Articolo metodologico

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

DOI:

10.3791/52607

⸱

24 marzo 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine III, RWTH University-Hospital Aachen, 2IZKF Aachen Core Facility "Two-Photon Imaging", RWTH University-Hospital Aachen, 3Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery, RWTH Aachen University, 4Institute for Pharmacology, RWTH University-Hospital Aachen

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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L'imaging intravitale stabile ad alta risoluzione delle cellule immunitarie nel fegato è impegnativo. Qui forniamo un metodo altamente sensibile e affidabile per studiare la migrazione e le interazioni cellula-cellula delle cellule immunitarie nel fegato di topo per lunghi periodi (circa 6 ore) mediante microscopia a scansione laser multifotone intravitale in combinazione con il monitoraggio della terapia intensiva.

Abstract

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Fegato infiammazione come risposta al danno è un processo altamente dinamico che coinvolge l'infiltrazione di distinti sottotipi di leucociti tra cui monociti, neutrofili, sottogruppi di cellule T, cellule B, natural killer (NK) e le cellule NKT. Microscopia intravitale del fegato per monitorare la migrazione delle cellule immunitarie è particolarmente difficile a causa degli elevati requisiti per quanto riguarda la preparazione del campione e la fissazione, risoluzione ottica e animale sopravvivenza a lungo termine. Tuttavia, la dinamica dei processi infiammatori così come studi di interazione cellulare potrebbe fornire informazioni fondamentali per comprendere meglio l'iniziazione, la progressione e la regressione della malattia epatica infiammatoria. Pertanto, un metodo altamente sensibile ed affidabile è stato istituito per studiare migrazione e cellula-cellula-interazioni di diverse cellule immunitarie in fegato di topo per lunghi periodi (circa 6 ore) di intravitale due fotoni microscopia a scansione laser (TPLSM) in combinazione con terapia intensiva monitoraggio. ent "> Il metodo fornito comprende una preparazione dolce e fissazione stabile del fegato con il minimo turbamento dell'organo; di imaging intravitale lungo termine utilizzando la microscopia multicolor multiphoton praticamente senza photobleaching o effetti fototossici per un periodo di tempo massimo di 6 ore, consentendo il monitoraggio di specifici sottoinsiemi di leucociti, e le condizioni di imaging stabile a causa monitoraggio estensivo di topo parametri vitali e la stabilizzazione della circolazione, la temperatura e lo scambio di gas.

Per studiare la migrazione dei linfociti su infiammazione del fegato CXCR6.gfp knock-in topi sono stati sottoposti a esami del fegato intravitale in condizioni basali e dopo danno epatico acuto e cronico indotto da un'iniezione intraperitoneale (s) di tetracloruro di carbonio (CCL 4).

CXCR6 è un recettore per chemochine espressi sui linfociti, soprattutto su Natural Killer T (NKT) -, Natural Killer (NK) - e sottoinsiemi di linfociti T come le cellule T CD4 ma anche Associ mucoseATED invariante cellule (MAIT) T 1. Seguendo il modello migratorio e il posizionamento di CXCR6.gfp + cellule immunitarie permesso una visione dettagliata del loro comportamento alterato sul danno epatico e quindi il loro potenziale coinvolgimento nella progressione della malattia.

Introduzione

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La visualizzazione delle cellule e funzioni cellulari di organi interi o persino interi organismi è stato di grande interesse per più di 50 anni, tra cui quasi tutte le parti del corpo 2. Pertanto, alcuni primi studi già impiegati l'imaging intravitale del fegato 3,4. Tuttavia, alcune limitazioni esistono aggiornati riguardo a lungo termine ad alta risoluzione stabile di imaging di tessuto epatico.

A causa della posizione anatomica del fegato in stretto contatto con il diaframma e il tratto gastrointestinale 5, il problema più comune per l'imaging microscopico intravitale è movimento dovuto alla respirazione e, in misura minore, peristaltica del tratto intestinale 6. In confronto ad altri organi solidi, chirurgia epatica è particolarmente impegnativo. A causa della struttura microvascolare densa, manipolazione chirurgica può portare a massicce lesioni emorragiche, alterata microcircolazione 7 e anche l'attivazione di residente icellule mmune come le cellule di Kupffer 8. Pertanto, fissaggio meccanico del tessuto come pubblicato altrove 6,9 rischia di interferire con imaging microscopia intravitale.

