsiloxan (PDMS) lag 2 mm høje og et objektglas med et footprint på 75 x 25 mm 2, som er permanent bundet ved lavt tryk plasma oxidation til dannelse af fluidtæt mikrofluid kredsløb. Det PDMS lag indeholdende de respektive kanaler og cellekultur rum er produceret af standard bløde litografi og replika støbning 9. Den microfluidic design af MOC anvendes under denne undersøgelse bestod af to separate mikrofluide kredsløb per chip, hver bedrift to celle cturprodukter rum indbyrdes forbundet af et kanalsystem 100 um høj. Dette tillod udførelse af to individuelle to-væv cokulturer ved hjælp af en multi-orgel chip. Pumping frekvenser blev justeret til opnåelse af mellemstore strømningshastigheder på 40 pl / min.
Denne to-væv MOC design billede evnen til cokultur en lever sfæroid og en hud hulning biopsi i separate kultur rum, omend i en kombineret medier kredsløb under fysiologiske flow betingelser. Differentieret HepaRG celler blev aggregeret sammen med humane hepatiske stjerneformige celler (HHSteC) ved et forhold på 24: 1 til dannelse af homogene sfæroider. Dette forhold blev fundet at være optimal, som observeret i tidligere forsøg 10, selv om, var næsten det dobbelte af antallet af hepatocytter anvendte sammenlignet med in vivo situationen. Huden blev dyrket ved en luft-væske-grænsefladen i en transwell celledyrkningsinsert, således at topisk stof eksponering. Disse væv modeller blev samdyrket for 28 days i MOC at demonstrere helheden i dette system. Desuden blev mikrofluid kanal kredsløb chips fuldstændigt dækkede humane dermale mikrovaskulære endotelceller (HDMEC) til nøjere at simulere det vaskulære system.
Protocol
BEMÆRK: Humant unge forhud blev opnået med informeret godkendelse samtykke og etik (Etik udvalg Charité University Medicine, Berlin, Tyskland), i overensstemmelse med de relevante love, fra en pædiatrisk operation efter rutinemæssige circumcisions.
1. Produktionen af vævsækvivalenter til dyrkning i MOC
- Aggregerede HepaRG og HHSteC i hængende drop plader til at generere lever sfæroiderne.
- For at opnå den trypsinisering af HepaRG celler dyrket i cellekultur kolber (75 cm2), fjernes mediet fra sammenflydende, differentierede monolagskulturer, vask med PBS to gange, og der tilsættes 3 ml 0,05% trypsin / EDTA. Inkuber i 3 til 5 minutter ved 37 ° C, og reaktionen stoppe ved tilsætning af 6 ml trypsininhibitor.
- Centrifuge HepaRG cellerne ved 150 xg i 5 minutter, fjern supernatanten, resuspender cellepelleten i 1 ml HepaRG cellekulturmedium og tælle celler. Cellelevedygtighed skal være> 90%.
- IFor at opnå den trypsinisering af HHSteC celler fjernes mediet fra monolagskulturer, vask med PBS to gange, og der tilsættes 3 ml 0,05% trypsin / EDTA. Der inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C, og reaktionen stoppe ved tilsætning af 6 ml trypsininhibitor.
- Centrifuger HHSteC cellerne ved 150 xg i 5 minutter, fjern supernatanten, resuspender cellepelleten i 1 ml HepaRG cellekulturmedium og tælle celler.
- Kombiner HepaRG og HHSteC i et forhold på 24: 1 i HepaRG cellekulturmedium. For at gøre dette, skal du justere celletal ved at fortynde cellesuspensioner i HepaRG cellekulturmedium og tilsæt 1 x 10 5 celler / ml HHSteC til 4,8 x 10 6 celler / ml HepaRG celler. Bland omhyggeligt.
- Forbered en hængende dråbe plade ved at tilsætte 2 ml PBS til hængende dråbe og modtager plade.
- Pipetter 20 pi af cellesuspensionen i hver brønd i den hængende dråbe plade. Altid forberede omkring 10% mere hængende dråber, end du har brug for at hente aggregater, som nogle aggregater tabt During proceduren. Placer forsigtigt pladen i en 37 ° C inkubator. Vent 48 timer for at danne sfæroider.
- For at hente sfæroiderne, sørg for at bruge pipettespidser med brede tip endelser eller klippe spidserne af 1 ml pipettespidser med en steril kniv for at udvide åbningen til omkring 2 til 3 mm. Brug disse pipettespidser til at håndtere sfæroiderne uden at forstyrre dem.
- Vask sfæroider omhyggeligt fra hængende dråbe plade ved gentagne gange at tilsætte 1 ml medier til toppen af brøndene af hængende dråbe plade ved hjælp af en pipette. Vask pladen indtil alle sfæroider er faldet. Sfæroider er lidt skiveformet med en mellemstor diameter på 300 til 400 um og en højde på 200 til 300 um på dette punkt.
