L'applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare

La virulenza di molti batteri patogeni Gram-negativi dipende sistemi di secrezione specializzati di dirottare cellule ospiti eucariotiche. I batteri usano questi sistemi di secrezione di iniettare proteine ​​di virulenza batterica (effettori) nella cellula ospite per modulare una varietà di attività cellulari e biochimici. Lo studio delle proteine ​​effettrici ha fornito non solo straordinario di approfondire alcuni temi fondamentali della ospitanti / patogeno, ma anche nella biologia di base delle cellule eucariotiche ^1. Modulazione dell'apoptosi cellula ospite ha dimostrato di essere un meccanismo di virulenza importante per molti patogeni intracellulari, e un certo numero di proteine ​​effettrici modulazione dell'apoptosi sono stati identificati ^2-9. Tuttavia, i loro precisi meccanismi molecolari dell'attività rimangono sfuggente in molti casi.

L'apoptosi, una forma di morte cellulare programmata, svolge un ruolo importante nella risposta immunitaria all'infezione ^10. Due vie principali che portano alla apoptosi averestati individuati: mira i mitocondri (apoptosi intrinseca) o trasduzione diretta del segnale tramite i recettori di morte cellulare a livello della membrana plasmatica (apoptosi estrinseca). Il percorso di morte cellulare intrinseca o mitocondri-mediata è innescato da segnali intracellulari e prevede l'attivazione di Bax e Bak, due membri pro-apoptotici della famiglia di Bcl-2. Questa famiglia è composta da proteine ​​regolatore pro- ed anti-apoptotici che controllano la morte cellulare ^11-14. Attivazione di apoptosi porta a oligomerizzazione di Bax e Bak seguiti da successiva permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale, con conseguente rilascio del citocromo c nel citoplasma. Rilascio del citocromo C avvia attivazione delle caspasi effettrici 3 e 7, attraverso l'attivazione della caspasi 9 nella apoptosoma ^15. Questo porta alla proteolisi di substrati selezionate che, tra l'altro, si traduce nella esposizione della fosfatidilserina sulla superficie cellulare ¹⁶ e libera un DNasi dedicato che frammenta chromatin ^17,18.

Al fine di determinare se all'interno della cascata apoptotica una proteina effettore individuo interferisce, un sistema di espressione inducibile è stato impiegato ^19. I sistemi di regolamentazione per l'espressione condizionale di transgeni sono stati uno strumento prezioso nell'analisi funzione di una proteina all'interno della cellula o la sua importanza per il tessuto, organo e organismo sviluppo, così come durante l'iniziazione, progressione e manutenzione della malattia ^20-23. Tipicamente, i sistemi di controllo inducibili, come il sistema Tet ²⁴ impiegato qui, formano una unità di trascrizione artificiale (vedi Figura 1). Un componente è un fattore di trascrizione artificialmente ingegnerizzato chiamato tTA (tetraciclina-dipendente trascrizione attivatore), formata dalla fusione della trascrizione repressore batterico TetR ²⁵ ad un dominio proteine ​​di mammiferi che media l'attivazione trascrizionale o silenziamento ^24,26. Il secondo componente è un ibridopromoter, chiamato TRE (elemento tetraciclina-sensibile), costituito da un promotore minimo eucariotico, contenente almeno un TATA-box e un sito inizio della trascrizione, unita a più ripetizioni del sito di legame al DNA cognate per TetR, teto ^24,25. Il terzo componente è il ligando naturale TetR, tetraciclina o uno dei suoi derivati, come anhydrotetracycline o doxiciclina ^25. Su ligando aggiunta al mezzo di coltura, TetR perde la sua affinità per této e dissocia dal TRE. Come risultato, la trascrizione del gene bersaglio è abolito. Espressione del transgene può, pertanto, essere strettamente controllata in maniera tempo e dose-dipendente sia in coltura cellulare e in animali ^20,23,24. Con tTA, espressione del transgene verifica costitutivamente, se non in presenza di tetraciclina. Questo può essere uno svantaggio nello studio delle proteine ​​citotossiche o oncogeniche perché tetraciclina deve prima essere rimosso dal sistema, prima transgene expression verifica e gli effetti della proteina bersaglio sulla cellula può essere monitorato. Questo può richiedere molto tempo e non è sempre completa, soprattutto negli animali transgenici ^27. Per affrontare questa limitazione, un mutante TetR con una risposta inversa alla presenza di doxiciclina stato utilizzato per generare un nuovo fattore di trascrizione, rtTA (reverse tTA) ^28. Si lega solo al TRE e, contemporaneamente, attiva la trascrizione in presenza di doxiciclina. Leakiness residua del sistema, cioè., L'espressione del transgene in assenza del fattore di trascrizione TRE-bound, originario sia (i) da effetti di posizione in un sito di integrazione genomica, (ii) dal TRE sé ^29, o (iii) da non -specific legame di tTA / rtTA ^28, è stata affrontata introducendo un silenziatore trascrizionale aggiuntivo, denominato TTS (tetraciclina-dipendente silenziatore trascrizionale) ³⁰ al sistema. Si forma una rete dual regolatore insieme rtTA (vedi Figura 1).In assenza di doxiciclina TTS si lega a TRE e attivamente spegne qualsiasi trascrizione rimanente. In presenza di doxiciclina, TTS dissocia da TRE e rtTA si lega contemporaneamente inducendo l'espressione del gene bersaglio. Questo ulteriore livello di rigorosità è spesso necessario per esprimere proteine ​​citotossiche altamente attivi ^31-34.

