Method Article

L'applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare

DOI:

10.3791/52903

⸱

June 25th, 2015

 ,  ,  , 
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo qui descritto viene utilizzato per indurre la cascata di segnalazione apoptotica a passi definiti al fine di sezionare l'attività di una proteina effettrice batterica anti-apoptotica. Questo metodo può essere utilizzato anche per l'espressione inducibile di proteine pro-apoptotiche o tossiche, o per l'interferenza di dissezione con altre vie di segnalazione.

Abstract

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La tecnica qui presentata consente di analizzare in cui il passaggio a proteina bersaglio, o in alternativa una piccola molecola, interagisce con i componenti di un percorso di segnalazione. Il metodo si basa, da un lato, l'espressione inducibile di una proteina specifica per avviare un evento di segnalazione ad un passo definito e predeterminato nella cascata di segnalazione selezionato. Espressione concomitante, invece, del gene di interesse quindi permette al ricercatore di valutare se l'attività della proteina bersaglio espressa si trova a monte oa valle della manifestazione segnalazione avviato, in funzione della lettura del percorso di segnalazione che si ottiene. Qui, la cascata apoptotica è stata selezionata come una via di segnalazione definito per dimostrare la funzionalità del protocollo. I batteri patogeni, come Coxiella burnetii, traslocare proteine ​​effettrici che interferiscono con l'induzione della morte della cellula ospite nella cellula ospite per garantire la sopravvivenza dei batteri nella cella e di promuovere la lorodiffusione nell'organismo. Le C. proteine ​​effettrici burnetii CAEB inibisce efficacemente la morte della cellula ospite dopo l'induzione di apoptosi con luce UV o con staurosporina. Per restringere in cui passo CAEB interferisce con la propagazione del segnale apoptotico, proteine ​​selezionate con ben caratterizzato l'attività pro-apoptotica sono stati espressi transitoriamente in maniera doxiciclina inducibile. Se CAEB agisce a monte di queste proteine, l'apoptosi procederà senza ostacoli. Se CAEB agisce a valle, la morte cellulare sarà inibito. Le proteine ​​di prova prescelti erano Bax, che agisce a livello dei mitocondri e caspasi 3, che è il principale proteasi esecutore. CAEB interferisce con la morte cellulare indotta da espressione Bax, ma non da caspasi 3 espressione. CAEB, pertanto, interagisce con la cascata apoptotica tra queste due proteine.

Introduction

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La virulenza di molti batteri patogeni Gram-negativi dipende sistemi di secrezione specializzati di dirottare cellule ospiti eucariotiche. I batteri usano questi sistemi di secrezione di iniettare proteine ​​di virulenza batterica (effettori) nella cellula ospite per modulare una varietà di attività cellulari e biochimici. Lo studio delle proteine ​​effettrici ha fornito non solo straordinario di approfondire alcuni temi fondamentali della ospitanti / patogeno, ma anche nella biologia di base delle cellule eucariotiche 1. Modulazione dell'apoptosi cellula ospite ha dimostrato di essere un meccanismo di virulenza importante per molti patogeni intracellulari, e un certo numero di proteine ​​effettrici modulazione dell'apoptosi sono stati identificati 2-9. Tuttavia, i loro precisi meccanismi molecolari dell'attività rimangono sfuggente in molti casi.

L'apoptosi, una forma di morte cellulare programmata, svolge un ruolo importante nella risposta immunitaria all'infezione 10. Due vie principali che portano alla apoptosi averestati individuati: mira i mitocondri (apoptosi intrinseca) o trasduzione diretta del segnale tramite i recettori di morte cellulare a livello della membrana plasmatica (apoptosi estrinseca). Il percorso di morte cellulare intrinseca o mitocondri-mediata è innescato da segnali intracellulari e prevede l'attivazione di Bax e Bak, due membri pro-apoptotici della famiglia di Bcl-2. Questa famiglia è composta da proteine ​​regolatore pro- ed anti-apoptotici che controllano la morte cellulare 11-14. Attivazione di apoptosi porta a oligomerizzazione di Bax e Bak seguiti da successiva permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale, con conseguente rilascio del citocromo c nel citoplasma. Rilascio del citocromo C avvia attivazione delle caspasi effettrici 3 e 7, attraverso l'attivazione della caspasi 9 nella apoptosoma 15. Questo porta alla proteolisi di substrati selezionate che, tra l'altro, si traduce nella esposizione della fosfatidilserina sulla superficie cellulare 16 e libera un DNasi dedicato che frammenta chromatin 17,18.