- Saml sfæroiderne i modtageren plade og overføre dem til 24 brønde ultralave fastgørelsesplader med maksimalt 20 spheroids per brønd ved hjælp af de forberedte pipettespidser. Juster medier mængder i hver brønd til 0,5 ml. Brug 20 aggregater til Inoculate en MOC kredsløb for at opnå en miniaturisering på 1 / 100.000 vedrørende in vivo celleantal.
- Inkuber sfæroider ved 37 ° C og 5% CO 2 indtil yderligere anvendelse i MOC. Må ikke opbevares sfæroiderne længere end tre dage før brug for at sikre sammenlignelighed. Dyrk aggregaterne i mindst én dag i ultralave fastgørelsesplader at hente de homogene kugler.
- Fortsættelse enten af to metoder til at generere hudvævsækvivalenter: brugen af hudbiopsier (1.2.1) eller anvendelse af færdiglavet in vitro væv modeller (1.3.1).
- Skær Transwells med en glødelampe kniv under beslaget til at forberede 96 brønde cellekultur indsætter og butik under sterile betingelser indtil videre anvendelse.
- Steriliseres prepuce prøver i 80% ethanol i 30 sek og skære ringen åben. Prøverne bør have en gennemsnitlig højde på 2 mm.
- Brug en biopsitang at skære biopsier på 4,5 mm i diameter for at opnå en lige miniaturization ratio for både leveren og huden. Læg biopsier i den fremstillede 96-brønds transwell indsætter med pincet. Pas at placere biopsier med den epidermale side opad.
- Place cellekultur indsætter med biopsier i en modtager plade indeholdende HepaRG cellekulturmedium og opbevares ved 37 ° C og 5% CO 2 indtil yderligere anvendelse i MOC. Opbevar ikke prøver længere end 2 til 3 timer.
- Integrer færdiglavet in vitro hudmodeller, købt fra forskellige leverandører, til MOC, og sørg for at de er i 96-brønds transwell format. Brug cellekulturmediet leveret af sælgeren eller, hvis en cokultur med en anden væv er planlagt i et yderligere trin, skal du bruge et minimalt medium understøtter begge væv. Test respektive minimalmedium i kendte statiske eksperimenter for dens kapacitet til at støtte væv.
- Hent hudmodeller fra holderen pladen og skære 96 brønde skær under beslaget med en glødelampe kniv. Placer indsatserne tilbage i modtageren plade og opbevares ved 37 ° C og 5% CO2 indtil videre brug i MOC. Opbevar ikke prøver mere end én dag.
2. MOC Fabrication
- Bland PDMS og hærdningsmiddel i et forhold på 10: 1 (v / v) og placere blandingen under vakuum i 15 min for at fjerne luftbobler.
- I mellemtiden behandle et polycarbonat cover-plade med additivet silikonegummi ved 80 ° C i 20 minutter.
- Sæt Teflon skruer ind i respektive huller i dækpladen for at skabe de fire PDMS-fri cellekultur rum og de seks PDMS membraner, 500 um tykke, af Mikropumpe.
- Sæt forberedt cover-plade til master støber af de to mikrovaskulære kredsløb og injicere den afgassede PDMS. Pas på ikke at integrere luftbobler i systemet. Hvis bobler frem, forsøger at fjerne dem ved at vippe enheden.
- Inkuber systemet ved 80 ° C i 60 minutter for at hærde PDMS lag.
- Fjern master mug og Teflon skruer fra enheden og binde PDMS lag til et objektglas med et 75 x 25 mm 2 fodaftryk ved hjælp lavt tryk plasma oxidation.
- Skru specielle gevind MOC adaptere til alle fire cellekultur rum i cover-plade.
- Tilslut sprøjter indeholdende dyrkningsmedium til Luer x ¼-28 mandlige adaptere og skrue dem til MOC adaptere i cover-plade.
- Sprøjt medium ind i mikrofluid kredsløb ved gentagne gange at trykke ned og trække op sprøjterne stemplerne.
- Kontroller korrekt fyldning af kanaler med medium under mikroskopet.
3. endotelialisering af MOC
- Før endothelializing MOC skylles hver MOC kredsløb med endotelcelle vækstmedium og inkuberes det statisk i tre dage ved 37 ° C og 5% CO2.
- Sterilisere MOCs hjælp af en ethanol tørre og placere dem under en laminar strømning bænk. Jegn Desuden sterilisere to par tænger og to sekskantede nøgler til yderligere anvendelse.
- Løsn hætter af vævskultur rum i MOC ved hjælp af de sekskantede nøgler og fjern hætterne ved hjælp af pincet. Efter indsættelse mediet, skruepropper tilbage på MOCs på samme måde.