L'utilizzo di questo sistema a doppia regolazione strettamente controllata, la cascata apoptotica può essere iniziato con una fase definita che consente l'analisi di se la data proteina effettrici può interferire con l'induzione di apoptosi. Questo metodo non può essere utilizzato solo per studiare l'attività anti-apoptotica di proteine ​​effettrici batteriche, ma anche per l'espressione inducibile di proteine ​​pro-apoptotica o tossici, o per dissezione interferenze con altre vie di segnalazione.

1. Generazione di linee cellulari stabili che esprimono la proteina di interesse

1. Preparare i media con l'aggiunta di FCS inattivato al calore e 1% penicillina / streptomicina per commercialmente disponibile Dulbecco's Modificato (DMEM) supplementato con Glutamax-I, piruvato, e 4,5 g / l D-glucosio.
2. Coltivare cellule HEK293 in mezzi a 37 ° C in 5% CO _2. Sub-coltivare cellule ogni tre giorni. Rimuovere la carta e sospendere nuovamente le cellule in 15 ml di mezzi freschi. Pipettare 1 ml in un nuovo 75 centimetri ^{a 2} celle pallone di coltura e aggiungere 14 ml media.
3. Analizzare il numero di cella utilizzando un emocitometro.
4. Seed HEK293 cellule in un 6-pozzetti ad una densità di 2 x 10 ⁵ cellule per pozzetto e incubare per 24 ore.
5. Per la trasfezione utilizzare il protocollo fornito dal produttore del reagente di trasfezione. Trasfezione cellule con pEGFP-C2 o pEGFP-C2-CAEB utilizzando il reagente di trasfezione. Prima dell'uso, scaldare la REAG trasfezioneent e il supporto richiesto per RT. Utilizzare un rapporto 3: 1 di reagente di trasfezione di DNA.
   1. Nel dettaglio, pipetta 1,5 ml di reagente di trasfezione direttamente in 50 ml di medio DMEM privo di siero. Per la formazione del complesso, pipettare 0,5 mg di DNA codifica GFP o GFP-Caeb alla miscela reagente contenente trasfezione e incubare per 15 minuti a RT.
   2. Trasfettare cellule aggiungendo alla miscela di reazione in maniera goccia a goccia e incubare a 37 ° C in 5% CO ₂ per 24 ore.
6. Aggiungere 1 mg / ml geneticina per la selezione di cloni GFP-positive a 37 ° C in 5% CO _2.
7. Dopo 6 giorni, isolare le cellule singole mediante citofluorimetria classificare in una piastra a 96 pozzetti ospitare medie e HEK293 supernatante in un rapporto 1: 1. Generare HEK293 supernatante da coltura cellule confluenti HEK293 che sono stati centrifugati per 15 min a 4966 x g.
8. Il giorno seguente, sostituire terreno di coltura con terreno contenente 1.50; mg / ml geneticina. Modificare i media una volta alla settimana. Se le cellule formano un monostrato confluente, trasferirli ad una piastra da 24 pozzetti. Sub-coltivare cellule due volte alla settimana in un rapporto di 1: 5 in mezzi contenenti 1,5 mg / ml geneticina. Infine, analizzare la percentuale di cellule GFP-positive mediante analisi immunoblot e citometria a flusso.