Al fine di determinare se all'interno della cascata apoptotica una proteina effettore individuo interferisce, un sistema di espressione inducibile è stato impiegato 19. I sistemi di regolamentazione per l'espressione condizionale di transgeni sono stati uno strumento prezioso nell'analisi funzione di una proteina all'interno della cellula o la sua importanza per il tessuto, organo e organismo sviluppo, così come durante l'iniziazione, progressione e manutenzione della malattia 20-23. Tipicamente, i sistemi di controllo inducibili, come il sistema Tet 24 impiegato qui, formano una unità di trascrizione artificiale (vedi Figura 1). Un componente è un fattore di trascrizione artificialmente ingegnerizzato chiamato tTA (tetraciclina-dipendente trascrizione attivatore), formata dalla fusione della trascrizione repressore batterico TetR 25 ad un dominio proteine ​​di mammiferi che media l'attivazione trascrizionale o silenziamento 24,26. Il secondo componente è un ibridopromoter, chiamato TRE (elemento tetraciclina-sensibile), costituito da un promotore minimo eucariotico, contenente almeno un TATA-box e un sito inizio della trascrizione, unita a più ripetizioni del sito di legame al DNA cognate per TetR, teto 24,25. Il terzo componente è il ligando naturale TetR, tetraciclina o uno dei suoi derivati, come anhydrotetracycline o doxiciclina 25. Su ligando aggiunta al mezzo di coltura, TetR perde la sua affinità per této e dissocia dal TRE. Come risultato, la trascrizione del gene bersaglio è abolito. Espressione del transgene può, pertanto, essere strettamente controllata in maniera tempo e dose-dipendente sia in coltura cellulare e in animali 20,23,24. Con tTA, espressione del transgene verifica costitutivamente, se non in presenza di tetraciclina. Questo può essere uno svantaggio nello studio delle proteine ​​citotossiche o oncogeniche perché tetraciclina deve prima essere rimosso dal sistema, prima transgene expression verifica e gli effetti della proteina bersaglio sulla cellula può essere monitorato. Questo può richiedere molto tempo e non è sempre completa, soprattutto negli animali transgenici 27. Per affrontare questa limitazione, un mutante TetR con una risposta inversa alla presenza di doxiciclina stato utilizzato per generare un nuovo fattore di trascrizione, rtTA (reverse tTA) 28. Si lega solo al TRE e, contemporaneamente, attiva la trascrizione in presenza di doxiciclina. Leakiness residua del sistema, cioè., L'espressione del transgene in assenza del fattore di trascrizione TRE-bound, originario sia (i) da effetti di posizione in un sito di integrazione genomica, (ii) dal TRE sé 29, o (iii) da non -specific legame di tTA / rtTA 28, è stata affrontata introducendo un silenziatore trascrizionale aggiuntivo, denominato TTS (tetraciclina-dipendente silenziatore trascrizionale) 30 al sistema. Si forma una rete dual regolatore insieme rtTA (vedi Figura 1).In assenza di doxiciclina TTS si lega a TRE e attivamente spegne qualsiasi trascrizione rimanente. In presenza di doxiciclina, TTS dissocia da TRE e rtTA si lega contemporaneamente inducendo l'espressione del gene bersaglio. Questo ulteriore livello di rigorosità è spesso necessario per esprimere proteine ​​citotossiche altamente attivi 31-34.