- For at opnå den trypsinisering af humane dermale mikrovaskulære endotelceller (HDMEC), fjernes mediet fra monolagskulturer, vask med PBS to gange, og der tilsættes 3 ml 0,05% trypsin / EDTA. Der inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C, og reaktionen stoppe ved tilsætning af 6 ml trypsininhibitor.
- Centrifuger HDMEC ved 220 xg i 5 minutter, fjern supernatanten, resuspender cellepelleten i 1 ml endotelcellevækst medium og tælle celler. Cellelevedygtighed skal være> 90%.
- Juster celletal i cellesuspensionen til en slutkoncentration på 2 x 10 7 celler / ml ved at fortynde det med endotelcellevækst medium og overføre 250 pi deten 1 ml sprøjte. Anvend denne koncentration af celler til MOC at holde miniaturisering på 1 / 100.000 for alle organer.
- Sæt sprøjten til en kvindelig Luer x ¼-28 mandlige adapter, presse luften ud af denne fitting, og skru den til en særlig tråd MOC adapter. Tilslut adapteren til en af de to rum i hver MOC kredsløb.
- Tilslut en tom sprøjte på samme måde til det andet rum af MOC kredsløb.
- Injicer cellerne jævnt ved at trykke ned og trække op de to sprøjtestemplerne flere gange i en fortløbende måde. Styr infusion af celler under mikroskop.
- Inkubér MOC ved 37 ° C og 5% CO2 under statiske betingelser i 3 timer for at tillade cellerne at overholde kanalvæggene.
- Fjern chip fra inkubatoren, placere den under en laminar strømning bænken, og erstatte de sprøjter og MOC adaptere med særlige gevind MOC cellekultur kamre.
- Tilføj 400 pi frisk medium til en compartment af hver MOC kredsløb og lad det skylle gennem kanalerne ved hydrostatisk tryk. Bagefter udskifte mediet i begge rum med 300 pi frisk medium.
- Luk rummene ved hjælp kasketter, som beskrevet i 3.1.2.
- Slut chip pumpestyringsenheden. Juster pumpe hastighed til en frekvens på 0,475 Hz og dyrke chip ved 37 ° C og 5% CO2.
- Udskift mediet af hver MOC rum hver til to dage og overvåge cellemorfologien ved lysmikroskopi.
4. Loading af Chip
- Placer MOC under laminar strømning bænk og åbne den, som beskrevet i trin 3.1.2.
- Fjern medier fra vævskultur rum og erstatte det med 300 pi frisk HepaRG cellekulturmedium.
- Overfør 20 foruddannede kugler til en vævskultur rum i hver MOC kredsløb ved hjælp af pipettespidser med en bred åbning (se trin 1.1.8 / 9). Luk cap ved hjælp af pincet og sekskantede nøgler.
- Overfør 96-brønds cellekultur indsatse indeholdende hudækvivalenter til den resterende vævskultur rum i hver MOC kredsløb ved hjælp af pincet. Sørg for at undgå bobledannelse under membranen af huden tilsvarende. For at gøre dette, skal du indsætte Transwells på et lidt på skrå vinkel og skub forsigtigt ned. Fjern overskydende medium omkring transwell blive skubbet op nedefra med en pipette.
- Luk hætten ved hjælp af pincet og sekskantede nøgler.
5. Tilslutning af Chip til pumpestyringsenheden
- Opstille driftsmæssige i styreenhederne til de værdier ønskes. Ændre lufttryk fra 0 til 8.000 mbar, vakuum fra 0 til -800 mbar, og pumpe frekvens 0,24-2,4 Hz. Indstil pumpning retning med eller mod uret.
- Fjern MOC indeholder vævsækvivalenter fra under laminar strømning bænk og tilslut den til pumpen kontrolenheder.
- Efter numeration på rørene, indsætte lufttryk slange til de respektive beslag på MOC.
- Dyrk MOC ved 37 ° C og 5% CO2 i en inkubator eller, i tilfælde af levende væv billeddannelse bruge MOC støtte til at opvarme chip til 37 ° C og dyrke chippen uden for inkubatoren. Brug opvarmede støtte til at dyrke celler i MOC under en standard mikroskop.
6. Udførelse Media Exchanges, medier og er udsat for påvirkninger
- Udfør rutinemæssig medieudskiftning hver dag eller hver anden dag, i betragtning af den type væv dyrket og den metaboliske aktivitet af cellerne.
- Hent den MOC fra inkubatoren og observere den under mikroskop for at kontrollere medierne strømningshastigheder og tjekke for forurening.
- Afbryd MOC fra pumpen styreenheden ved at tage lufttryk slange. Steriliser MOC anvendelse af ethanol servietter og sætter det under laminar strømning bænken.
- Åbn vævskultur compartment indeholder leveren sfæroiderne, som beskrevet i trin 3.1.2.