2. Analisi di linee cellulari stabili di Analisi Immunoblot

1. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule aderito una volta con caldo PBS. Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone campione 2x Laemmli, calore per 5 min a 95 ° C e conservare a -20 ° C.
2. Caricare circa 4 x 10 ⁴ cellule per campione su un gel SDS-PAGE 12%. Inoltre, carico 6 ml di una scala commerciale proteine ​​come marcatore di peso molecolare. Eseguire gel in un sistema di elettroforesi in gel con una tensione costante di 180 V per 45-60 min con 1x Laemmli tampone di corsa.
3. Proteine ​​macchia su membrane PVDF (dimensione dei pori di 0.45 micron) ad una tensione costante di 16 V per 60 minuti utilizzando un Trans-Blot SD Semi-Dry Cell Transfer.
4. Membrane blocchi in 10 ml di latte secco non grasso 5% in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) per 1 ora a RT.
5. Diluire 4 ml di anticorpo anti-GFP in 4 ml di MPT e incubare le membrane O / N a 4 ° C.
6. Eseguire tre fasi di lavaggio 10 min con 10 ml di PBS / 0.05% Tween 20.
7. Incubare membrane con 0,8 ml di anticorpi secondari perossidasi coniugata in 4 ml di MPT.
8. Dopo 1 ora di incubazione a RT, lavare membrane tre volte con PBS / 0,05% Tween 20 (come descritto in 2.6) e rilevare l'attività di perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Applicare equipaggiamento standard per lo sviluppo di pellicole di visualizzare bande proteiche.

3. Analizzare le cellule utilizzando un citometro di flusso.

1. Risospendere le cellule in PBS. Utilizzare cellule HEK293 come controllo negativo per regolare in avanti scAtter (FSC) e side scatter (SSC), in modo che le cellule sono in scala. Disegnare un cancello sulla cellule viventi escludendo doppietti cellulari, inerti e detriti cellulari.
2. Regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) guadagno in modo che le cellule non colorate sono all'estrema sinistra dell'istogramma per il canale FL1 (488 nm laser argon).
3. Per analizzare l'intensità di fluorescenza delle cellule HEK293-GFP e HEK293-GFP-CAEB aprire l'istogramma del canale FL1 e acquisire 10.000 eventi sulla popolazione recintato.
4. Analizzare i dati utilizzando FACS commerciali software di analisi.

4. Transfection della linea cellulare stabile con il inducibile Expression System Vector

1. Cellule HEK293 Seed esprimono stabilmente GFP o GFP-Caeb in un 12-pozzetti ad una densità di 1 x 10 ⁵ cellule / pozzetto.
2. 19 hr post-semina, co-trasfezione delle cellule con regolatore plasmide e risposta plasmide codificante sia Bax o caspasi attivate 3.
   1. Co-trasfezione le cellule stabili HEK293con 100 ng di pWHE125-P regolatore plasmide (Figura 2) e 100 ng del plasmide risposta pWHE655-hBax o pWHE655-revCasp3 (Figura 3) e 0,4 ml di polyethylenimine.
   2. Preparare il DNA e polyethylenimine reagente trasfezione ciascuno in 75 ml di Opti-MEM e incubare per esattamente 5 minuti a temperatura ambiente. Per la formazione del complesso, incubare entrambi miscele insieme per 15 minuti a RT.
3. Aggiungere la soluzione polyethylenimine / DNA goccia a goccia per le cellule e incubare a 37 ° C in 5% CO _2.