In un fegato sano, 10-15% del volume totale del sangue risiede all'interno del sistema vascolare del fegato, e l'organo riceve circa il 25% della gittata cardiaca complessiva 10, rendendo l'organo altamente sensibili alle variazioni di circolazione (ad esempio, variazioni di pressione sanguigna ). Di conseguenza, le interruzioni nel flusso epatico causa ad esempio, shear stress, spostamento, lesioni da uso eccessivo tessuto o circolazione centralizzata porterà ad alterazioni artificiali in leucociti comportamento migratorio, ridotta ossigenazione del fegato e quindi ulteriori danni al fegato, che colpisce fegato risposte immunitarie come pure come conservazione dell'organo e la durata complessiva dell'animale.

I primi studi microscopici erano basati su mi epifluorescenza intravitalemicroscopia, ma molti vincoli tecnici, quali foto sbiancamento e la profondità di penetrazione bassa limitano l'uso di questa tecnica per il lungo termine l'imaging del fegato 4,11,12. Con lo sviluppo della microscopia multiphoton nel 1990, le limitazioni della foto sbianca o profondità di penetrazione erano principalmente risolti, come questo nuovo metodo era tecnicamente in grado di svolgere studi di imaging in quasi tutti gli organi sotto situazioni reali 13-15. Tuttavia, le principali sfide rimanenti rispetto all'imaging fegato sono stati: i movimenti del respiro, autofluorescenza di tessuto epatico, che fissano inalterato il flusso di sangue nelle sinusoidi epatici, e di imaging particolarmente stabile per un periodo di diversi hr 16 più lunghi.

Anche se diversi studi hanno affrontato la funzione e la migrazione dei vari leucociti nel fegato 17, ad esempio, NKT cellule 18-20, le cellule T 21,22, i macrofagi del fegato 23,24 o neutrofili 25, a lungo termine multiphoton mImaging icroscopy non era ancora stato stabilito con successo, un compito ancora più impegnativo in animali affetti da malattia epatica acuta o cronica a causa dei danni esistente e quindi maggiore suscettibilità a ulteriori danni 26. Tuttavia, il monitoraggio comportamento migratorio e la funzione cellulare dei leucociti nel fegato in tempo reale consente nuove intuizioni nel loro ruolo specifico nella omeostasi del fegato e malattie 27.

Il CXCR6 recettore delle chemochine è espresso in diverse sottopopolazioni linfocitarie, tra cui natural killer (NK), le cellule NKT e alcune popolazioni di cellule T 18,28. Precedenti studi sui topi hanno indicato che CXCR6 e la sua CXCL16 ligando affine possono controllare il pattugliamento delle cellule NKT su sinusoidi del fegato durante l'omeostasi. Di conseguenza, l'uso di topi CXCR6.gfp (portando un knock-in della proteina fluorescente verde [GFP] nel locus CXCR6) è stata descritta per studiare la migrazione dei linfociti in vari organi come il cervello 29e anche il fegato 18,20, mostrando aumento infiltrazione di cellule CXCR6.gfp su infiammazione.

Con il metodo fornito in questo studio è stato possibile seguire questi processi per un lungo periodo di tempo in condizioni stabilizzate. La procedura basata multiphoton intravitale permesso di imaging che era altamente riproducibile con il minimo turbamento dell'animale e l'organo; ottimizzata per il lungo termine animali sopravvivenza da un ampio monitoraggio seguito da vicino il controllo della respirazione e della circolazione; e altamente flessibile e facile da adottare anche ad altri organi parenchimatosi come il rene, milza.

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Protocollo

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NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la normativa tedesca in materia di studi sugli animali in seguito alla 'Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio "(pubblicazione NIH, 8 ° edizione, 2011) e la direttiva 2010/63 / UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (Gazzetta ufficiale dell'Unione europea, 2010). Permesso ufficiale è stata concessa dal governativa cura degli animali e uso ufficio (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Germania).