- Fjerne op til 200 pi fra rummet ved hjælp af en pipette uden at forstyrre sfæroiderne og opbevare mediet i en tom brønd i en dyb brønd plade. Analyser medier prøven direkte eller lukke den dybe brønde og gemme medieprøver ved -80 ° C til yderligere analyse.
- Udskift mediet af MOC med op til 250 pi frisk celledyrkningsmedium og luk hætten. Forskellen i mængden af mediet fjernet og erstattet regnskab for tab på grund af små mængder siver ud af chippen ved lukning af systemet.
- Åbn hætten af vævskultur rum holder huden beholdninger ved dette punkt at kontrollere for væv intakthed. Pas på ikke at indføre luftbobler i systemet. Luk hætten.
- Slut slangen af pumpen styreenhed til MOC, i overensstemmelse med trin 5.3, og placer MOC i en inkubator.
7. Analyser Daily Media Prøver og Udfør On-line analyse
- Analyser vævskultur ydeevne on-line ved hjælp af levende celler billeddannelse eller offline, ved at analysere de daglige medier prøver. Udfør den sidstnævnte ved standard rutinemæssige enzymatiske assays (f.eks lactatdehydrogenase (LDH) aktivitet) eller ELISA (f.eks albumin koncentration). En online-analyse er beskrevet i det følgende.
- Fjern mediet af endothelialized MOC, som beskrevet i trin 6.1.1, 6.1.4, og erstatte det i begge vævskultur rum med 200 pi 10 pg / ml fluorofor konjugeret acetyleret low-density lipoprotein (LDL) opløsning (fortyndet i celledyrkningsmedier).
- Luk dækslerne. Slut MOC til pumpestyringsenheden ifølge trin 5.3, og pumpe det til 30 minutter ved 0,475 Hz til at distribuere opløsningen jævnt i mikrofluid kredsløb.
- Stop pumpning og inkuber MOC statisk i 3,5 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Lignende to trin 7.2, fjern acetyleret LDL løsning fra begge rum og erstatte det med 400 pi frisk medium i en af de to rum.
- Vent 3 til 5 minutter for at lade det hydrostatiske tryk drive medium gennem mikrofluid kanal kredsløb.
- Sæt medium, der er strømmet igennem med 300 pi frisk medium og også udfylde den anden vævskultur rum med 300 pi frisk medium.
- Luk MOC, ifølge trin 3.1.2. Sætter det under en fluorescens mikroskop og iagttage cellevækst og levedygtighed.
- Placer farvede MOC tilbage i inkubatoren til fortsat dyrkning. Fjern pletten siver ud af cellerne med hvert af de følgende udskiftning af medier.
8. Hent vævsækvivalenter fra MOC og Udfør endepunkt Analyser
- Hent vævsækvivalenter fra MOC ved slutningen af eksperimentet for endpoint analyser.
- For at hente leveren og huden equivalents fra MOC, fjerne mediet fra hver vævskultur rum, som beskrevet i trin 6.1.1 til 6.1.4.
- Fjern de 96 brønde cellekultur indsatse indeholdende skindet fra MOC ved hjælp af pincet. Skrælle membranen omhyggeligt fra indsatsen ved at gribe det på den ene side med en pincet og trække den ned. Pas på ikke at miste huden svarer på dette punkt.
- Frys membranen holder huden tilsvarende i cryo-embedding forbindelse og opbevar det ved -80 ° C indtil videre analyse.
- Fjern leveren ækvivalenter på samme måde fra vævskultur rummet ved pipettering dem ved hjælp af cut pipettespidser (se trin 1.1.8 / 9).
- Integrer leveren spheroids i cryo-embedding forbindelse. Pas på ikke at overføre for meget væske og fjerne overskydende væske med en pipette. Efter placering af sfæroider på indlejring forbindelse og fjerne mediet, tilføje yderligere cryo forbindelse på toppen af sfæroiderne at omslutte dem.
- Frys leveren ækvivalenter og opbevar det ved -80 ° C indtil videre analyse.
- Udfør endepunktsanalyse ved at skære vævsækvivalenter på en kryomikrotom til 8 um sektioner og farvning for vævsspecifikke markører, som beskrevet i tidligere protokoller 10.