L'utilizzo di questo sistema a doppia regolazione strettamente controllata, la cascata apoptotica può essere iniziato con una fase definita che consente l'analisi di se la data proteina effettrici può interferire con l'induzione di apoptosi. Questo metodo non può essere utilizzato solo per studiare l'attività anti-apoptotica di proteine ​​effettrici batteriche, ma anche per l'espressione inducibile di proteine ​​pro-apoptotica o tossici, o per dissezione interferenze con altre vie di segnalazione.

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Protocol

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1. Generazione di linee cellulari stabili che esprimono la proteina di interesse

  1. Preparare i media con l'aggiunta di FCS inattivato al calore e 1% penicillina / streptomicina per commercialmente disponibile Dulbecco's Modificato (DMEM) supplementato con Glutamax-I, piruvato, e 4,5 g / l D-glucosio.
  2. Coltivare cellule HEK293 in mezzi a 37 ° C in 5% CO 2. Sub-coltivare cellule ogni tre giorni. Rimuovere la carta e sospendere nuovamente le cellule in 15 ml di mezzi freschi. Pipettare 1 ml in un nuovo 75 centimetri a 2 celle pallone di coltura e aggiungere 14 ml media.
  3. Analizzare il numero di cella utilizzando un emocitometro.
  4. Seed HEK293 cellule in un 6-pozzetti ad una densità di 2 x 10 5 cellule per pozzetto e incubare per 24 ore.
  5. Per la trasfezione utilizzare il protocollo fornito dal produttore del reagente di trasfezione. Trasfezione cellule con pEGFP-C2 o pEGFP-C2-CAEB utilizzando il reagente di trasfezione. Prima dell'uso, scaldare la REAG trasfezioneent e il supporto richiesto per RT. Utilizzare un rapporto 3: 1 di reagente di trasfezione di DNA.
    1. Nel dettaglio, pipetta 1,5 ml di reagente di trasfezione direttamente in 50 ml di medio DMEM privo di siero. Per la formazione del complesso, pipettare 0,5 mg di DNA codifica GFP o GFP-Caeb alla miscela reagente contenente trasfezione e incubare per 15 minuti a RT.
    2. Trasfettare cellule aggiungendo alla miscela di reazione in maniera goccia a goccia e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 24 ore.
  6. Aggiungere 1 mg / ml geneticina per la selezione di cloni GFP-positive a 37 ° C in 5% CO 2.
  7. Dopo 6 giorni, isolare le cellule singole mediante citofluorimetria classificare in una piastra a 96 pozzetti ospitare medie e HEK293 supernatante in un rapporto 1: 1. Generare HEK293 supernatante da coltura cellule confluenti HEK293 che sono stati centrifugati per 15 min a 4966 x g.
  8. Il giorno seguente, sostituire terreno di coltura con terreno contenente 1.50; mg / ml geneticina. Modificare i media una volta alla settimana. Se le cellule formano un monostrato confluente, trasferirli ad una piastra da 24 pozzetti. Sub-coltivare cellule due volte alla settimana in un rapporto di 1: 5 in mezzi contenenti 1,5 mg / ml geneticina. Infine, analizzare la percentuale di cellule GFP-positive mediante analisi immunoblot e citometria a flusso.