NOTA: I passaggi che possono essere omessi per l'imaging a breve termine (ad esempio, scattare colpi, 3-D pile o anche breve durata microscopia time-lapse) sono contrassegnati con un asterisco (*) per ridurre i tempi di preparazione e semplificare il protocollo chirurgico. Imaging può anche venire eseguito senza ampio controllo e monitoraggio circolazione se necessario, tuttavia, il tempo di sopravvivenza sarà notevolmente ridotto.

1. Setup Microscopio e Pre-chirurgia Preparazione (5-10 kmn)

  1. Sistema Accendere (microscopio, potere Lab, laser, rilievo di riscaldamento, camera climatica, web cam, dispositivo pompa a siringa, respiratore).
  2. Collegare O 2 alimentazione isoflurano vapore e impostare il livello Isoflurano al 1,5 Vol% (v / v), la connessione a un piccolo respiratore animali.
    1. Per l'imaging a breve termine, a mantenere l'anestesia con isoflurano solo dopo l'induzione dell'anestesia iniziale ip (vedi punto 2.2). Quindi utilizzare 2 Vol% (v / v) isoflurano, e tenere il tempo di imaging di sotto di 2 ore per garantire la stabilità microcircolazione fegato.
  3. La respirazione a 120-140 cicli respiratori / min Set con un volume di 150-200 ml.
  4. Impostare palco del mouse agarosio. Preparare 100 ml di 3% (w / v) agarosio, versando in un piatto (di circa 10 cm x 15 cm base) con un angolo di 40 °.
  5. Impostare area di lavoro chirurgica raccogliere la strumentazione necessaria. Per prevenire l'infezione microbica, disinfettare strumenti utilizzando una soluzione all'1% di Sekusept Forte S (9,9% w / v), Glutaral 9,8% w / v, Formaldeide per 5 minuti prima dell'esperimento (Figura 1A).
  6. Ottenere rimanenti componenti: disinfettante della pelle (ad esempio, 10% di soluzione di povidone iodio), fegato (fase pile e bridge), soluzione di agarosio (3% (w / v) in PBS), pompa a siringa con 5% (w / v) soluzione di glucosio (G-5), pompa a siringa con soluzione anestetica I (ketamina 0,1 mg / ml, Xilazina 0,5 mg / ml, fentanil 5 mg / ml), tamponi di cotone, n-butil-2-Cyanoacrylat, e 1x PBS. Mettere piatto fase agarosio nella camera di incubazione per il preriscaldamento.

2. tracheotomia (10-15 min)

