Il metodo qui descritto viene utilizzato per indurre la cascata di segnalazione apoptotica a passi definiti al fine di sezionare l'attività di una proteina effettrice batterica anti-apoptotica. Questo metodo può essere utilizzato anche per l'espressione inducibile di proteine pro-apoptotiche o tossiche, o per l'interferenza di dissezione con altre vie di segnalazione.
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Articolo metodologico
L'applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tecnica qui presentata consente di analizzare in cui il passaggio a proteina bersaglio, o in alternativa una piccola molecola, interagisce con i componenti di un percorso di segnalazione. Il metodo si basa, da un lato, l'espressione inducibile di una proteina specifica per avviare un evento di segnalazione ad un passo definito e predeterminato nella cascata di segnalazione selezionato. Espressione concomitante, invece, del gene di interesse quindi permette al ricercatore di valutare se l'attività della proteina bersaglio espressa si trova a monte oa valle della manifestazione segnalazione avviato, in funzione della lettura del percorso di segnalazione che si ottiene. Qui, la cascata apoptotica è stata selezionata come una via di segnalazione definito per dimostrare la funzionalità del protocollo. I batteri patogeni, come Coxiella burnetii, traslocare proteine effettrici che interferiscono con l'induzione della morte della cellula ospite nella cellula ospite per garantire la sopravvivenza dei batteri nella cella e di promuovere la lorodiffusione nell'organismo. Le C. proteine effettrici burnetii CAEB inibisce efficacemente la morte della cellula ospite dopo l'induzione di apoptosi con luce UV o con staurosporina. Per restringere in cui passo CAEB interferisce con la propagazione del segnale apoptotico, proteine selezionate con ben caratterizzato l'attività pro-apoptotica sono stati espressi transitoriamente in maniera doxiciclina inducibile. Se CAEB agisce a monte di queste proteine, l'apoptosi procederà senza ostacoli. Se CAEB agisce a valle, la morte cellulare sarà inibito. Le proteine di prova prescelti erano Bax, che agisce a livello dei mitocondri e caspasi 3, che è il principale proteasi esecutore. CAEB interferisce con la morte cellulare indotta da espressione Bax, ma non da caspasi 3 espressione. CAEB, pertanto, interagisce con la cascata apoptotica tra queste due proteine.
Introduzione
La virulenza di molti batteri patogeni Gram-negativi dipende sistemi di secrezione specializzati di dirottare cellule ospiti eucariotiche. I batteri usano questi sistemi di secrezione di iniettare proteine di virulenza batterica (effettori) nella cellula ospite per modulare una varietà di attività cellulari e biochimici. Lo studio delle proteine effettrici ha fornito non solo straordinario di approfondire alcuni temi fondamentali della ospitanti / patogeno, ma anche nella biologia di base delle cellule eucariotiche 1. Modulazione dell'apoptosi cellula ospite ha dimostrato di essere un meccanismo di virulenza importante per molti patogeni intracellu....
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Protocollo
1. Generazione di linee cellulari stabili che esprimono la proteina di interesse
- Preparare i media con l'aggiunta di FCS inattivato al calore e 1% penicillina / streptomicina per commercialmente disponibile Dulbecco's Modificato (DMEM) supplementato con Glutamax-I, piruvato, e 4,5 g / l D-glucosio.
- Coltivare cellule HEK293 in mezzi a 37 ° C in 5% CO 2. Sub-coltivare cellule ogni tre giorni. Rimuovere la carta e sospendere nuovamente le cellule in 15 ml di mezzi freschi. Pipettare 1 ml in un nuovo 75 centimetri a 2 celle pallone di coltura e aggiungere 14 ml media.
- Analizzare il numero di cella utilizzando u....
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Risultati
In primo luogo, sono stati stabiliti linee cellulari HEK293 esprimenti stabilmente la proteina di interesse (Caeb) come una proteina di fusione GFP-. Come controllo, sono stati generati anche linee cellulari HEK293 che esprimono stabilmente GFP. L'espressione di GFP e GFP-CAEB è stata verificata mediante analisi immunoblot. L'immunoblot rappresentante (figura 4A) dimostra espressione stabile e chiaramente rilevabile di GFP e GFP-CAEB. Tuttavia, questo test non è in grado di determinare se tutte .......
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Discussione
Molti batteri patogeni porto sistemi di secrezione di secernere o traslocare proteine effettrici batteriche nella cellula ospite. Queste proteine effettrici hanno la capacità di modulare i processi e percorsi nella cellula ospite, permettendo ai batteri di sopravvivere e replicare quanto di rispettiva nicchia intracellulare. Comprendere le attività biochimiche e dei meccanismi molecolari delle proteine effettrici contribuirà ad una migliore comprensione di patogenicità e può aiutare a sviluppare nuovi strumenti te.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) attraverso la Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) ad A.L. e C.B., e attraverso l'ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polietilenimina | Poliscieni | 23966 | |
| Doxiciclina | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| Membrana | PVDFMillipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-scissione PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actina | Sigma Aldrich | A2066 | |
| IgG di topo (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| IgG di coniglio (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| Substrato di blotting occidentale ECL | Thermo Scientific | 32106 | |
| Tampone di strippaggio Western Blot Restore Plus | Thermo Scientific | 46428 |
Riferimenti
- Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death member....
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Ristampe e permessi