Representative Results
Standard in vitro vævskulturer udføres under statiske betingelser, hvilket begrænser diffusion af oxygen og næringsstoffer levering til vævene. Fluidisk systemer, der viser forbedrede levering egenskaber, hæmmes ofte af deres store mellemstore krav, der har ikke-fysiologisk høj medium til væv nøgletal. Således er metabolitter fortyndes og cellerne ikke er i stand til at konditionere deres omgivelser. MOC præsenteres i denne undersøgelse forbinder to separate vævskulturplader rum, hver på størrelse med en enkelt brønd i en standard 96-brønds plade ved en mikrofluid kanalsystem. Den lille skala af systemet og integration af pumpen på chippen giver systemet mulighed for at operere ved mængder medier kun 200-800 pi. Dette svarer til en total systemisk medium til væv forholdet 8: 1 til 31: 1, henholdsvis for leveren og hudvæv cokulturer (med en total væv volumen på ca. 26 ul). Den samlede væskevolumen ekstracellulær i en mand der vejer 73 kg er 14,6 L, hvoraf væskevolumen interkapillær er 5,1 L, hvilket fører til en fysiologisk ekstracellulære væske til tissue forholdet 1: 4. Derfor er mængden af medier i hele cirkulationssystemet i MOC stadig større i forhold til den fysiologiske situation; og alligevel, det repræsenterer det mindste medie til tissue-forholdet hidtil rapporteret for flere organsystemer 5. Som industristandard vævskultur formater bevares, forskerne i stand til at kombinere eksisterende og allerede validerede statisk vævsmodeller i en væskestrøm fælles. Figur 1 viser den skematiske af en forsøgsopstilling af mulige MOC enkelt væv eller flere væv cokulturer. Primære vævsbiopsier og in vitro -generated vævsækvivalenter fra cellelinjer eller primære celler kan dyrkes enten med 96 brønde cellekultur skær eller ved at placere dem direkte i vævskultur rum. Da kanalsystemet forbinder cellekultur rum er kun 100 μm høj, vil vævsækvivalenter overskrider disse dimensioner holdes inden for kulturen rum. Den endothelialisering af MOC kredsløb med primære HDMECs muliggør endnu et skridt fremad i retning af flere fysiologiske dyrkningsbetingelser ved at tilvejebringe en biologisk vaskulær struktur.
Figur 1:. Skematisk fremstilling af MOC kulturer Vævsækvivalenter fremstilles under standard in vitro betingelser, podet ind i MOC og dyrket som enkelte kulturer eller cokulturer under dynamiske forhold. Daglige medier prøver og endpoint analyser udføres. Lufttryk at drive pumpen anvendes gennem de tre blå rør forbundet til MOC fra oven. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Efter endothelialisering protokollen er et konfluent HDMEC dækning af mikrofluid kanal kredsløb opnås inden for fire dage efter dynamisk kultur, som vist i figur 2. Celler let klæbe til væggene af MOC kanal, skaber et konfluent monolag og langstrakt langs shear stress (figur 2B). Endvidere celler dækker hele omkredsen af kanalerne, som rapporteret tidligere 9. Ingen yderligere ændring i endotel morfologi blev observeret efter fire dages dyrkning frem til udgangen af kulturen.
Figur 2:. Endothelialized MOC kanaler humane dermale mikrovaskulære endotelceller (HDMEC) dannet et sammenflydende monolag i mikrofluid kredsløb. Celler blev farvet med acetyleret LDL efter 23 dages MOC kultur. (A) Hele microvascular kredsløb blev dækket med celler og (B) celler langstrakt langs forskydningsspænding. Scale bars: (A) 1,000 um og (B) 100 um.
I et yderligere forsøg, er i overensstemmelse skiveformede lever celle spheroids dannet af HepaRG og HHSteC i to dage hængende drop kultur, da dette modelsystem tidligere blev rapporteret som værende egnet til lægemiddelmetabolisme studerer 11-13. Til demonstration blev en vævskultur rum i hver MOC kredsløb podet med 20 kugler i 96-brønds cellekultur skær og væv blev dyrket over 14 dage under dynamiske forhold ved hjælp af ikke-endothelialized MOCs. Ethvert antal af aggregater eller mængden af primær materiale kan integreres enten direkte i rummene eller ved hjælp af cellekultur skær. Immunfluorescensfarvning af sfæroiderne efter hentning fra MOC viser en stærk, homogen udtryk for liver-typiske cytokeratin 8/18 og fase I enzymer cytochrom P450 3A4 og 7A1 (figur 3A og 3B). Farvning af canaliculære transportør multiresistens protein 2 (MRP-2) afslørede en polariseret fænotype og eksistensen af rudimentære galde-canaliculi-lignende netværk (figur 3C).
Figur 3 :. Dyrkning af humane kunstig lever-mikro-væv i MOC. Lever aggregater dyrkes i 14 dage i MOC blev farvet for (A) cytokeratin 8/18 (rød) og (B) cytokrom P450 3A4 (rød) og 7A1 (grøn). (C) Angivelse af canaliculært transporter MRP-2 (grøn), blå kernefarvning. Scale barer: 100 um.
Da produktionen af albumin er en afgørende forudsætning for liver vævskulturer, har bin vælges til overvågning lever-typiske aktivitet i MOC. Analyse daglige medier prøver til albumin produktion viser en betydelig stigning i produktionen sats i MOC kulturer i forhold til statiske kulturer (figur 4), og til værdier rapporteret i litteraturen 11. Stigningen i albumin syntese sats kan tilskrives den øgede ilt og næringsstoffer levering i MOC kulturer. Derfor MOC er i stand til at opretholde leveren aggregater over en periode på 14 dage kultur i en metabolisk aktiv tilstand, øge lever-typiske adfærd, såsom albumin produktion.