  1. Utilizzare C57BL / 6 topi da casa da riproduzione di almeno 25-28 g. Casa topi in condizioni specifiche esenti da organismi patogeni, in conformità con le linee guida FELASA, in un ambiente a temperatura e umidità controllata con 12 ore di luce / 12 hr ciclo scuro. Consentire animali l'accesso gratuito alla dieta standard topi (Sniff standard roditore Diet) e acqua ad libitum.
  2. Anestetizzare il mouse initial intraperitoneale (ip) iniezione di 250 microlitri della soluzione di anestetico II (ketamina 0,1 mg / ml, Xilazina 1 mg / ml, Buprenorfina 10 mcg / ml).
    1. * Per manutenzione durante l'imaging intravitale, continuamente amministrare soluzione anestetica I di iniezione continua ip (ketamina 0,1 mg / ml, Xilazina 0,5 mg / ml, fentanil 5 mg / ml) utilizzando un dispositivo pompa a siringa con una portata di 0,2 ml / hr in combinazione con inalazione isoflurano 0,5 Vol% (v / v).
    2. Controllare riflessi dopo 5 min (es pizzico zampe con le pinze), disinfettare la pelle per tracheotomia, iniziare la preparazione se il mouse è in stato di anestesia chirurgica tollerante.
    3. Applicare occhio crema protettiva (ad esempio, Dexpantenolo 50 mg / g) per evitare di cornea si secchi (Figura 1B).
  3. Fissare il mouse sulla tabella di preparazione esporre lato ventrale con del nastro adesivo per le estremità; tirare troppo delicatamente collo, fissare in questa posizione, ad es., usando un elastico agganciato to gli incisivi.
    1. Disinfettare la pelle e la pelliccia con una soluzione di iodio povidone, applicando il disinfettante con un batuffolo di cotone.
  4. Eseguire il taglio della pelle iniziale (0,5-1 cm di lunghezza) direttamente sotto il mento (Figura 1C)
    1. Sezionare con cura il tessuto connettivo tra ghiandole salivari (Figura 1D).
    2. Attenzione allo strappo aperto muscolare tubo circostante trachea (Figura 1E, F).
  5. Mettere filo chirurgico sotto la trachea per dopo tubo di ventilazione fissaggio (Figura 1G).
    1. Aprire trachea con micro-forbici tra gli anelli cartilaginei che svolgono una incisione a forma di T (Figura 1 H)
  6. Inserire tubo di ventilazione nella trachea attraverso l'incisione (~ 0.5 cm). Per spingere il tubo in avanti, afferrare fine caudale con piccole pinze anatomiche e far avanzare delicatamente il tubo nella trachea (Figura 1I)
  7. Fissare il tubo con filo chirurgico (es , 5-0) con filo inserito nel passo 2.5 un nodo intorno tubo all'interno della trachea; effettuare secondo fissaggio craniale del tubo alla pelle per evitare accidentali depositioning (Figura 1J, K).
  8. Taglio Seal con colla tissutale (ad esempio, n-butil-2-Cyanoacrylat) (Figura 1L).
  9. Fissare il tubo alla testa con del nastro adesivo.

3. laparotomia (15-20 min)

  1. Posizionare il mouse sul tappetino di riscaldamento per evitare l'ipotermia. Shave addome, rimuovere con attenzione i capelli dalla pelle. Disinfettare la pelle rasata e pelliccia utilizzando una soluzione di iodio povidone.
  2. Eseguire una piccola pelle tagliata sotto lo sterno con le forbici chirurgiche (Figura 2a). Estendere il taglio lateralmente sotto le costole su entrambi i lati, cauterizzare tutti i vasi sanguigni visibili per prevenire le emorragie.
  3. Eseguire accuratamente un piccolo taglio alla linea alba sotto lo sterno, aprendo il peritoneo (Figura 2B). Estendere il taglio di entrambi i lati con cauterizzione per prevenire le emorragie (Figura 2C, D).
  4. Posizionare il mouse nel piatto fase agarosio (Figura 2E). Inserire pile di altezza adeguata su entrambi i lati del mouse (solitamente 12-14 coprioggetto) (Figura 2F).
  5. Posizionare sensore di trigger respiratorio sotto parte superiore della schiena per sincronizzare il microscopio con la respirazione. Attivare unità di innesco (Figura 2G).
  6. Mettere filo chirurgico (5-0) con lo sterno di ritrattare costole (Figura 2i).
  7. Tagliare con cautela legamento che collega il fegato e il diaframma (Legamento falciforme), così come il fegato e il tratto gastrointestinale con le forbici chirurgiche curve. Tagliare il legamento falciforme verso l'aorta (Figura 2J).

