Preparazione di cella singola sospensioni per analisi citofluorimetrica provenienti da diverse regioni della pelle del mouse

Sommario

La pelle ospita una complessa rete di cellule immunitarie. Descriviamo una metodologia efficiente per la digestione della pelle di topo, proveniente da diverse parti del corpo dell'animale, al fine di ottenere una sospensione unicellulare e analizzare le diverse popolazioni leucocitarie residenti nella pelle mediante citometria a flusso.

Abstract

La pelle è un organo barriera che interagisce con l'ambiente esterno. Essendo continuamente esposti a potenziali invasioni microbiche, il derma e l'epidermide ospitano una varietà di cellule immunitarie sia in condizioni omeostatiche che infiammatorie. Gli strumenti per ottenere il rilascio di cellule cutanee per le analisi citofluorimetriche sono, quindi, molto utili per studiare la complessa rete di cellule immunitarie che risiedono nella pelle e la loro risposta agli stimoli microbici. Qui, descriviamo una metodologia efficiente per la digestione della pelle di topo per ottenere rapidamente ed efficacemente sospensioni a singola cellula. Questo protocollo consente di mantenere la massima vitalità cellulare senza compromettere l'espressione dell'antigene di superficie. Descriviamo anche come prelevare e digerire campioni di pelle da diverse posizioni anatomiche, come l'orecchio, il tronco, la coda e il cuscinetto plantare. Le sospensioni ottenute vengono quindi colorate e analizzate mediante citometria a flusso per discriminare tra diverse popolazioni di leucociti.

Introduzione

La pelle è uno degli organi più grandi del corpo e la sua grande superficie è continuamente esposta all'ambiente esterno. Pertanto, la pelle deve proteggere l'organismo da potenziali minacce al fine di mantenere l'omeostasi, sia con mezzi fisici, sia fornendo una protezione attiva contro l'ingresso di potenziali agenti patogeni. In modo simile alla mucosa intestinale e polmonare, la pelle ospita una varietà di cellule immunitarie che interagiscono continuamente con l'epitelio al fine di mantenere la sorveglianza immunitaria. Questo complesso sistema che coinvolge sia le cellule immunitarie che quelle non immunitarie della pelle è stato riconosciuto fin dagli albori dell'immunologia, quando nel 1978 è stato coniato per la prima volta il termine "tessuto linfoide associato alla pelle" (SALT) ¹ per descrivere tale complessità.

Il gran numero di cellule immunitarie che risiedono nella pelle aiuta l'organismo non solo a combattere potenziali invasioni, ma anche a orchestrare la guarigione delle ferite e a mantenere la tolleranza verso gli autoantigeni e il microbiota cutaneo ^2,3.

Tra le cellule immunitarie residenti nella pelle, le cellule dendritiche (DC) hanno un ruolo cruciale nel modellare le risposte immunitarie e nel mantenere l'omeostasi ⁴. Le DC dermiche e le cellule di Langerhans rispondono prontamente alle invasioni di agenti patogeni e, dopo la migrazione ai linfonodi, attivano le cellule T e inducono l'espressione dei recettori di homing cutaneo sulle cellule T effettrici appena generate ⁵. Le DC hanno anche un ruolo fondamentale nella regolazione dell'omeostasi cutanea. Le DC che migrano dal derma ai linfonodi in condizioni omeostatiche trasportano antigeni sequestrati cutanei con lo scopo di indurre tolleranza alle cellule T principalmente attraverso la differenziazione di cellule T regolatorie (Treg) specifiche per gli antigeni cutanei ^6-8.

Le cellule T rappresentano la popolazione più abbondante di cellule immunitarie nella pelle. Non solo si infiltrano nella pelle durante un'infezione, ma rappresentano anche una popolazione stabile tra i linfociti residenti nella pelle ^9,10. Sia le cellule T CD8⁺ che quelle CD4⁺ risiedono nella pelle e, a seguito di un'infezione, possono rispondere molto prima che le cellule T effettrici vengano reclutate dal sangue. Nella cute, inoltre, risiede una popolazione di Treg residenti nei tessuti in grado di mantenere la tolleranza verso gli antigeni cutanei e l'omeostasi tissutale. Queste cellule si attivano rapidamente e potentemente dopo l'esposizione al loro antigene affine e sono state quindi definite come Tregs della memoria ^11,12.

Insieme alle DC e alle cellule T, molte cellule immunitarie innate, come le cellule NK, le cellule T gamma delta, le ILC ¹³ del gruppo 2, i mastociti e i macrofagi, popolano la pelle e contribuiscono alla protezione dell'ospite. Per analizzare un ambiente così complesso, è obbligatorio ottenere sospensioni di singole cellule da campioni cutanei con elevata efficienza, preservando allo stesso tempo l'espressione di marcatori di superficie per l'analisi citofluorimetrica a flusso o il sorting.