Figur 4: Fjorten dage lever klumpformet præstation i MOC Albumin produktion af lever enkelt vævskulturer i MOC og i statisk kultur.. Data er middel ± SEM (n = 4).
Afprøvning af che Subsystemic toksicitet ved gentagen doseringmicals og kosmetik i dyr kræver 21 til 28 dage efter eksponering, som defineret af OECD guideline no. 410 "Gentagen Dose giftighed for hud: 21/28 dages Study." Langsigtede hud-lever cokulturer er eksemplificeret her i op til 28 dage til at klare lovgivningsmæssige krav. En luft-væske grænsefladen er fastsat senere eksponering dermal stof ved at dyrke hudbiopsier i 96-brønds cellekultur skær. Den cokultur eksperiment udføres eksemplarisk i endothelialized MOCs at bevise, om en tre-væv cokultur i en kombineret medier kredsløb kan holdes levedygtige og metabolisk aktive over 28 dage.
Analyse af LDH-aktivitet i medierne supernatanter afslørede en støt faldende i de første otte dage af kultur, der opholdt sig konstant på omkring 80 U / l derefter (figur 5). Dette indikerer en kunstig men stabil væv omsætning i systemet på senere tidspunkter. Sammenligning af tre væv cokultur liver enkelt-tissue og lever-endotel cokultur eksperimenter, kunne et signifikant nedsat LDH-niveau kan findes, især i de første dage i kulturer ikke herunder huden. Celledød under denne første periode med høj LDH-aktivitet forekom primært i huden kultur rum, som huden enkelt væv MOC kulturer viste (data ikke vist). Dette kan være på grund af den sårede området omkring biopsi som følge af udstansningen af huden.
Figur 5: Femten dage væv resultater i MOC LDH aktivitet i medierne supernatanter af leveren enkelt vævskulturer (MOC Li), lever kulturer i endothelialized MOCs (MOC Li-Va) og lever-hud cokulturer i endothelialized MOC (MOC Li. -va-Sk). Data er middel ± SEM (n = 4).
Under 28 dages dyrkningsperiode, lever sfæroider klæbet til bunden af MOC ennd celler voksede ud, danner et flerlaget forbindelse mellem tilstødende sfæroider. Dette ikke hæmmer væv funktionalitet. Endpoint analyse ved immunfluorescens viste, at leveren sfæroider var stadig metabolisk aktive efter 28 dages MOC cokultur, som vist ved cytokrom P450 3A4-farvning (figur 6A). HHSteC blev fordelt i hele leveren tilsvarende, som vist ved vimentin farvning (figur 6B). En stigning i vimentin farvningsintensitet kunne observeres i områder, hvor celler var vokset ud af sfæroider. Farvning for von Willebrand faktor (vWF) viste, at endotelceller ikke var trængt dybt ind i vævet, men var i direkte celle-celle-kontakt med den ydre hepatocytter (figur 6C).
Immunhistokemi farvning af hudbiopsier viste et udtryk for tenascin C og collagen IV i basalmembranen (figur 6D), mens farvning af statisk kontrol viste elevated niveauer af tenascin C (figur 6E). Tenascin C har vist sig at være opreguleret under sårheling, inflammatoriske processer og fibrose, hvilket tyder induceret fibrotiske processer i statisk, men ikke i dynamiske kulturer 14,15.
Stabil cellelevedygtighed og funktionalitet af væv efter en 28 dages cokultur i MOC bevise, at systemet er i stand til at opretholde en kombination af op til tre væv i et fælles medie kredsløb. Primære celler, samt væv modeller og biopsier, kan dyrkes samtidigt i MOC system.
Figur 6:. Ydelse af multi-vævskulturer over 28 dage Lever ækvivalenter og hud biopsier blev dyrket i en endothelialized MOC og cellefunktionalitet blev vist ved immunfarvning af (A) fase I enzymer cytochrom P4503A4 (rød), (B) vimentin (rød), (C) cytokeratin 8/18 (rød) og vWF (grøn) i levervæv. Hudbiopsier samdyrket i 28 dage (D) i MOC eller (E) under statiske forhold blev farvet for tenascin C (rød) og collagen IV (grøn), blå kernefarvning. (F) H & E farvning af huden efter 28 dage MOC kultur. Scale barer: 100 um.