5. induzione di apoptosi

1. 5 ore dopo la trasfezione, inducono l'espressione delle proteine ​​pro-apoptotiche mediante aggiunta di 1 ug / ml di doxiciclina al terreno di coltura. Incubare le cellule per 18 ore a 37 ° C in 5% CO _2.

6. Analisi della Cell Host Apoptosis da Analysis Immunoblot

1. Ispezionare le cellule prima di harvesting sotto il microscopio ottico per controllare per l'induzione della morte cellulare. Le cellule apoptotiche sono rilevabili dalla presenza di corpi apoptotici circondano la morte cellulare.
2. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule aderito una volta con caldo PBS. Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone campione 2x Laemmli, calore per 5 min a 95 ° C e conservare a -20 ° C.
3. Caricare circa 4 x 10 ⁴ cellule per campione su un gel SDS-PAGE 12%. Inoltre, carico 6 ml di una scala commerciale proteine ​​come marcatore di peso molecolare. Eseguire gel in un sistema di elettroforesi in gel con una tensione costante di 180 V per 45-60 min con 1x Laemmli tampone di corsa.
4. Proteine ​​macchia su membrane PVDF (dimensione dei pori di 0,45 micron) ad una tensione costante di 16 V per 60 minuti con un Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cellulare.
5. Membrane blocchi in 10 ml di latte secco non grasso 5% in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) per 1 ora a RT.
6. Diluire 4 μl di anticorpo anti-spaccati poli ADP-ribosio polimerasi (PARP) in 4 ml di MPT e incubare O / N a 4 ° C.
7. Eseguire tre fasi di lavaggio 10 min con 10 ml di PBS / 0.05% Tween 20.
8. Incubare membrane con 0,8 microlitri rafano perossidasi-coniugato anticorpo secondario diluito in 4 ml MPT.
9. Dopo 1 ora di incubazione a RT, lavare membrane tre volte con PBS / 0,05% Tween 20 (come descritto in 6.7) e rilevare l'attività di perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Applicare equipaggiamento standard per lo sviluppo di pellicole di visualizzare bande proteiche.
10. Rimuovere gli anticorpi legati da 30 minuti di incubazione a RT con 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
11. Dopo tre lavaggi con PBS / Tween 20 0,05% (come descritto in 6.7), sondare le membrane con 4 ml di anticorpo anti-actina in 4 ml di MPT O / N a 4 ° C.
12. Dopo tre lavaggi con MPT (come descritto in 6.7), incubare le membrane con 0,8 ml di hoanticorpi secondari rseradish perossidasi coniugato diluiti in 4 ml di MPT.
13. Dopo 1 ora di incubazione a RT, lavare membrane tre volte con PBS / 0,05% Tween 20 (come descritto in 6.7 e rilevare l'attività di perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Applicare attrezzature standard per lo sviluppo della pellicola di visualizzare bande proteiche.
    Nota: Tutte le incubazioni sono state eseguite su un agitatore per il tempo indicato e la temperatura.