2. Analisi di linee cellulari stabili di Analisi Immunoblot

  1. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule aderito una volta con caldo PBS. Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone campione 2x Laemmli, calore per 5 min a 95 ° C e conservare a -20 ° C.
  2. Caricare circa 4 x 10 4 cellule per campione su un gel SDS-PAGE 12%. Inoltre, carico 6 ml di una scala commerciale proteine ​​come marcatore di peso molecolare. Eseguire gel in un sistema di elettroforesi in gel con una tensione costante di 180 V per 45-60 min con 1x Laemmli tampone di corsa.
  3. Proteine ​​macchia su membrane PVDF (dimensione dei pori di 0.45 micron) ad una tensione costante di 16 V per 60 minuti utilizzando un Trans-Blot SD Semi-Dry Cell Transfer.
  4. Membrane blocchi in 10 ml di latte secco non grasso 5% in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) per 1 ora a RT.
  5. Diluire 4 ml di anticorpo anti-GFP in 4 ml di MPT e incubare le membrane O / N a 4 ° C.
  6. Eseguire tre fasi di lavaggio 10 min con 10 ml di PBS / 0.05% Tween 20.
  7. Incubare membrane con 0,8 ml di anticorpi secondari perossidasi coniugata in 4 ml di MPT.
  8. Dopo 1 ora di incubazione a RT, lavare membrane tre volte con PBS / 0,05% Tween 20 (come descritto in 2.6) e rilevare l'attività di perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Applicare equipaggiamento standard per lo sviluppo di pellicole di visualizzare bande proteiche.

3. Analizzare le cellule utilizzando un citometro di flusso.

  1. Risospendere le cellule in PBS. Utilizzare cellule HEK293 come controllo negativo per regolare in avanti scAtter (FSC) e side scatter (SSC), in modo che le cellule sono in scala. Disegnare un cancello sulla cellule viventi escludendo doppietti cellulari, inerti e detriti cellulari.
  2. Regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) guadagno in modo che le cellule non colorate sono all'estrema sinistra dell'istogramma per il canale FL1 (488 nm laser argon).
  3. Per analizzare l'intensità di fluorescenza delle cellule HEK293-GFP e HEK293-GFP-CAEB aprire l'istogramma del canale FL1 e acquisire 10.000 eventi sulla popolazione recintato.
  4. Analizzare i dati utilizzando FACS commerciali software di analisi.

4. Transfection della linea cellulare stabile con il inducibile Expression System Vector

  1. Cellule HEK293 Seed esprimono stabilmente GFP o GFP-Caeb in un 12-pozzetti ad una densità di 1 x 10 5 cellule / pozzetto.
  2. 19 hr post-semina, co-trasfezione delle cellule con regolatore plasmide e risposta plasmide codificante sia Bax o caspasi attivate 3.
    1. Co-trasfezione le cellule stabili HEK293con 100 ng di pWHE125-P regolatore plasmide (Figura 2) e 100 ng del plasmide risposta pWHE655-hBax o pWHE655-revCasp3 (Figura 3) e 0,4 ml di polyethylenimine.
    2. Preparare il DNA e polyethylenimine reagente trasfezione ciascuno in 75 ml di Opti-MEM e incubare per esattamente 5 minuti a temperatura ambiente. Per la formazione del complesso, incubare entrambi miscele insieme per 15 minuti a RT.
  3. Aggiungere la soluzione polyethylenimine / DNA goccia a goccia per le cellule e incubare a 37 ° C in 5% CO 2.

5. induzione di apoptosi

  1. 5 ore dopo la trasfezione, inducono l'espressione delle proteine ​​pro-apoptotiche mediante aggiunta di 1 ug / ml di doxiciclina al terreno di coltura. Incubare le cellule per 18 ore a 37 ° C in 5% CO 2.