Discussion
Den MOC platform beskrevet her repræsenterer en stabil og effektivt værktøj til at dyrke væv af forskellig oprindelse på dynamiske medium strømningsforhold i længere kultur perioder 10,16. I dette eksempel blev den platform, der anvendes til at dyrke primære celler (HDMEC), vævsækvivalenter genereret fra en cellelinje (lever aggregater), og en cokultur af førnævnte med en vævsbiopsi. Den MOC var stand til at opretholde de tre-væv cokultur i op til 28 dage i en kombineret medium kredsløb. Så vidt forfatternes viden, det er første gang en multi-væv cokultur herunder biopsier, primærelementer og cellelinjer er blevet udført over fire uger.
En af de store ulemper ved mikrofluide systemer er affiniteten af små molekyler til at klæbe til overfladen materiale af fluide kredsløb. Da overfladen volumenforhold er særlig høj i mikrofluide systemer, bliver denne virkning endnu mere udtalt 17 in vitro -generated væv er lovende og guider vejen for yderligere undersøgelser 18,19.
Det er velkendt, at hepatocytter tendens til at miste deres leverspecifikke funktioner over tid under dyrkningsbetingelser 20 statisk todimensionale in vitro. Enzymer, såsom cytochrom P450 familien, er af særlig betydning, hvis metabolisme af et bestemt stof er at blive undersøgt. Cytokrom P450 3A4, et enzym relateret til biotransformationen af mange xenobiotika og cytochrom P450 7A, which er involveret i galdesyresyntese, blev udtrykt i leveren aggregater dyrkes i MOC over 14 dage. Dette indikerer at bevarelsen af en metabolisk aktiv fænotype, der giver mulighed for lægemiddelmetabolisme studier. Den øgede albumin produktionshastighed af aggregater i MOC forhold til statiske kulturer er en yderligere indikation for passende dyrkningsbetingelser. Albumin produktion satser observeret i løbet af denne undersøgelse var sammenlignelige eller endog højere end tidligere rapporterede værdier opnået ved mikrofluide chips herunder HepG2-celler 21 - 23, dog værdierne ikke nåede de primære humane hepatocytkulturer 24. Desuden MOC systemet i sin midlertidige layout, giver ikke mulighed for en separat adskillelse af galde. Celler i det aggregerede polariserede og dannede galde-canaliculi-lignende strukturer, hvilket fremgår af MRP-2-farvning. Imidlertid blev disse canaliculi ikke forbundet til en teknisk kanal indsamle galden. Denne ikke-fysiologiske mixing af galde med blodet rum skal behandles i et kommende redesign af systemet.
Tilpasningen af strømningskarakteristika er af stor betydning 25, navnlig med hensyn til væv er følsomme over for forskydningsspænding, såsom leveren. Mængden af forskydningsspænding opfattes af vævet kan ændres på to måder: For det første kan lufttryk anvendes til at skubbe ned membraner pumpen sænkes, faldende peak shear stress værdier i systemet. For det andet kan vævene indlejret i en ekstracellulær matrix lagdeling eller dyrket i transwell kultur skær. Sidstnævnte beskytte væv fra den underliggende strøm med en porøs membran. Disse justeringer skal udføres på et individuelt grundlag for hvert organ svarende før du starter MOC eksperiment. Ved en pulserende drift af 2,4 Hz, for eksempel, som svarer til et højt, men stadig fysiologiske, hjerte aktivitet af 144 slag / min i mennesker, forskydningsspændingen målt ikanaler af mikrovaskulære kredsløb når ca. 25 dyn / cm2. Det svarer til en fysiologisk forskydningsspænding i den højere ende af skalaen i mikrovaskulatur og er derfor godt anvendelig til forsøg, herunder en endothelialisering af kanalerne. Men da den nuværende microfluidic layout af MOC ordning præsenteres kun består af ét medie ledning, der forbinder de to orgel rum, en pumpe hastighed og shear stress sats har at blive valgt for hele systemet. Derfor er en præcis justering af flydeegenskaber til behovene i de enkelte organ er ikke altid muligt.
Endvidere har omhu skal træffes i tilpasning af cellerne til den fælles medium. Celler dyrket i MOC i en kombineret medier kredsløb derfor ingen individuel celledyrkningsmedier kan anvendes til hvert væv model, som det er standard for in vitro-cellekultur. En minimal kombineret formulering medier skal defineres på forhånd og than celler skal justeres trinvist til denne nye medier. En procedure på 80% / 20% justering af gamle til nye medier i to dage, så 50% / 50%, efterfulgt af 20% / 80%, og en fuld udveksling altid ført til en rimelig celle levedygtighed og funktionalitet af kulturer i vores hænder.