In primo luogo, sono stati stabiliti linee cellulari HEK293 esprimenti stabilmente la proteina di interesse (Caeb) come una proteina di fusione GFP-. Come controllo, sono stati generati anche linee cellulari HEK293 che esprimono stabilmente GFP. L'espressione di GFP e GFP-CAEB è stata verificata mediante analisi immunoblot. L'immunoblot rappresentante (figura 4A) dimostra espressione stabile e chiaramente rilevabile di GFP e GFP-CAEB. Tuttavia, questo test non è in grado di determinare se tutte le cellule esprimono GFP o GFP-CAEB. Pertanto, le linee cellulari HEK293 stabilmente transfettate sono stati analizzati anche mediante citometria a flusso. Come mostrato in Figura 4B, oltre il 90% delle cellule in entrambe le linee cellulari espresso GFP. Così, queste linee cellulari stabili possono essere utilizzati per analizzare ulteriormente la funzione di Caeb. Nella fase successiva, l'attività anti-apoptotica di Caeb è stato analizzato mediante analisi immunoblot usando un anticorpo contro PARP spaccati. Scissione proteolitica di PARP nucleare inattiva attività di riparazione del DNA ed è un indicatore tipico del termile fasi finali del apoptosi. La scissione di PARP non viene rilevato in HEK293-GFP o cellule HEK293-GFP-CAEB, dimostrando che né l'espressione di GFP, nè di GFP-CAEB è tossico per le cellule. Tuttavia, quando le cellule sono state trattate con staurosporina, un potente induttore di apoptosi intrinseca, clivaggio di PARP è stato rilevato (Figura 5). È importante sottolineare che le cellule HEK293-GFP-CAEB mostrare una ridotta scissione di PARP, che indica l'attività anti-apoptotica del Coxiella burnetii tipo IV sistema di secrezione delle proteine ​​effettrici CAEB 7.

Per analizzare a che punto CAEB interferisce con il processo apoptotico, il sistema Tet-On è stato impiegato. In particolare, le cellule HEK293-GFP o HEK293-GFP-Caeb sono state trasfettate con un plasmide che esprime costitutivamente regolatore duplice repressore configurazione doxiciclina controllato / attivatore (figura 2) e una codifica PTRE risposta plasmide sia piena lunghezza Bax umana o forma attivata caspasi 3 umana, definito revCasp 3 (Figura 3). Questo sistema è strettamente regolata, come dimostrato dalla mancanza di PARP sotto non indurre condizioni (Figura 6). L'aggiunta di doxiciclina alle cellule trasfettate portato alla espressione di Bax o revCasp 3. Se Caeb interferisce con la via apoptotica valle di Bax, allora il segnale apoptotico generato dall'espressione e successiva attivazione di Bax deve essere bloccato mediante espressione Caeb. Infatti, le cellule HEK293 che esprimono stabilmente GFP-CAEB profondamente inibiscono l'induzione di apoptosi da espressione Bax doxiciclina controllato, mentre le cellule HEK293-GFP visualizzati evidente PARP scissione. Questo risultato indica che l'induzione Caeb blocchi apoptosi valle dell'attivazione Bax. Successivamente, si è analizzato se CAEB può interferire con l'attivazione della caspasi 3 - un evento in ritardo nel percorso apoptotico. Cellule HEK293-GFP, così come le cellule HEK293-GFP-CAEB, mostre PARP scissione (Figura 6), indicando che una volta che la caspasi effettrici 3 è activated, CAEB non può impedire l'apoptosi si verifichi. Nel loro insieme, questi dati dimostrano che CAEB agisce tra Bax e caspasi 3 attivazione.