4. Configurazione di esempio (10-15 min)

  1. Posizionare il mouse sul lato destro con un angolo di 45 ° per un facile accesso al grande lobo epatico.
  2. Aggiungere scena ponte sotto le costole, che copre il addominalecavità. Fabbricazione un ponte utilizzando un vetrino di serie con rivestimento del nastro adesivo per coprire spigoli vivi (Figura 2K).
  3. Luogo grande lobo epatico sul palco. Scivolare delicatamente doppia sfera della sonda stilo o una spatola imbottita sotto il fegato e tenere la parte superiore dell'organo con un tampone di cotone bagnato o tessuto bagnato. Sollevare lobo sul vetrino e applicare gentile trascinare. Lobe può essere piegato o piegata. Fornire attenzione a solo delicata manipolazione del fegato (Figura 2L).
  4. Posizionare pali laterali di supporto, ad esempio, pile di piccoli slittamenti di copertura (20 mm x 20 mm), pari a circa la stessa altezza del lobo epatico accanto ad essa per sostenere vetrino.
  5. Mettere grande vetrino (24 mm x 50 mm) sul lobo epatico. Assicurarsi che la copertura di slittamento è orientato più orizzontale possibile (Figura 2M).
    NOTA: Il vetrino deve essere in contatto con il tessuto senza schiacciarla. Verificare la presenza di segni visibili di compromissione del flusso sanguigno (tessuto bianco). Se MICROCIRClamento è perturbato, aggiungere ulteriore supporto pali.
  6. * Inserire due cateteri intraperitoneali indipendenti (Figura 2N) per l'anestesia a lungo termine e G-5 applicazione. Installare cateteri lateralmente nel basso addome accanto agli arti posteriori.
    NOTA: I cateteri intraperitoneale possono essere fatto da sé, collegando 27 aghi G con tubi in silicone flessibile (Figura 3).
  7. * Fixate ago con un anello di 5-0 filo chirurgico alla pelle per evitare spostamenti accidentali.
  8. * Collegare pompa a siringa con soluzione di anestesia I CATETERE 1, portata impostato a 0,2 ml / h; collegare pompa a siringa con G-5 a catetere 2, portata impostato a 0,1 ml / h.

5. Monitoraggio mouse

  1. * Elettrodi ECG posto in estremità anteriore e posteriori (figura 4a).
  2. * Collegare il tubo di scadenza di CO 2 sensore di livello.
  3. Aggiungi il sensore di temperatura esterna collegata al pad di calore (Figura 4C).

6. Integrazione e Tissue Fixation (5-10 min)

  1. Preparare 100 ml di 3% (w / v) agarosio in 1X PBS. Incorpora fegato quando la temperatura è a 41 ° C con una siringa da 5 ml e un ago da 18 G (Figura 5A).
  2. Versare agarosio rimanente sul coprioggetto e intorno al mouse (Figura 5B, C). Attendere fino agarosio è completamente gelatinizzato.
  3. Rimuovere agarosio in eccesso con la spatola Heidemann, la preparazione di un Viewfield abbastanza grande per eseguire la scansione del lobo epatico predisposto (Figura 5D, E).

7. Imaging

  1. Trasferire il mouse nella camera microscopio clima.
  2. Aggiungere 50-100 ml di PBS 1x (preriscaldata a 37 ° C).
  3. Coprire piatto del campione per evitare l'evaporazione (figura 5F).
  4. * Ridurre isoflurano inalazione al 0,5 Vol% (v / v).
  5. * Avviare il software di monitoraggio, la registrazione ECG, frequenza cardiaca e CO 2 espiratorio.
  6. Inizio di imaging: aprire lapersiane ser, identificano i campi di vista di interesse, definiscono limite superiore e inferiore per Z-stack, e avviare la registrazione lasso di tempo. Regolare Z-stack, se necessario, correggere Z-drift (ad es. A causa di cambiamenti nella pressione sanguigna o la variazione di temperatura, Figura (5G).
    NOTA: Al termine del periodo di imaging o se la circolazione o anestesia degli animali diventa instabile, sacrificare i topi da dislocazione cervicale (senza risveglio dall'anestesia).

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Risultati

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Per convalidare il nostro approccio TPLSM intravitale, abbiamo sottoposto CXCR6 GFP / + topi per l'imaging intravitale TPLSM. I topi sono stati o non trattata come controlli di base o sottoposti a una singola iniezione intraperitoneale di tetracloruro di carbonio (CCL 4) per indurre un danno epatico acuto 20.

Le sequenze video sono state scattate in un periodo di tempo di 2-5 ore, e le cellule sono state tracciate nel corso del tempo a causa della loro fluore...