La pelle murina presenta uno strato epidermico esterno, costituito principalmente da cheratinociti, cellule di Langerhans e cellule T epidermiche dendritiche; e lo strato dermico sottostante. Il derma ospita la maggior parte delle cellule immunitarie ed è costituito da una matrice extracellulare in cui le fibre di collagene sono le più abbondanti, in particolare il collagene-I e il collagene-IV. A differenza della pelle umana, la pelle del topo è ricoperta di pelliccia e quindi più popolata da follicoli piliferi. È, inoltre, molto più sottile della pelle umana e contiene uno strato muscolare, il pannicolo carnoso, che aiuta la guarigione delle ferite ¹⁴. Queste caratteristiche rendono più difficile interrompere in modo efficiente la rete di collagene del derma al fine di espellere le cellule immunitarie.

In questo articolo forniamo un metodo adatto per digerire la matrice extracellulare che si basa su un cocktail di collagenasi 1 e 2 ad alta purezza e termolisina. Inoltre, poiché l'analisi della pelle di diverse regioni richiede diverse procedure sperimentali, mostreremo diversi metodi per ottenere in modo efficiente campioni di pelle dal piede, dalla coda, dall'orecchio e dal tronco. Etichetteremo quindi i campioni per valutare la presenza di DC (MHCII⁺CD11c⁺CD45⁺), macrofagi (CD11b⁺F4/80⁺CD45⁺), cellule T CD8⁺ e CD4⁺.

Protocollo

approvazione studio: I protocolli sperimentali sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano (Roma, Italia) secondo il Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 "Attuazione della Direttiva n. 86/609 / CEE in materia di Protezione degli Animali utilizzati a Fini Sperimentali o ad Altri Fini scientifici."

1. Ottenere campioni di pelle

1. Eutanasia il mouse per dislocazione cervicale.
2. Orecchio:
   1. Tagliare la parte senza peli delle orecchie del mouse.
   2. dorsali separate e lato ventrale tirandole a pezzi con una pinza. Rimuovere eventuali residui cartilagini raschiando delicatamente la parte interna delle orecchie con una pinza.
3. la pelle del tronco:
   1. Shave tutta la pelle dell'animale, sia con un rasoio elettrico e con delicata crema depilatoria.
   2. Tagliare il campione di pelle desiderata (da 2 cm ² fino a tutta la pelle animale).
      1. Se tagliare l'intera dorsale e ventrale mouse pelle, fare un taglio verticale nel mezzo del mouse avanti e poi tagliare lungo i confini delle zone rasate intorno al corpo del mouse.
      2. separare delicatamente la pelle dal peritoneo e muscoli della schiena, mantenendo il campione di pelle ancora con le pinze, mentre separa il campione di pelle con la punta bordi arrotondati chiuso di un forbici chirurgiche o un bisturi.
   3. Preparare una piastra di coltura cellulare 100 millimetri contenente 10 ml di ghiaccio freddo PBS.
   4. Eliminare il grasso sottocutaneo immergendo il campione di pelle in PBS nel piatto preparato al punto 1.3.3 e raschiando il campione di pelle con una pinza.
4. Coda:
   1. Tagliare la coda del mouse.
   2. Effettuare un taglio verticale sulla coda con forbici chirurgiche o bisturi chirurgico, a partire dalla base della coda e raggiungendo alla punta della coda.
   3. Utilizzare pinze per staccare la pelle dalla coda. Afferrare il bordo del taglio alla base della coda e tirare leggermente verso la punta tenendo lacorpo della coda con una pinza.
   4. Rimuovere il grasso in eccesso raschiando delicatamente il campione di pelle.
5. footpad
   1. Tagliare tutto il piede del mouse con le forbici chirurgiche. Evitando il taglio di qualsiasi pelle pelosa.
   2. Tagliare la pelle del piede longitudinalmente dalla caviglia fino all'inizio delle cifre.
   3. Tenere le ossa della caviglia con una pinza oppure a mano mentre afferra la pelle con una pinza e tirare la pelle verso le cifre come se togliersi un guanto.

2. Digestione

1. Preparare il cocktail digestione dalla soluzione madre (preparata come in Materials List) con la seguente ricetta: Enzyme mix (vedi Materiali Lista per le specifiche) 300 mg / ml, DNAse1 50 U / ml. Diluire in RPMI 5% FBS.
2. Tritare campioni di pelle con le forbici in piccoli pezzi in un piatto 35 millimetri Petri con 2 ml di digestione cocktail (Per la pelle del tronco: 2 ml di digestione cocktail ogni 2 cm ² di pelle, fino a 3 ml totale).
3. Incubare a 37 ° C per 90 min. Agitare delicatamente la piastra di Petri 1-2 volte durante l'incubazione.
4. Versare campioni di pelle digeriti su un filtro 70 micron cella 66 millimetri Petri contenenti 1 ml di RPMI1640 5% FBS.
5. Lavare il filtro con 5 ml di RPMI 1640 5% FBS.
6. Comprimere il campione attraverso il filtro cella con uno stantuffo della siringa.
7. stantuffo Flush, capsula di Petri e il filtro con 20 ml di RPMI1640 5% FBS, trasferimento in tubo da 50 ml.