Den nuværende microfluidic layout MOC system tillader cokultur af op til tre væv. En cokultur af mindst ti vigtigste organer i det menneskelige legeme er nødvendig for at nå homøostase. Derfor systemet præsenteret er i stand til at forudsige bestemte væv-væv interaktioner, men ikke den sande systemisk reaktion på et stof. En videreudvikling af MOC til at omfatte flere orgel hulrum påtænkes. Desuden gyldigheden af systemet skal vises ved hjælp af et sæt referencestoffer. Fortrinsvis forbindelser, der har undladt i kliniske forsøg (f.eks Troglitazon) skal testes for deres præstationer i MOC. Betragtninger, er en sand validering af sådanne komplekse systemer stadig hæmmet by den manglende standardisering vedrørende biomarkører og endepunkter for funktionel evaluering, indsamling flere data om den toksikologiske resultater af denne og lignende systemer vil udvide deres pålidelighed og anvendelsesområde.
Disclosures
Uwe Marx er CEO for TissUse GmbH, der producerer og markedsfører Multi-Organ Chip platform, der anvendes i artiklen. Denne udgivelse er finansieret af en pris, der ydes af Corning Inc.
Acknowledgments
Arbejdet er finansieret af det tyske ministerium for uddannelse og forskning, GO-Bio Grant No. 0315569.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
| HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
| HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate |
|
| HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
| Trypsin/EDTA | Biowest | ||
| Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
| MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1,000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
| 384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
| Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
| Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
| Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
| Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
| Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
| Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25 mm | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
| Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
| Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
| Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
| Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |
References
- Kelm, J. M., Fussenegger, M. Microscale tissue engineering using gravity-enforced cell assembly. Trends in biotechnology. 22 (4), 195-202 (2004).
- Marx, U., Walles, H., et al. Human-on-a-chip Developments: A Translational Cutting-edge Alternative to Systemic Safety Assessment and Efficiency Evaluation of Substances in Laboratory Animals and Man. ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
- Baudoin, R., Griscom, L., Prot, J. M., Legallais, C., Leclerc, E. Behavior of HepG2/C3A cell cultures in a microfluidic bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 53 (2), 172-181 (2011).
- Dash, A., Inman, W., et al. Liver tissue engineering in the evaluation of drug safety. Expert opinion on drug metabolism & toxicology. 5 (10), 1159-1174 (2009).
- Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing--organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab on a chip. 13 (18), 3481-3495 (2013).
- Huh, D., Torisawa, Y., Hamilton, G. a, Kim, H. J., Ingber, D. E.
- Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The design and fabrication of three-chamber microscale cell culture analog devices with integrated dissolved oxygen sensors. Biotechnology progress. 20 (1), 338-345 (2004).
- Tatosian, D. a, Shuler, M. L. A novel system for evaluation of drug mixtures for potential efficacy in treating multidrug resistant cancers. Biotechnology and bioengineering. 103 (1), 187-198 (2009).
- Schimek, K., Busek, M., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a chip. 13 (18), 3588-3598 (2013).
- Wagner, I., Materne, E. -M., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
- Vieira, U., et al. HepaRG human hepatic cell line utility as a surrogate for primary human hepatocytes in drug metabolism assessment in vitro. Journal of pharmacological and toxicological methods. 63 (1), 59-68 (2010).
- Abu-Absi, S. F., Hansen, L. K., Hu, W. -S. Three-dimensional co-culture of hepatocytes and stellate cells. Cytotechnology. 45 (3), 125-140 (2004).
- Leite, S. B., Wilk-Zasadna, I., et al. Three-dimensional HepaRG model as an attractive tool for toxicity testing. Toxicological sciences. 130 (1), 106-116 (2012).
- Chiquet-Ehrismann, R.
- Sidgwick, G. P., Bayat, A. Extracellular matrix molecules implicated in hypertrophic and keloid scarring. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology JEADV. 26 (2), 141-152 (2012).
- Ataç, B., Wagner, I., et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
- Wu, M. -H., Huang, S., Lee, G. -B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models A new approach for the refinement of biomedical research. Journal of Biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Holnthoner, W., Hohenegger, K., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. J Tissue Eng Regen Med. , (2012).
- Dunn, J. C. Y., Yarmush, M. L., Koebe, H. G., Tompkins, R. G. Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: long-term culture in a sandwich configuration. FASEB Journal. 3, 174-177 (1989).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology progress. 20 (3), 750-755 (2004).
- Kim, M. S., Yeon, J. H., Park, J. -K. A microfluidic platform for 3-dimensional cell culture and cell-based assays. Biomedical microdevices. 9 (1), 25-34 (2007).
- Prot, J. -M., Aninat, C., et al. Improvement of HepG2/C3A Cell Functions in a Microfluidic Biochip. Biotechnology and bioengineering. 108 (7), 1704-1715 (2011).
- Riccalton-Banks, L., Liew, C., Bhandari, R., Fry, J., Shakesheff, K. Long-term culture of functional liver tissue: three-dimensional coculture of primary hepatocytes and stellate cells. Tissue engineering. 9 (3), 401-410 (2003).
- Powers, M. J., Domansky, K., et al. A Microfabricated Array Bioreactor for Perfused 3D Liver Culture. Biotechnology and Bioengineering. 78 (3), 257-269 (2002).