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Discussione

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Lo scopo del nostro studio è stato quello di sviluppare un metodo altamente standardizzato, stabile e riproducibile per l'imaging intravitale TPLSM del fegato. Imaging intravitale in generale ha dato preziose informazioni sul comportamento cellulare in condizioni di vita reale seguenti homing e l'interazione di diverse popolazioni di leucociti nello sviluppo, omeostasi e la malattia. Tuttavia, la posizione anatomica piuttosto impegnativa del fegato, a causa della quale respiratorio e movimento intestinale perist...

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Dichiarazioni

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Gli autori non rivelano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano la struttura Central Animal dell'Ospedale Universitario di Aquisgrana per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) e dal Centro interdisciplinare per la ricerca clinica (IZKF) di Aquisgrana. Questo lavoro è stato ulteriormente supportato dalla Core Facility "Two-Photon Imaging", una struttura centrale del Centro interdisciplinare per la ricerca clinica (IZKF) di Aquisgrana all'interno della Facoltà di Medicina dell'Università RWTH di Aquisgrana.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anestetici
BuprenorfinaEssex Pharma997.00.00Analgeticum, 0,1 mg/kg
FentanylRotex Medicacarica: 30819
Sistema di anestesia FluovacApparecchio Harvard34-1030
Glucosio 5%Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporizzatoreEickemeyer4802885
IsofluranoForene AbbottB 506
Isotonico (0,9%) Soluzione di NaClDeltaSelect GmbHPZN 00765145
Ketamin 10%cevaCarica: 36217/09
Xilazina 2%medistarCarica: 04-03-9338/23
Forniture
20 ml SiringaBD Plastipak
250 ml Erlenmeyer palloneSchott Duran21 226 36
25 ml Becher 2xSchott Duran50-1150
siringa da 2 mlBD Plastipak
4-0 Vicryl suturaEthiconV7980
Agarosiodisponibile
Bepanthen Eye e Unguento per il nasoBayer Vital GmbH6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe Kit per cauterizzazione ad alta temperaturaFine Science Tools Inc.18010-00
Tamponi di garza di cotoneFuhrmann GmbH32014
Vetrino coprioggetto 24x50 mmROTH1871
Nastro di seta Durapore3M1538-1
Bisturi monouso Feather02.001.30.011
Tubo in polietilene a foro fine 0,58 mm IDSmiths medical800/100/200
HistoacrylBraun10500525x 0,5 ml
LeukoplastBSN Medical Inc.
Vetrini per microscopioROTH1879
Poly-Alcohol Haut… farblos AntiseptticumAntisepttica GmbH72PAH200
Ago Sterican 18 G x 1B. Braun304622
Ago Sterican 27 3/4 G x 1B. Braun4657705
Carta velinadisponibile
Strumenti
Bruniscitore in amalgama 3PLGatz0110?
Divaricatori Blair (4 punte (smussato)) x2Storz& KleinS-01134
Dumont No.7 pinzeFine Science Tools Inc.91197-00
Pinza Graefe curva x1Fine Science Tools Inc.11151-10
Pinza Graefe dritta x2Fine Science Tools Inc.11050-10
Spatola Heidemann HD2Stomia2030.00
Porta aghi MathieuFine Science Tools Inc.12010-14
ForbiceFine Science Tools Inc.14074-11
Pinza SemkenFine Science Tools Inc.11008-13
Piccole forbici chirurgiche curve FineScience Tools Inc.14029-10
Piccole forbici chirurgiche dritte FineScience Tools Inc.14028-10
Pinze modello standardFine Science Tools Inc.11000-12
Forbici a molla VannasFine Science Tools Inc.15000-08
Apparecchiatura
ECG Trigger UnitRapid Biomedical3000003686
MICROCAPSTAR Analizzatore di anidride carbonica di fine espirazioneStrumenti
Minivent Typ 845Apparecchio Harvard73-0043
Microscopio multifotone Trimscope ILaVision
Perfusor CompactB. Braun
PowerLab 8/30 registratore a 8 canaliAD InstrumentsPL3508
Termoforo a temperatura controllataSygonix26857617
Sensore di temperaturadisponibile
Sistema a temperatura controllata per microscopi -Cube& Servizi
di materiali di consumoin commercioin commerciochirurgici AD in commercio di imaging Box Life

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
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