La pelle ospita una complessa rete di cellule immunitarie. Descriviamo una metodologia efficiente per la digestione della pelle di topo, proveniente da diverse parti del corpo dell'animale, al fine di ottenere una sospensione unicellulare e analizzare le diverse popolazioni leucocitarie residenti nella pelle mediante citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Preparazione di cella singola sospensioni per analisi citofluorimetrica provenienti da diverse regioni della pelle del mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
La pelle è un organo barriera che interagisce con l'ambiente esterno. Essendo continuamente esposti a potenziali invasioni microbiche, il derma e l'epidermide ospitano una varietà di cellule immunitarie sia in condizioni omeostatiche che infiammatorie. Gli strumenti per ottenere il rilascio di cellule cutanee per le analisi citofluorimetriche sono, quindi, molto utili per studiare la complessa rete di cellule immunitarie che risiedono nella pelle e la loro risposta agli stimoli microbici. Qui, descriviamo una metodologia efficiente per la digestione della pelle di topo per ottenere rapidamente ed efficacemente sospensioni a singola cellula. Questo protocollo consente di mantenere la massima vitalità cellulare senza compromettere l'espressione dell'antigene di superficie. Descriviamo anche come prelevare e digerire campioni di pelle da diverse posizioni anatomiche, come l'orecchio, il tronco, la coda e il cuscinetto plantare. Le sospensioni ottenute vengono quindi colorate e analizzate mediante citometria a flusso per discriminare tra diverse popolazioni di leucociti.
Introduzione
La pelle è uno degli organi più grandi del corpo e la sua grande superficie è continuamente esposta all'ambiente esterno. Pertanto, la pelle deve proteggere l'organismo da potenziali minacce al fine di mantenere l'omeostasi, sia con mezzi fisici, sia fornendo una protezione attiva contro l'ingresso di potenziali agenti patogeni. In modo simile alla mucosa intestinale e polmonare, la pelle ospita una varietà di cellule immunitarie che interagiscono continuamente con l'epitelio al fine di mantenere la sorveglianza immunitaria. Questo complesso sistema che coinvolge sia le cellule immunitarie che quelle non immunitarie della pelle è stato riconosciuto fin dagli albori d....
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Protocollo
approvazione studio: I protocolli sperimentali sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano (Roma, Italia) secondo il Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 "Attuazione della Direttiva n. 86/609 / CEE in materia di Protezione degli Animali utilizzati a Fini Sperimentali o ad Altri Fini scientifici."
1. Ottenere campioni di pelle
- Eutanasia il mouse per dislocazione cervicale.
- Orecchio:
- Tagliare la parte senza peli delle orecchie del mouse.
- dorsali separate e lato ventrale tirandole a pezzi con una pinza. Rimuovere eventuali residui cartilagini raschiando delicatamente la parte intern....
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Risultati
Pelle dalla diversa regione del corpo è stato digerito secondo il protocollo descritto e colorati con gli anticorpi indicati. La strategia di gating è rappresentato nella Figura 1. In primo luogo selezionare cellule vive (cellule DAPI-), poi porta il canottiere (FSC-A vs FSC-W) e su cellule con linfociti morfologia (FSC-A vs SSC-A). Quando indicato, vengono selezionate le cellule CD45 + di origine ematopoietiche.
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Discussione
Abbiamo descritto un metodo per la preparazione di sospensioni monocellulari da diverse regioni cutanee mouse. Il metodo della digestione abbiamo adottato, non solo dà alte rese, ma conserva anche l'espressione dei marcatori di superficie, che è fondamentale per la successiva analisi FACS.
L'uso di un cocktail di collagenasi I e II e termolisina, garantisce lotto minima per differenze lotti nell'attività enzimatica rendendo questo metodo altamente riproducibile. Altri metodi pubb.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, IG14593, MFAG13235), della Fondazione Cariplo (Grant 2010-0678 e NANOVAC) e della Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Integrato RPMI 1640 medium | RPMI1640 integrato con L-glu, penna-streptococco senza beta mercapto etanolo | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | risospensione [2,5 mg/ml] in dH2O; Conservare le aliquote a -20 ° C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | risospensione in RPMI 1640 senza siero [1.000 U/ml] |
| Materials | |||
| Forbici | |||
| Pinze | |||
| Bisturi chirurgici Piastre | |||
| Petri da 35 mm | |||
| Piastre di Petri da 66 mm Piastre | |||
| da 100 mm | |||
| 70 µ m Filtri cellulari | BD | 352350 | |
| Cocktail di digestione | Diluire in RPMI 5% | ||
| FBS LIberase TM | 300 µ g/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC |
Riferimenti
- Streilein, W. J. Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT). Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).
- Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. The Skin-Resident Immune Network. Current dermatol....
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Ristampe e permessi