6. Analisi della Cell Host Apoptosis da Analysis Immunoblot

  1. Ispezionare le cellule prima di harvesting sotto il microscopio ottico per controllare per l'induzione della morte cellulare. Le cellule apoptotiche sono rilevabili dalla presenza di corpi apoptotici circondano la morte cellulare.
  2. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule aderito una volta con caldo PBS. Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone campione 2x Laemmli, calore per 5 min a 95 ° C e conservare a -20 ° C.
  3. Caricare circa 4 x 10 4 cellule per campione su un gel SDS-PAGE 12%. Inoltre, carico 6 ml di una scala commerciale proteine ​​come marcatore di peso molecolare. Eseguire gel in un sistema di elettroforesi in gel con una tensione costante di 180 V per 45-60 min con 1x Laemmli tampone di corsa.
  4. Proteine ​​macchia su membrane PVDF (dimensione dei pori di 0,45 micron) ad una tensione costante di 16 V per 60 minuti con un Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cellulare.
  5. Membrane blocchi in 10 ml di latte secco non grasso 5% in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) per 1 ora a RT.
  6. Diluire 4 μl di anticorpo anti-spaccati poli ADP-ribosio polimerasi (PARP) in 4 ml di MPT e incubare O / N a 4 ° C.
  7. Eseguire tre fasi di lavaggio 10 min con 10 ml di PBS / 0.05% Tween 20.
  8. Incubare membrane con 0,8 microlitri rafano perossidasi-coniugato anticorpo secondario diluito in 4 ml MPT.
  9. Dopo 1 ora di incubazione a RT, lavare membrane tre volte con PBS / 0,05% Tween 20 (come descritto in 6.7) e rilevare l'attività di perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Applicare equipaggiamento standard per lo sviluppo di pellicole di visualizzare bande proteiche.
  10. Rimuovere gli anticorpi legati da 30 minuti di incubazione a RT con 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
  11. Dopo tre lavaggi con PBS / Tween 20 0,05% (come descritto in 6.7), sondare le membrane con 4 ml di anticorpo anti-actina in 4 ml di MPT O / N a 4 ° C.
  12. Dopo tre lavaggi con MPT (come descritto in 6.7), incubare le membrane con 0,8 ml di hoanticorpi secondari rseradish perossidasi coniugato diluiti in 4 ml di MPT.
  13. Dopo 1 ora di incubazione a RT, lavare membrane tre volte con PBS / 0,05% Tween 20 (come descritto in 6.7 e rilevare l'attività di perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Applicare attrezzature standard per lo sviluppo della pellicola di visualizzare bande proteiche.
    Nota: Tutte le incubazioni sono state eseguite su un agitatore per il tempo indicato e la temperatura.

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Results

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In primo luogo, sono stati stabiliti linee cellulari HEK293 esprimenti stabilmente la proteina di interesse (Caeb) come una proteina di fusione GFP-. Come controllo, sono stati generati anche linee cellulari HEK293 che esprimono stabilmente GFP. L'espressione di GFP e GFP-CAEB è stata verificata mediante analisi immunoblot. L'immunoblot rappresentante (figura 4A) dimostra espressione stabile e chiaramente rilevabile di GFP e GFP-CAEB. Tuttavia, questo test non è in grado di determinare se tutte le cellu...

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Discussion

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Molti batteri patogeni porto sistemi di secrezione di secernere o traslocare proteine ​​effettrici batteriche nella cellula ospite. Queste proteine ​​effettrici hanno la capacità di modulare i processi e percorsi nella cellula ospite, permettendo ai batteri di sopravvivere e replicare quanto di rispettiva nicchia intracellulare. Comprendere le attività biochimiche e dei meccanismi molecolari delle proteine ​​effettrici contribuirà ad una migliore comprensione di patogenicità e può aiutare a sviluppare nuovi strumenti te...

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) attraverso la Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) ad A.L. e C.B., e attraverso l'ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMlife technologies31966-021
FCSBiochromS0115
Pen/Streplife technologies15140-122
OptiMEMlife technologies51985
X-tremeGENE 9Roche6365752001
GeneticinRothCP11.3
PolietileniminaPoliscieni23966
DoxiciclinaSigma AldrichD9891
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad170-3940
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Scientific26616
MembranaPVDFMilliporeIPVH00010
anti-GFP life technologiesA6455
anti-scissione PARPBD Bioscience611038
anti-actinaSigma AldrichA2066
IgG di topo (H+L)-HRPODianova111-035-062
IgG di coniglio (H+L)-HRPODianova111-035-045
Substrato di blotting occidentale ECLThermo Scientific32106
Tampone di strippaggio Western Blot Restore PlusThermo Scientific46428

References

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