Figura 1. Schema del sistema di regolamentazione tetraciclina. Il sistema Tet-On è composto da due plasmidi diversi, i plasmidi di regolamentazione e di risposta. Il plasmide normativo codifica l'transsilencer Tet-reattiva (TTS; cerchio pieno) e la transattivatore inverso Tet-reattiva (rtTA, aperto cerchio). Entrambe le proteine ​​sono costitutivamente espresse sotto il controllo del forte, costitutiva allungamento fattore-1 alfa promotore (P EF-1a). TTS e rtTA sono fattori trascrizionali chimerici costituiti da un dominio eucariotico trascrizionale di regolamentazione (silenziatore o un attivatore, rispettivamente) e un repressore tetraciclina batterica (TetR). TetR media legame al DNA a sette tet (této) sequenze sul plasmide risposta. této si trova a monte del promotore minimo inducibile citomegalovirus (CMV P), insieme formano l'elemento Tet-reattiva (TRE). In condizioni non induce, TTS è destinata a TRE prevenire espressione. Dopo l'aggiunta di doxiciclina (Dox; diamante pieno), rtTA interagisce con Dox che porta a cambiamenti conformazionali e l'attivazione. Attivato rtTA sostituisce TT sul plasmide risposta, consentendo la trascrizione dei geni rispettivo bersaglio Bax e caspasi 3, determinando in tal modo l'induzione di apoptosi e morte cellulare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Schema del plasmide pWHE125 normativo. Elementi essenziali per la propagazione in bacteria, compresa una origine di replicazione (ori PBR) e una cassetta di resistenza antibiotica contro ampicillina (Amp R), e per l'espressione dei Tet-transregulators, come il forte, costitutiva immediato precoce promotore / enhancer del citomegalovirus umano (P / E HCMV), un sito interno ribosoma vincolante da polio-virus (PV-IRES) e un polyA-sito da virus Simian 40 (SV40 polyA) vengono visualizzati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Schema del plasmide risposta. Elementi essenziali per la propagazione in batteri, tra un'origine di replicazione (ori PBR) e una cassetta di resistenza antibiotica (Amp R), e per l'espressione inducibile in eucarioti, come il transgene expressisulla cassetta con il promotore Tet-dipendente minimal TREtight (P TREtight), il gene di interesse umano Bax (hBax) e un sito polyA da virus Simian 40 (SV40 polyA), sono raffigurati. La cassetta di espressione del transgene è affiancato da tandem ripetizioni dirette di due copie del HS4 core sequenza isolante pollo (nucleo HS4). Inoltre, una cassetta di resistenza G418, rappresentati da un murino fosfoglicerato chinasi 1 promoter (P MPGK), una resistenza gene neomicina (G418 R) e di un sito polyA timidina chinasi umana (TK polyA) è presente. Cliccare qui per vedere una versione più grande questa cifra.

Figura 4. HEK293-GFP e HEK293-GFP-CAEB stabilmente esprimono proteine ​​fluorescenti verdi. (A) lisati Whole-cellulari di HEK293-GFP eCellule HEK293-GFP-CAEB sono stati immunoblotted per GFP mostrare espressione stabile. (B) citometria a flusso Rappresentante (FACS) analisi dei HEK293-GFP e le cellule HEK293-GFP-CAEB è mostrato per dimostrare l'intensità dell'espressione GFP. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Effetti della espressione di GFP-CAEB sull'apoptosi staurosporina-indotta. HEK293-GFP e le cellule HEK293-GFP-CAEB sono stati trattati con 4 mM staurosporina per 6 ore di indurre apoptosi intrinseco. L'apoptosi è stata analizzata da spaccati analisi PARP immunoblot. PARP scissione è stata ridotta in cellule HEK293-GFP-CAEB rispetto alle cellule HEK293-GFP. Clicca qui per vedere una versione più grandedi questa figura.

Figura 6. L'utilizzo del sistema di Teton a restringere il punto d'azione di CAEB. (A) L'apoptosi è stata indotta dalla espressione di Bax in HEK293-GFP e le cellule HEK293-GFP-CAEB. L'apoptosi è stata analizzata da spaccati analisi PARP immunoblot. PARP scissione è stata ridotta in cellule HEK293-GFP-CAEB rispetto alle cellule HEK293-GFP. (B) L'apoptosi è stata indotta dalla espressione di revCasp 3 in HEK293-GFP e le cellule HEK293-GFP-CAEB. L'apoptosi è stata analizzata da spaccati analisi PARP immunoblot. PARP scissione era paragonabile in cellule HEK293-GFP-CAEB e HEK293-GFP. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.