3. Anticorpi ed etichettatura

1. Lavare la sospensione ottenuta due volte con 5 ml di PBS 1% FBS (o BSA).
2. Etichetta la sospensione cellulare ottenuta con gli anticorpi desiderati.
   1. Risospendere i campioni in 100 ml / campione di una miscela contenente 2 mg / ml di aCD16 / CD32 (2.4G2 clone) diluito in PBS 1% FBS.
   2. Incubare per 15 minuti a 4 ° C per bloccare il legame non specifico degli anticorpi desiderati attraverso i recettori Fc.
   3. Aggiungere gli anticorpi indicati nella tabella1.
      1. Preparare una miscela diluendo gli anticorpi desiderati in 100 microlitri / campione di PBS 1% FBS ad una concentrazione di 4 mg / ml.
      2. Aggiungere 100 microlitri della miscela preparata in passaggio 3.2.3.1 per ciascun campione in modo che nel tubo, ci sarà un volume di 200 ml di miscela di anticorpi ad una concentrazione finale di 2 mg / ml.
   4. Incubare per 30 minuti a 4 ° C e coprire dalla luce.
3. Lavare con 1 ml di PBS 1% FBS, centrifugare per 5 minuti a 400 xg, scartare il surnatante e risospendere in 300 ml di PBS 1% FBS.
4. Aggiungere DAPI ad una concentrazione finale di 2 mg / ml e incubare a 4 ° C, al riparo dalla luce per 10 min.
5. Analizzare i campioni ottenuti da FACS.
   1. Per isolare leucociti, utilizzare la seguente strategia di gating:
      1. In primo luogo eliminare eventuali cellule morte dalla gating sulla popolazione DAPI-.
      2. Selezionare le canottiere nel FSC-A vs plot FSC W come indicato in figura 1 .
      3. Porta le cellule in base alle dimensioni e la granularità tipica dei leucociti di interesse.
      4. Selezionare CD45 + cellule nel-A FSC plot CD45 come indicato in Figura 1.
   2. Distinguere le differenti popolazioni di leucociti mediante l'espressione di marcatori di superficie come segue:
      1. Identificare DC come II cellule ⁺ CD11c ⁺ MHC. Questi possono essere successivamente analizzati per l'espressione del CD207 di distinguere le cellule di Langerhans e CD207 + Dermal DC da CD207- Dermal DC.
      2. Identificare macrofagi come / 80 + cellule CD64 + F4.
      3. Identificare le cellule B come cellule CD19 + MHCII +.
      4. Identificare le cellule T CD8 + come o cellule CD4 +.

Risultati

Pelle dalla diversa regione del corpo è stato digerito secondo il protocollo descritto e colorati con gli anticorpi indicati. La strategia di gating è rappresentato nella Figura 1. In primo luogo selezionare cellule vive (cellule DAPI-), poi porta il canottiere (FSC-A vs FSC-W) e su cellule con linfociti morfologia (FSC-A vs SSC-A). Quando indicato, vengono selezionate le cellule CD45 ⁺ di origine ematopoietiche.

Discussione

Abbiamo descritto un metodo per la preparazione di sospensioni monocellulari da diverse regioni cutanee mouse. Il metodo della digestione abbiamo adottato, non solo dà alte rese, ma conserva anche l'espressione dei marcatori di superficie, che è fondamentale per la successiva analisi FACS.

L'uso di un cocktail di collagenasi I e II e termolisina, garantisce lotto minima per differenze lotti nell'attività enzimatica rendendo questo metodo altamente riproducibile. Altri metodi pubb...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagents
Integrato RPMI 1640 medium			RPMI1640 integrato con L-glu, penna-streptococco senza beta mercapto etanolo
PBS
FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)	Roche	5401119001	risospensione [2,5  mg/ml] in dH2O; Conservare le aliquote a -20  ° C
Dnase I	Sigma	D4263-1VL	risospensione in RPMI 1640 senza siero [1.000  U/ml]
Materials
Forbici
Pinze
Bisturi chirurgici Piastre
			Petri da 35 mm
Piastre di Petri da 66 mm Piastre
			da 100 mm
70 µ m Filtri cellulari	BD	352350
Cocktail di digestione			Diluire in RPMI 5%
FBS LIberase TM			300 µ g/ml
DNAse1			50 U/ml
Antibodies
Name	Company	Clone	Label
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC